苯并芘與肽聚糖體外協(xié)同刺激人皮脂腺細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及其意義

侯霄梟 曹 珂 胡婷婷 潘展硯 Christos C. Zouboulis 鞠 強(qiáng)

環(huán)境污染不但參與變態(tài)反應(yīng)性皮膚病、皮膚腫瘤、皮膚老化等皮膚疾病發(fā)生，與痤瘡之間也存在密切關(guān)聯(lián)[1]。環(huán)境污染物二噁英誘導(dǎo)氯痤瘡發(fā)生[2],吸煙可以引起的“吸煙者痤瘡”[3]，最近也報(bào)道了北京大氣污染可以增加尋常痤瘡患者門診就診率[4]。但環(huán)境污染物誘發(fā)或者加重痤瘡的機(jī)制目前仍有待探索。

痤瘡是毛囊皮脂腺單位慢性炎癥性疾病，毛囊內(nèi)微生物如痤瘡丙酸桿菌激活天然免疫Toll樣受體2(TLR2)并導(dǎo)致促炎癥因子尤其是IL-1α釋放及隨后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生是痤瘡的重要啟動(dòng)和加重因素[5]，環(huán)境污染物中的主要成分如二噁英、多環(huán)芳香烴類化合物(PAHs)等通過芳香烴受體(AHR)影響人體健康。近年來在呼吸系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染物介導(dǎo)的AHR和微生物誘導(dǎo)的TLRs之間存在協(xié)同作用，誘導(dǎo)炎癥因子生成，參與呼吸道或者胃腸道炎癥性疾病發(fā)生[6,7]。皮膚是保護(hù)人體與外界環(huán)境的屏障，毛囊中含有痤瘡丙酸桿菌等大量微生物，我們推測(cè)環(huán)境污染物可能與毛囊內(nèi)的微生物之間存在類似腸道與呼吸道的協(xié)同作用機(jī)制。因此我們體外研究環(huán)境污染物如PM2.5或者香煙中的主要代表性PAHs苯并芘體外和革蘭氏陽性菌細(xì)菌壁成分肽聚糖(PGN)對(duì)SZ95人皮脂腺細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，探討環(huán)境污染物誘導(dǎo)或加重痤瘡的發(fā)生機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)器材與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備與儀器 PGN(金黃色葡萄球細(xì)胞壁提取物，SigmaAldrich，美國)混懸于工作培養(yǎng)基中配置為2 mg/mL，分裝后-20℃?zhèn)溆茫褂脮r(shí)稀釋為工作濃度20 μg/mL，苯并芘(SigmaAldrich，美國)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，配制成10-2mol/L，分裝后-20℃?zhèn)溆茫褂脮r(shí)用工作培養(yǎng)基配制至工作濃度10-5M/L，控制DMSO濃度≤1‰。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SZ95人皮脂腺細(xì)胞由德國Dessau臨床醫(yī)學(xué)中心皮膚科Zouboulis CC教授饋贈(zèng)，傳代在30-40代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)于Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長因子、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，每2天更換培養(yǎng)液1次。工作時(shí)新鮮配制工作培養(yǎng)基，添加2%胎牛血清，余同上。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)IL-1α,IL-1β及TNF-α mRNA表達(dá)的變化 細(xì)胞接種于(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)24孔板，復(fù)3孔，次日加入PGN和苯并芘至工作濃度，0.1% DMSO作為對(duì)照組。作用2 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，Trizol提取試劑提取總RNA，使用TAKARA試劑盒按照說明書獲得cDNA，檢測(cè)基因及引物序列見表1。設(shè)置GAPDH對(duì)照。RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；之后95℃變性，每次5 s，60℃退火30 s，循環(huán)45次，于60℃時(shí)收集數(shù)據(jù)。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算： ΔCT=CT目的基因-CTGAPDH，-ΔΔCT=ΔCTGAPDH-ΔCT目的基因， RQ(相對(duì)表達(dá)量)目的基因=2-ΔΔCT。

表1 基因及引物序列

1.4 ELISA法檢測(cè)IL-1α,IL-1β及TNF-α的釋放 SZ95細(xì)胞接種于24孔板中(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)，次日PBS清洗后加入PGN,苯并芘至工作濃度，復(fù)3孔，0.1% DMSO作為對(duì)照組，24 h后收集細(xì)胞上清，4°C 3000 rpm離心后收集上清分裝后-20°C存放待檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，按照IL-1α,IL-1β及TNF-α的ELISA試劑盒說明書操作分別進(jìn)行操作，并設(shè)定空白對(duì)照孔，450 nm酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)數(shù)值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性公式，然后根據(jù)線性公式計(jì)算出相應(yīng)的樣本濃度，將計(jì)算出的樣本濃度與對(duì)照組比較，觀察其變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組數(shù)據(jù)獨(dú)立重復(fù)三次以上，采用Prism GraphPad(La Jolla, CA, USA)進(jìn)行雙因采方差統(tǒng)計(jì)分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001 ，采用Graphpad軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 PGN和苯并芘體外對(duì)皮脂腺細(xì)胞IL-1α分泌的影響 PGN刺激SZ95皮脂腺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1α mRNA及蛋白的表達(dá)明顯增加(圖1a,b)；苯并芘單獨(dú)作用于皮脂腺細(xì)胞可見IL-1α mRNA的表達(dá)沒有明顯增加(圖1a)，但其蛋白表達(dá)卻明顯上升(相較于空白對(duì)照組P<0.001)；而PGN和苯并芘聯(lián)合刺激時(shí)發(fā)現(xiàn)苯并芘能協(xié)同增強(qiáng)PGN刺激皮脂腺細(xì)胞IL-1α的表達(dá)，與PGN單獨(dú)作用組相比,mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.0001)表達(dá)均明顯增加(圖1a,b)。

2.2 PGN和苯并芘體外對(duì)皮脂腺細(xì)胞IL-1β分泌的影響 使用PGN刺激SZ95皮脂腺細(xì)胞，IL-1β mRNA (P<0.001)及蛋白(P<0.01)的表達(dá)增加；苯并芘單獨(dú)作用于皮脂腺細(xì)胞可見IL-1β mRNA的表達(dá)沒有明顯增加但其蛋白表達(dá)有所增加(P<0.05)；同樣，苯并芘的加入可以顯著增強(qiáng)PGN誘導(dǎo)皮脂腺細(xì)胞IL-1β mRNA 和蛋白的表達(dá)(圖2a,b)。

2.3 PGN和苯并芘對(duì)皮脂腺細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響 使用PGN刺激SZ95皮脂腺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α mRNA(P<0.0001) 及蛋白(P<0.01)表達(dá)大量增加；苯并芘單獨(dú)刺激皮脂腺細(xì)胞不能誘導(dǎo)TNF-α mRNA的表達(dá)增加但TNF-α蛋白表達(dá)卻增加(P<0.01)；當(dāng)用PGN和苯并芘聯(lián)合刺激皮脂腺細(xì)胞時(shí)，TNF-α mRNA(圖3a)的表達(dá)在PGN組和PGN+苯并芘組中沒有明顯差異。而PGN+苯并芘組中TNF-α蛋白的表達(dá)卻明顯高PGN單獨(dú)作用組(圖3b)。

圖1 PGN和苯并芘體外對(duì)人SZ95皮脂腺細(xì)胞IL-1α分泌的影響：a: mRNA表達(dá)；b:蛋白表達(dá)圖2 PGN和苯并芘體外對(duì)人SZ95皮脂腺細(xì)胞IL-1β分泌的影響：a:mRNA表達(dá)；b:蛋白表達(dá)

圖3 PGN和苯并芘體外對(duì)人SZ95皮脂腺細(xì)胞TNF-α分泌的影響：a:mRNA表達(dá)；b:蛋白表達(dá)

3 討論

氯痤瘡、油痤瘡、及吸煙者痤瘡等痤瘡亞型均證實(shí)了環(huán)境污染物與痤瘡之間存在密切的關(guān)聯(lián)。對(duì)于這些亞型機(jī)制的研究集中于環(huán)境污染物對(duì)毛囊干細(xì)胞分化紊亂上，二噁英誘導(dǎo)的氯痤瘡、煤焦油誘導(dǎo)的油痤瘡及香煙中苯并芘都是芳香烴受體(AhR)的配體。AhR被激活后，皮脂腺細(xì)胞的增殖、生長周期、凋亡、脂質(zhì)合成等生物學(xué)功能發(fā)生改變，近年來先后發(fā)現(xiàn)二噁英和苯并芘都可能通過AhR信號(hào)通路誘導(dǎo)人皮脂腺細(xì)胞的異常分化[8,9]。苯并芘誘導(dǎo)皮脂腺細(xì)胞AhR依賴性產(chǎn)生炎癥因子IL-6[9]。但環(huán)境污染物是否對(duì)尋常痤瘡產(chǎn)生影響的研究較少。最近有研究報(bào)道北京大氣污染物中的NO2, PM10和PM2.5濃度與皮脂分泌量、痤瘡皮損數(shù)目及皮膚科痤瘡患者門診就診率相關(guān)[4]，顯示環(huán)境污染可能在尋常痤瘡發(fā)病中起到重要作用。

痤瘡的炎癥反應(yīng)是痤瘡發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)，促炎癥因子IL-1 α等表達(dá)增加不僅能導(dǎo)致毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化過度，也能夠誘導(dǎo)級(jí)聯(lián)產(chǎn)生更多的炎癥因子如IL-6、TNF-α及GM-CSF[5,10]。痤瘡丙酸桿菌是導(dǎo)致痤瘡炎癥發(fā)生的重要因素之一，PGN是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)菌壁，參與痤瘡發(fā)生并常被用于體外痤瘡炎癥模型刺激物。本研究采用PGN刺激皮脂腺細(xì)胞構(gòu)建皮脂腺細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)PGN對(duì)皮脂腺細(xì)胞有明顯的促炎作用，分泌IL-1α，IL-1β,TNF-α等炎癥因子，并在代表性環(huán)境污染物AhR配體苯并芘的協(xié)同作用下，炎癥因子出現(xiàn)協(xié)同性增加，說明環(huán)境污染物可能加重了PGN誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這可能是痤瘡發(fā)生或者加重的因素之一，AhR通路在腸道與呼吸道等研究上都證實(shí)了與TLR之間存在交聯(lián)[11,12],因此我們推測(cè)苯并芘可能是作用于TLR2信號(hào)通路中的某一個(gè)靶位，進(jìn)而增強(qiáng)PGN對(duì)TLR2信號(hào)通路的刺激。

總之，我們初步的研究顯示環(huán)境污染物苯并芘與PGN協(xié)同刺激誘導(dǎo)了人皮脂腺細(xì)胞炎癥因子的釋放，顯示污染物可能會(huì)通過增強(qiáng)或者誘發(fā)痤瘡的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致病程的加重。但苯并芘和PGN協(xié)同刺激皮脂腺細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的具體分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

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