肺泡灌洗液GM試驗(yàn)對(duì)肺部侵襲性曲霉菌感染的診斷價(jià)值

單宇+劉軍權(quán)+祝宇翀

[摘要] 目的 分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）半乳甘露聚糖（GM）試驗(yàn)結(jié)果與侵襲性肺曲霉菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果間的相關(guān)性。 方法 收集2014年1月～2016年12月浙江省650家醫(yī)療合作點(diǎn)（包括三級(jí)、二級(jí)和社區(qū)醫(yī)院）8086例患有呼吸系統(tǒng)疾病住院患者的BALF，同時(shí)采集1459例患者血清；采用GM試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)BALF和血清樣本進(jìn)行GM試驗(yàn)，通過(guò)觀察GM試驗(yàn)的I值結(jié)果分析對(duì)侵襲性肺曲霉菌?。↖PA）的診斷價(jià)值及BALF結(jié)果分析IPA診斷符合率。用沙保弱培養(yǎng)基按常規(guī)方法進(jìn)行真菌培養(yǎng)。曲霉菌鑒定：培養(yǎng)陽(yáng)性的真菌經(jīng)KOH制片，在顯微鏡下觀察形態(tài)和顏色區(qū)分曲霉菌。 結(jié)果 8086例BALF曲霉菌培養(yǎng)陽(yáng)性樣本數(shù)為1193例。在曲霉菌陽(yáng)性BALF樣本中，GM試驗(yàn)I值<0.5為61例（5.11%）、0.5～<1.0為98例（8.21%）、1.0～<2.1為114例（9.56%）和≥2.1的為920例（77.12%），而無(wú)真菌生長(zhǎng)組共5103例，I值<0.5為3623例（70.99%）、0.5～<1.0為827例（16.21%）、1.0～<2.1為376例（7.37%）和≥2.1為277例（5.43%），兩組各I值比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；曲霉菌陽(yáng)性組與念珠菌陽(yáng)性組平均I值比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。BALF GM試驗(yàn)I值與IPA診斷符合率分析：當(dāng)I值設(shè)定為≥2.1，對(duì)IPA診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為77.12%、94.07%、76.86%及76.85%，與I值設(shè)定≥0.5為陽(yáng)性的診斷效能（分別為94.89%、9.00%、43.34%及43.34%）比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。血清GM試驗(yàn)結(jié)果顯示，曲霉菌陽(yáng)性組I值≥0.5占30.63%，而無(wú)真菌生長(zhǎng)組僅為6.55%，兩者比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 將GM試驗(yàn)BALF的I值設(shè)定為≥2.1為陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)IPA更具診斷價(jià)值，而血清GM試驗(yàn)I值設(shè)定為≥0.5較合適。

[關(guān)鍵詞] 曲霉菌；肺泡灌洗液；半乳甘露聚糖；真菌鑒定

[中圖分類(lèi)號(hào)] R519 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（a）-0118-05

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the results of galacto-mannan （GM） test in bronchoalveolar fluid （BALF） and the positive results of invasive pulmonary aspergillus. Methods From January 2014 to December 2016， 8086 BALF and 1459 serum from patients with respiratory disease in 650 cooperative medical institutions （including tertiary， secondary and community hospitals） in Zhejiang Province were collected. By using the GM test kits to carry out GM experiments in BALF and serum samples according to the instructions of the kit， the diagnostic value of the invasive pulmonary aspergillosis （IPA） was analyzed by the results of the I value， the IPA diagnosis compliance rate was analyzed with BALF results. Fungal culture was carried out in a conventional manner by using sand-fortified medium. Aspergillus identification： the fungal from the positive samples were cultured， so they could be subjected to 10% KOH based smear before microscopic observation， and then the Aspergillus were differentiated by their morphology and color. Results There were 1193 Aspergillus positive specimens among these 8086 BALF samples. In the Aspergillus positive samples， according to the results of I value of GM test： <0.5 for 61 cases （5.11%）， 0.5 to 1 for 98 （8.21%）， 1.1-2.0 for 164 （9.56%） and >2.1 for 870 （77.12%）； and in 5103 cases which had no fungal growth， the results of I value of GM test was： <0.5 for 3623 cases （70.99%）， 0.5-1 for 827 cases （16.21%）， 1.1-2.0 for 376 cases （7.37%） and >2.1 for 277 cases. There was a significant difference between these two groups （P < 0.01）. There also was a significant difference between the Aspergillus positive group and the Candida positive group （P < 0.01）. The analysis of I value of GM test in BALF and invasive pulmonary aspergillosis （IPA） diagnostic coincidence rate： When the I value was set to ≥2.1， the sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of IPA diagnosis were as follows： 77.12% 94.57%， 76.86% and 76.85%， the differences were statistically significant （P < 0.01）； with the analysis thatwhen I value was set to be≥0.5 for positive results （94.89%， 9.00%， 43.34% and 43.34%， respectively）. The results of GM test in serum showed that the I value of the Aspergillus positive group was 0.5.63%， and the growth without fungal was only 6.54%， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion When the I value is set to ≥2.1， the result of the GM test in BALF is significantly more valuable. When the I value isset to ≥0.5， the I value of GM test in serumis more appropriate.endprint

[Key words] Aspergillus； Bronchoalveolar lavage fluid； Galactomannan； Fungal identification

曲霉菌是侵襲性肺真菌感染（invasive fungal infections，IFI）最為常見(jiàn)的病原菌之一[1-2]，曲霉菌感染引起的侵襲性肺曲霉菌?。╥nvasive pulmonary aspergillosis，IPA）也是肺侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）的主要種類(lèi)。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）測(cè)定是曲霉菌感染檢測(cè)的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。許多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，應(yīng)用BALF進(jìn)行GM試驗(yàn)?zāi)転镮FI的診療提供有價(jià)值的臨床診斷依據(jù)。由于GM試驗(yàn)試劑盒應(yīng)用說(shuō)明大多局限于血清樣本，在《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版中將支氣管肺泡灌洗液等體液標(biāo)本檢測(cè)的GM試驗(yàn)I值≥0.5判斷為陽(yáng)性。由于BALF和其他血清標(biāo)本來(lái)源和性質(zhì)的不同，結(jié)果判斷存在很大差異。為此，我們對(duì)8086例BALF的GM試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回顧性總結(jié)，提出BALF的GM試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果判斷范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年12月送杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測(cè)的8086例患有呼吸系統(tǒng)疾病、具有完整臨床資料、臨床疑診真菌感染患者的BALF，其中男5394例，女2692例；年齡61～86歲，中位年齡72歲。在收集BALF同時(shí)，采集患者血清（實(shí)際僅采集到1459例）。BALF和血清樣本來(lái)源于浙江省650家醫(yī)療合作點(diǎn)（包括三級(jí)、二級(jí)和社區(qū)醫(yī)院）的住院患者，樣本由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院醫(yī)師或護(hù)士采集。采樣完成后由杭州金域物流人員上門(mén)收取，放置于標(biāo)本運(yùn)輸箱中，4℃冷鏈運(yùn)輸。經(jīng)物流當(dāng)日送達(dá)杭州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，統(tǒng)一由金域檢驗(yàn)技術(shù)人員在樣本采集后48 h內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行GM試驗(yàn)和BALF真菌培養(yǎng)。

1.2 儀器和試劑

沙保培養(yǎng)基（廣州迪景微生物科技有限公司）；曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法，96人份/盒，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品）；Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）；Bio-rad洗板機(jī)（美國(guó)伯樂(lè)）；JW-3022HR高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；ZW-A微量振蕩儀（常州高德儀器制造有限公司產(chǎn)品）；生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 IPA判定

侵襲性肺部曲霉菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲癌癥研究治療組織和真菌病研究組（EOR-TC/MSG）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]和我國(guó)制定的《肺真菌病診斷和治療專(zhuān)家共識(shí)》[6]及《侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則》[7]等有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，需同時(shí)符合宿主因素、臨床標(biāo)準(zhǔn)和微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)3個(gè)方面。本研究根據(jù)已檢樣本結(jié)果和患者住院期間病歷、患者臨床癥狀體征、影像及微生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為IPA診斷依據(jù)。

1.4 樣本采集方法

1.4.1 BALF采集 BALF采集按氣管鏡操作SOP進(jìn)行，選用2%利多卡因進(jìn)行麻醉，局麻后經(jīng)鼻行支氣管鏡檢測(cè)，依HRCT定位將支氣管鏡插入至目標(biāo)亞段支氣管，注入37℃滅菌生理鹽水30～60 mL，進(jìn)行病變部位的支氣管肺泡灌洗，回收15～30 mL BALF，將回收液裝入硅塑瓶中，4℃保存。

1.4.2 血清標(biāo)本 行支氣管鏡采集BALF當(dāng)日早晨使用真空采血管采集非抗凝血3 mL，4000 r/min離心10 min，4℃冰箱保存等待檢測(cè)。

1.5 GM 試驗(yàn)

1.5.1 BALF標(biāo)本的檢測(cè) 將待測(cè)BALF轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管，10 000 r/min 離心10 min，取離心后BALF上清液300 μL加入100 μL處理液混勻，100 ℃水浴3 min。10 000 r/min離心10 min，取上清備用。ELISA 檢測(cè)孔每孔加入50 μL結(jié)合液、50 μL處理后上清液，37℃孵育90 min。清洗后，每孔加入375 μL清洗液，吸干；每孔加入顯色液200 μL，室溫避光孵育30 min后，每孔加入終止液100 μL。在波長(zhǎng)450 nm酶標(biāo)儀下讀板，根據(jù)OD值換算檢測(cè)BALF中GM含量。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、臨界值對(duì)照，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。結(jié)果計(jì)算：樣本指數(shù)（I值）=樣本OD值/2個(gè)臨界樣本平均OD值。

1.5.2 血清標(biāo)本的檢測(cè) 試驗(yàn)嚴(yán)格按照GM試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟如下：取待測(cè)血清300 μL加入100 μL處理液混勻，100℃水浴3 min。10 000 r/min離心10 min，取上清備用。ELISA 檢測(cè)孔每孔加入50 μL結(jié)合液、50 μL處理后上清液，37℃孵育90 min。清洗后，每孔加入375 μL清洗液，吸干；每孔加入顯色液200 μL，室溫避光孵育30 min后每孔加入終止液100 μL；在波長(zhǎng)450 nm酶標(biāo)儀下讀板，根據(jù)OD值換算檢測(cè)血清中GM含量。結(jié)果換算方法同BALF樣本。

1.6 真菌培養(yǎng)

用紅外線(xiàn)加熱器滅菌接種針/環(huán)，用接種環(huán)沾取BALF 10 μL，接種于沙保弱培養(yǎng)基中，放置恒溫（27±1）℃培養(yǎng)。某些雙相真菌需要同時(shí)放置37℃培養(yǎng)，分別于24 h、48 h和72 h觀察，如果有真菌生長(zhǎng)使用梅里埃生化鑒定板和顯微鏡法直接鑒定。如果無(wú)真菌生長(zhǎng)繼續(xù)培養(yǎng)至5～7 d，對(duì)于高度懷疑真菌感染患者標(biāo)本，或懷疑某些生長(zhǎng)較慢真菌時(shí)培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)至2～4周，每周觀察，4周后無(wú)真菌生長(zhǎng)報(bào)陰性。

1.7 曲霉菌屬直接鑒定

按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版“真菌常規(guī)制片鑒定”要求，將培養(yǎng)陽(yáng)性的真菌用KOH制片，直接在顯微鏡下觀察，通常曲霉菌為菌體45°角分支，直徑在3～6 μm。曲霉菌屬鑒定按形態(tài)學(xué)特征、菌落形態(tài)和分生孢子顏色進(jìn)行群的劃分，然后以分生孢子的形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的數(shù)目、頂囊的形態(tài)及有性孢子的形態(tài)進(jìn)行菌種鑒定。endprint

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，按照廠家推薦標(biāo)準(zhǔn)，BALF和血清GM試驗(yàn)以待測(cè)標(biāo)本的指數(shù)（I）≥0.5為診斷界值。采用四格表χ2檢驗(yàn)分析GM試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值的差異，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF GM試驗(yàn)I值與真菌培養(yǎng)結(jié)果比較

8086例BALF曲霉菌培養(yǎng)陽(yáng)性樣本數(shù)為1193例。在曲霉菌陽(yáng)性BALF樣本中，I值≥2.1為920例（77.12%），而無(wú)真菌生長(zhǎng)組≥2.1為277例（5.43%），兩者結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；曲霉菌陽(yáng)性組與念珠菌陽(yáng)性組平均I值組間結(jié)果比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。曲霉菌陽(yáng)性組I值大多≥2.1（占77.12%），而無(wú)真菌生長(zhǎng)組為（5.43%），說(shuō)明BALF的GM試驗(yàn)曲霉菌真陽(yáng)性結(jié)果的敏感I值為2.1以上。見(jiàn)表1。

2.2 BALF GM試驗(yàn)I值與IPA診斷符合率分析

為觀察GM檢測(cè)對(duì)IPA診斷的靈敏度，將GM試驗(yàn)比色后換算的I值分別進(jìn)行分組（≥0.5、≥1.1、≥2.1）比對(duì)。結(jié)果提示：當(dāng)I值設(shè)定為≥2.1，對(duì)IPA診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值與I值設(shè)定≥0.5者比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 血清GM試驗(yàn)I值與真菌培養(yǎng)結(jié)果比較

與BALF同時(shí)送檢的血清樣本（同一患者同時(shí)采樣）有1459例，血清經(jīng)真菌培養(yǎng)陽(yáng)性的樣本有680例，其中曲霉菌陽(yáng)性組為333例，其中I值<0.5為231例（69.37%）、0.5～<1.0為29例（8.71%）、1.0～<2.1為31例（9.31%）和≥2.1為42例（12.61%），與念珠菌陽(yáng)性組及無(wú)真菌生長(zhǎng)組相同I值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），以無(wú)真菌生長(zhǎng)組差異最明顯。I值為1.0～<2.1、≥2.1時(shí)，念珠菌陽(yáng)性組與無(wú)真菌生長(zhǎng)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。曲霉菌陽(yáng)性組GM試驗(yàn)的I值0.5及以上者占30.63%，而無(wú)真菌生長(zhǎng)組僅為6.55%，提示血清GM試驗(yàn)曲霉菌的真陽(yáng)性結(jié)果的敏感值為0.5及以上。見(jiàn)表3。

3 討論

IFD是宿主免疫功能低下或缺陷時(shí)真菌侵入人體，在器官、組織或血液中生長(zhǎng)，并導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)和組織損傷等所致[8-10]。IFI指真菌感染氣管、支氣管和肺部組織，引起黏膜和肺部炎癥，造成急慢性肺組織損害的疾病，臨床IFI感染常見(jiàn)于白色念珠菌、曲霉菌屬等。IPA常見(jiàn)于老年患者，本研究統(tǒng)計(jì)分析的BALF標(biāo)本均來(lái)自60歲以上的老年人。老年人免疫力低下，是肺部IFI的高發(fā)人群，且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，常導(dǎo)致患者漏診、誤診、診斷不及時(shí)從而延誤疾病的治療而增加死亡率[11-13]。侵襲性曲霉菌菌感染的治療依賴(lài)早期的診斷和用藥，但臨床上診斷系統(tǒng)性曲霉感染經(jīng)常遇到困難，病情缺乏特異的臨床表現(xiàn)，很多患者死亡后經(jīng)尸檢才能發(fā)現(xiàn)存在曲霉菌感染。

β半乳甘露聚糖廣泛分布于曲霉菌細(xì)胞壁中，是除隱球酵母和接合菌屬外為曲霉菌特有的細(xì)胞成分，曲霉菌生長(zhǎng)時(shí)半乳甘露聚糖從薄弱的菌絲頂端釋放，當(dāng)這些成分進(jìn)入人體血液或深部組織、被吞噬細(xì)胞吞噬消化后，半乳甘露聚糖從細(xì)胞壁中釋出。因此，對(duì)GM測(cè)定是曲霉菌感染的敏感指標(biāo)[14-15]。GM試驗(yàn)常用的標(biāo)本有血清和BALF。BALF是通過(guò)纖維支氣管鏡向支氣管肺泡內(nèi)注入生理鹽水，隨即抽吸獲取肺泡表面襯液，對(duì)其中的細(xì)胞成分和可溶性成分進(jìn)行分析，該項(xiàng)技術(shù)已成為診斷肺部疾病的重要檢查手段。GM值作為檢測(cè)曲霉菌細(xì)胞壁半乳甘露聚糖陰陽(yáng)性的早期檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，在檢測(cè)率、檢測(cè)時(shí)間等方面的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用效果均高于影像檢查方法和生物學(xué)檢查結(jié)果。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的BALF樣本GM試驗(yàn)的cut-off值，且按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第四版）確定BALF樣本GM樣本指數(shù)≥0.5為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)在臨床診斷中存在特異性不高的缺點(diǎn)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BALF 的GM試驗(yàn)陽(yáng)性率顯著高于血清，其樣本指數(shù)（I）值也明顯高于血清結(jié)果，在I值≤2.1時(shí)準(zhǔn)確性差。為此本研究回顧性總結(jié)8086例BALF的GM試驗(yàn)結(jié)果，并與真菌培養(yǎng)及臨床診斷進(jìn)行對(duì)比和綜合分析，為GM試驗(yàn)樣本指數(shù)I值設(shè)定一則比較切合實(shí)際的域值。

本研究8086例BALF樣本中真菌培養(yǎng)曲霉菌陽(yáng)性有1193例，其中GM陽(yáng)性（設(shè)定指數(shù)I值≥2.1）有920例，占曲霉菌陽(yáng)性占總檢測(cè)數(shù)的77.12%，相同域值的念珠菌陽(yáng)性組和無(wú)真菌生長(zhǎng)組分別為16.26%和5.43%； BALF GM的 I值在0.5～<2.1的樣本中曲霉菌培養(yǎng)陽(yáng)性組只占總樣本數(shù)的17.77%，而念珠菌陽(yáng)性組和無(wú)真菌生長(zhǎng)組為31.45%和23.58%。這些數(shù)據(jù)提示，當(dāng)BALF GM試驗(yàn)的I值設(shè)定為≥2.1時(shí)，其對(duì)IPD診斷的特異性、真實(shí)性顯著增高；設(shè)定的I值在<2.1時(shí)曲霉菌陽(yáng)性組的GM試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性率反而顯著低于其他組，說(shuō)明該值對(duì)IPD的診斷特異性、靈敏性和真實(shí)性較低。因而，筆者建議將BALF GM試驗(yàn)陽(yáng)性值設(shè)定為≥2.1，0.5～<2.1設(shè)定為可疑。在本研究統(tǒng)計(jì)的BALF樣本中，有部分真菌培養(yǎng)陰性但GM試驗(yàn)I值明顯升高而出現(xiàn)假陽(yáng)性，可能原因是BALF樣本與外界空氣環(huán)境為開(kāi)放性，使一些青霉菌、曲霉菌污染樣本，或某些外抗原與GM試驗(yàn)有交叉反應(yīng)導(dǎo)致 GM 實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)假陽(yáng)性。

綜上所述，如果將BALF的GM試驗(yàn)結(jié)果I值設(shè)定≥2.1時(shí)能提高IPA診斷的特異性（94.07%），但敏感性有所下降（77.12%），如果對(duì)某些I值較低但臨床癥狀較典型患者增加曲霉菌靶向線(xiàn)粒體和核糖體靶標(biāo)的PCR檢測(cè)[17-18]將能彌補(bǔ)單一試驗(yàn)的缺陷，提高IPA診斷的敏感性。有報(bào)道[19]認(rèn)為，增加曲霉菌PCR的檢測(cè)內(nèi)容，可以使IPD診斷結(jié)果靈敏度達(dá)到99%、特異性增加至98%，這些方法的聯(lián)合使用可為IPD的診斷提供更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。endprint