骨橋蛋白與腎結(jié)石形成機制的研究進展

夏煜琦+程帆+袁潤

[摘要] 骨橋蛋白（OPN）為泌尿系結(jié)石基質(zhì)主要有機成分之一，在腎結(jié)石患者及動物模型腎組織內(nèi)含量明顯增高。在腎結(jié)石形成各階段包括晶體黏附、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等過程中扮演關(guān)鍵角色。OPN大量表達將導(dǎo)致晶體沉積，結(jié)石形成，最終造成腎臟細胞損傷?？筄PN抗體、抗氧化物及凋亡通路抑制劑能顯著減輕OPN介導(dǎo)的結(jié)石形成。本綜述旨在討論近年來骨橋蛋白在腎結(jié)石形成機制中的新進展以及針對OPN的新的結(jié)石預(yù)防治療靶點。

[關(guān)鍵詞] 骨橋蛋白；晶體黏附；氧化應(yīng)激；細胞凋亡；腎結(jié)石

[中圖分類號] R692.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0045-04

[Abstract] OPN is one of the main components of the organic phase of stone， which is highly expressed in the renal tissue of the kidney stones patients and animal stone models， and plays an important role in the process of crystal aggregation and adhesion， oxidative stress of renal tubular epithelial cells and apoptosis. A large amount of OPN expression will lead to crystal deposition， stone formation， resulting in kidney cell damage. OPN antibodies， antioxidants and apoptotic pathway inhibitors can significantly reduce OPN mediated stone formation. This review aims to discuss recent advances of the role of osteopontin in the formation of kidney stones and the new stone prevention and treatment target for OPN.

[Key words] Osteopontin； Crystal adhesion； Oxidative stress； Apoptosis； Kidney stone

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，流行病學(xué)研究顯示，腎結(jié)石的患病率及發(fā)病率逐年遞增[1]，在我國，患病率為0.12%～6.02%[2]。同時，由于結(jié)石病易復(fù)發(fā)，并發(fā)癥多，已成為很多患者嚴重的負擔(dān)。目前腎結(jié)石的形成機制仍舊不清楚，傳統(tǒng)觀點認為腎結(jié)石的形成過程包括尿液過飽和、晶體核心形成、晶體成長及聚集，然而目前越來越多的研究者強調(diào)腎小管上皮細胞與結(jié)石晶體間的相互影響[3]。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是草酸鈣結(jié)石基質(zhì)的重要成分[4]，可能通過促進晶體黏附及介導(dǎo)氧化應(yīng)激、細胞凋亡促進結(jié)石的形成[5]。對OPN與腎結(jié)石形成機制的研究，有助于為腎結(jié)石尋找新的預(yù)防及治療靶點。

1 OPN研究現(xiàn)狀

1.1 OPN概述

骨橋蛋白又被稱為分泌性磷蛋白-1（secreted phosphoprotein-1，SSP1），是小整合素結(jié)合配體N連接的糖蛋白家族的一員[6]，為分子量34 kDa帶負電荷的磷酸化糖蛋白[4]。OPN的生物學(xué)活性取決于三個特異性結(jié)構(gòu)，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD，氨基酸159-161）序列，凝血酶裂解位點（Arg168-Ser169）及鈣離子結(jié)合位點（氨基酸86-95）[7-8]。RGD序列通過整合素，參與晶體黏附于上皮細胞、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[7]。OPN被凝血酶裂解后，隱藏的整合素連接位點162SVVYGLR168暴露，促進與整合素的連接[8]。鈣離子結(jié)合位點具有10個天冬氨酸（Asp）殘基，參與鈣化過程。

1.2 OPN主要功能

OPN廣泛分布于膽囊、尿路、消化道、肺和乳房等組織以及乳汁、膽汁、尿液等體液內(nèi)。樹突樣細胞，巨噬細胞，大腦及腎臟組織都可以分泌OPN。腎臟內(nèi)OPN于遠端小管以及集合管內(nèi)生成[9]。OPN在調(diào)節(jié)細胞基質(zhì)重構(gòu)、組織鈣化、單核-巨噬細胞遷徙趨化、促炎細胞因子的釋放及細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，同時也與一系列病理生理過程相關(guān)，例如惡性腫瘤、胰島素抵抗、骨質(zhì)疏松、泌尿系結(jié)石等[10]。

2 OPN與腎結(jié)石

2.1 OPN與成石物質(zhì)

結(jié)石為無機相及有機相混合形成，其中有機相占干重約5%[11]。由于結(jié)石不可能在快速流動的尿液中形成，很多研究者認為，結(jié)石是在黏附于腎臟組織的過程中形成并生長的，這些生長相關(guān)的有機成分來源于腎臟組織。對結(jié)石成分分析發(fā)現(xiàn)，OPN作為有機相存在于草酸鈣及磷酸鈣結(jié)石內(nèi)，并且是結(jié)石有機成分中含量最為豐富的蛋白之一[4]。腎結(jié)石晶體沉積發(fā)生于腎乳頭鈣斑（randall plaques，RPs），Taguchi等[12]利用免疫組織化學(xué)透射電鏡，在結(jié)石患者腎臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)，RPs內(nèi)OPN水平及分布也顯著高于正常腎組織。然而，對正常人及腎結(jié)石患者尿液進行光譜質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，OPN在正常人及結(jié)石患者尿液中含量并沒有明顯差異[13]。

2.2 OPN表達與腎結(jié)石

OPN作為腎結(jié)石基質(zhì)的重要成分，在晶體形成中擔(dān)任關(guān)鍵角色。在乙二醇誘導(dǎo)的草酸鈣結(jié)石動物模型腎臟組織中，OPN在mRNA及蛋白水平顯著升高，同時造成腎臟損傷，肌酐清除率下降[14]。Tsuji等[15]，使用siRNA沉默SD大鼠OPN基因發(fā)現(xiàn)，OPN下調(diào)時，腎臟內(nèi)草酸鈣晶體沉積明顯減少。大量細胞試驗及動物試驗證明，在結(jié)石產(chǎn)生過程中，OPN高表達，并促進結(jié)石形成[9，16]。endprint

然而，也有研究者認為，OPN為腎臟鈣質(zhì)沉著及結(jié)石形成的有效抑制劑。Mo等[17]，將OPN基因敲除小鼠與野生型對比發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠腎乳頭間質(zhì)磷酸鈣沉積更多。將小鼠尿液，一水草酸鈣晶體及狗腎小管細胞系（MDCK）混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在OPN敲除基因小鼠的尿液中培養(yǎng)的細胞系，晶體與上皮細胞黏附明顯增加。

關(guān)于OPN作用的爭論，可能是由OPN的結(jié)合/游離狀態(tài)不同而導(dǎo)致，游離OPN能抑制晶體核心形成、晶體成長和聚集[18]，然而，由于骨橋蛋白的強陰離子活性，它與鈣離子之間有強大的結(jié)合力，導(dǎo)致游離的骨橋蛋白在體內(nèi)很少見[19]。而結(jié)合骨橋蛋白為晶體聚集以及黏附的促進劑。因此，可能是某些因素影響了OPN與鈣離子/草酸根離子結(jié)合，進而改變游離OPN與結(jié)合OPN間的比例，影響結(jié)石晶體形成，從而產(chǎn)生了對OPN作用的矛盾結(jié)論。

2.3 OPN與晶體黏附

OPN作為細胞外基質(zhì)的主要成分，參與鈣鹽晶體形成，并介導(dǎo)晶體黏附于腎小管上皮細胞。Kumar等[20]對24位結(jié)石病患者與正常人尿液離心、超濾及再處理，發(fā)現(xiàn)OPN包繞的晶體黏附能力顯著增強。Hirose等[21]觀察腎小管上皮細胞在結(jié)石形成早期的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)腎小管細胞損傷后，以O(shè)PN為核心物的晶體在腎臟皮質(zhì)髓質(zhì)連接處黏附于上皮細胞。此外，在OPN基因敲除鼠腎組織中，結(jié)石晶體碎片化，晶體數(shù)減少及晶體大小減小[22]。OPN介導(dǎo)的黏附作用與其結(jié)構(gòu)上整合素結(jié)合位點162SVVYGLR168相關(guān)[8]。這些研究表明，OPN在結(jié)石形成過程中，一方面作為結(jié)石基質(zhì)的一部分，與結(jié)石的形成有關(guān)；另一方面，包繞成石晶體，促進晶體與腎小管細胞間的黏附作用，并且與腎小管細胞受損后的晶體黏附密切相關(guān)。

2.4 OPN與氧化應(yīng)激

實驗及臨床研究證實結(jié)石患者腎臟內(nèi)，氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）的發(fā)生[23]?？寡趸芰p弱將導(dǎo)致晶體增加，結(jié)石形成[24]。在結(jié)石發(fā)生早期階段，腎小管上皮細胞損傷，線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，空泡形成，胞膜微絨毛減少，縮短[21]。細胞損傷促發(fā)氧化應(yīng)激，谷胱甘肽濃度下降，花生四烯酸增加[25]，同時OPN表達升高，促進前列腺素E2（PGE2）、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）等與炎癥相關(guān)因子的合成增加[26]。氧化應(yīng)激與炎癥因子的產(chǎn)生將造成腎小管上皮細胞進一步損傷與結(jié)石形成。用抗氧化劑，如NADPH氧化酶抑制劑干擾后，腎小管細胞中反應(yīng)活性氧，OPN的水平下調(diào)，并且減輕了結(jié)石晶體誘發(fā)的氧化損傷[24，26]。

2.5 OPN與細胞凋亡

Niimi等[27]，在乙二醇誘導(dǎo)的SD大鼠草酸鈣結(jié)石模型中觀測到：線粒體親環(huán)素D激活，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）損傷開放，線粒體塌陷，氧化應(yīng)激及凋亡通路啟動，OPN大量表達，促進晶體黏附于腎小管細胞。mPTP阻滯劑環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA），親環(huán)素D抑制劑N-甲基-4-異亮氨酸環(huán)孢素（N-methyl-4-isoleucine cyclosporin，NIM811）能阻止mPTP開放，減輕凋亡水平，顯著抑制OPN表達，減少晶體沉積[27-28]。Bhardwaj等[29]，發(fā)現(xiàn)OPN表達水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的相關(guān)性?？赡芡ㄟ^CD44受體[30]，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增加-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體轉(zhuǎn)運的鈣離子流，促進線粒體坍塌，激活凋亡通路[29]。這些研究表明，在結(jié)石形成早期階段，一方面，OPN能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，mPTP，線粒體坍塌激活凋亡通路；另一方面，在凋亡通路啟動后，大量表達，增強晶體黏附能力。

3 靶向OPN的治療策略

包括維生素E、綠茶、活血丹、褪黑素及檸檬酸鉀等在內(nèi)的抗氧化物，能通過抑制OS，減少OPN表達以及腎臟組織內(nèi)結(jié)石晶體的形成[22，24]。腎結(jié)石動物模型中，腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激標志物，腎損傷分子-1（KIM-1）及OPN水平顯著升高，草酸鈣晶體沉積。而食用抗氧化劑活血丹，檸檬酸鉀后各指標顯著下調(diào)[22]。這些抗氧化劑，可用于結(jié)石高危人群，例如尿路梗阻感染、高草酸尿癥、代謝綜合征患者預(yù)防結(jié)石形成，或體外沖擊波碎石術(shù)后預(yù)防結(jié)石復(fù)發(fā)。

通過抑制凋亡通路的關(guān)鍵因子，能減輕凋亡，減少OPN表達及結(jié)石形成。mPTP阻滯劑CsA，親環(huán)素D抑制劑NIM811能抑制mPTP開放，抑制細胞損傷及凋亡通路激活，OPN表達及早期草酸鈣晶體形成[27-28]。對凋亡通路各個重要環(huán)節(jié)的抑制，可能成為未來對抗結(jié)石的新靶點。

抗OPN抗體能影響凝血酶對OPN的裂解，通過抑制黏附抑制結(jié)石的早期形成。Hamamoto等[8]在乙醛酸誘導(dǎo)的小鼠模型中，腹腔注射鼠抗OPN抗體（anti-murine osteopontin antibody，35B6-Ab）顯著減輕腎臟晶體黏附，晶體形成及細胞損傷。

游離OPN能抑制晶體核心形成、晶體成長和聚集，而結(jié)合OPN則正好相反[18-19]，游離OPN與結(jié)合OPN的轉(zhuǎn)換過程目前仍然不清楚，若能抑制OPN與鈣離子的結(jié)合，減少結(jié)合OPN，增加游離OPN，或許能夠發(fā)揮游離OPN的功能，抑制結(jié)石的形成。

4 討論

綜上所述，OPN從三方面促進腎結(jié)石形成：①尿路中草酸鹽的濃度過高，結(jié)石早期形成。OPN作為結(jié)石核心的一部分，促進晶體間聚集及黏附，并促進晶體黏附于腎小管管腔。②晶體黏附于腎小管上皮細胞后，被內(nèi)吞進入胞內(nèi)溶酶體或者釋放到腎臟間質(zhì)被降解[11]。黏附于腎小管細胞上的結(jié)石晶體，能促進OPN大量表達及NADPH氧化酶反應(yīng)生成大量過氧化物。③OPN促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活親環(huán)素D，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）損傷開啟，線粒體死亡，凋亡通路啟動，OPN大量表達，促進晶體黏附于腎小管細胞。同時，巨噬細胞對小晶體吞噬并且消化，生長過快的晶體巨噬細胞無法消化，晶體進一步聚集并且排入管腔。endprint

OPN作為結(jié)石組成成分，在結(jié)石形成腎組織內(nèi)高表達，在晶體聚集與黏附，腎小管上皮細胞損傷氧化應(yīng)激、凋亡等過程發(fā)揮重要作用?？筄PN抗體、抗氧化劑、凋亡抑制劑等能通過抑制OPN產(chǎn)生，減少腎組織內(nèi)晶體形成及沉積，減輕腎臟損傷，能為臨床預(yù)防及治療腎結(jié)石提供新的有效方法。

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（收稿日期：2017-09-19 本文編輯：任 念）endprint