枸櫞酸鐵銨和鐵蛋白對(duì)原代培養(yǎng)腹側(cè)中腦神經(jīng)元VMAT-2和DAT表達(dá)影響

肖志新,宋立梅,謝俊霞,徐華敏

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是第二大常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)有運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)反射障礙等[1-3]。其病理性特征是黑質(zhì)(SN)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失[4]。迄今為止PD的病因尚未完全闡明，越來(lái)越多的證據(jù)表明，SN鐵的過度沉積可能是PD發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[5-13]。SN鐵增加會(huì)產(chǎn)生活性氧和活性氮物質(zhì)，刺激細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白形成，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性[14-15]。在腦內(nèi)鐵主要與鐵蛋白結(jié)合，鐵蛋白是一種可儲(chǔ)存多達(dá)4 500個(gè)鐵原子的蛋白質(zhì)[16-17]，有含鐵鐵蛋白(Ferritin)和去鐵鐵蛋白(Apoferritin)兩種形式[18]。有研究表明，鐵蛋白可能不僅是細(xì)胞內(nèi)的鐵儲(chǔ)存者，也可能是參與組織和全身鐵調(diào)控的重要因素[19]。但鐵蛋白在DA穩(wěn)態(tài)中起的作用尚不明確。

單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(VMAT-2)是位于DA能神經(jīng)元突觸囊泡的一種膜蛋白，可以將胞漿內(nèi)游離的DA轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi)，并調(diào)節(jié)隨后的釋放。它通過向單胺能神經(jīng)元傳遞DA小泡來(lái)保護(hù)DA能神經(jīng)元[20]。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)在SN神經(jīng)元胞體和樹突中大量表達(dá)[21-23]，可將DA從細(xì)胞外迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸前神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，以維持細(xì)胞內(nèi)外DA穩(wěn)態(tài)。但是在高鐵以及存在外源性鐵蛋白的狀態(tài)下，原代培養(yǎng)腹側(cè)中腦神經(jīng)元中VMAT-2和DAT的表達(dá)是否改變尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探究高鐵、Ferritin和Apoferritin對(duì)原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元VMAT-2和DAT表達(dá)的影響?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元細(xì)胞(取自孕14 d的Wistar大鼠的胎鼠腹側(cè)中腦)，DMEM/F12培養(yǎng)液、2.5 g/L的胰酶(美國(guó)Hyclone公司)，B27營(yíng)養(yǎng)因子、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，青霉素-鏈霉素溶液(100×，中國(guó)索萊寶科技有限公司)，D-多聚賴氨酸、枸櫞酸鐵銨(FAC)、Ferritin、Apoferritin(美國(guó)Sigma公司)，VMAT-2抗體和DAT抗體(中國(guó)上海Abcam公司)，ECL發(fā)光液(Millipore公司)。

1.2 原代腹側(cè)中腦神經(jīng)元的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)器械進(jìn)行高壓處理，提前3 h用D-多聚賴氨酸鋪培養(yǎng)板，以高壓滅菌水清洗3次放置超凈臺(tái)內(nèi)備用。將孕14 d的Wistar大鼠以聯(lián)合麻醉藥深度麻醉后，用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇進(jìn)行腹部消毒，沿中線剪開，取出串珠樣胚胎，放置在預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液中。將胚胎移至超凈臺(tái)中顯微鏡下，在冰上操作，剖開胚胎外膜取出胎鼠置于另一裝有DMEM/F12培養(yǎng)液的玻璃皿中。使用眼科鑷、眼科剪將中腦部分取出，去除端腦及血管膜，修剪組織留出蝴蝶狀的腹側(cè)中腦，將其轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷DMEM/F12培養(yǎng)液的玻璃皿中。去除DMEM/F12培養(yǎng)液，加入37 ℃預(yù)溫的2.5 g/L胰酶，在培養(yǎng)箱中消化5 min。加入含有胎牛血清的終止液終止消化。用移液器將組織吹打成單細(xì)胞懸液，用藍(lán)槍頭吹打約10次，收集單細(xì)胞懸液至50 mL離心管中，后套用黃槍頭和白槍頭重復(fù)上述操作。將裝有單細(xì)胞懸液的離心管以1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入含有B27和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，以2×108/L的密度種板。此后每隔2 d換1次液，第6天細(xì)胞成熟可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組，將原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元培養(yǎng)液換成DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液，對(duì)照組細(xì)胞只用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液孵育，F(xiàn)AC處理組細(xì)胞加入100 μmol/L的FAC，F(xiàn)erritin處理組細(xì)胞加入80 μmol/L的Ferritin，Apoferritin處理組細(xì)胞加入50 μmol/L的Apoferritin。將各組細(xì)胞置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.4 VMAT-2和DAT的蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)

在6孔板中加入100 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，用刮板將板底的細(xì)胞刮下，用移液器轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min。用移液器吸取80 μL上清至另一EP管中，使用BCA試劑盒檢測(cè)上清中蛋白質(zhì)濃度，加入5×Loading Buffer，95 ℃煮5 min。按照BCA試劑盒檢測(cè)的蛋白濃度計(jì)算SDS-PAGE凝膠電泳的上樣量。加入樣品后，調(diào)節(jié)電壓至80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120 V，電泳之后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以300 mA濕轉(zhuǎn)90 min，切下所需分子量的條帶，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h后，再加入用含50 g/L脫脂奶粉的TBST稀釋的VMAT-2抗體(稀釋度為1∶1 000)、DAT抗體(稀釋度為1∶1 000)和β-actin抗體(稀釋度為1∶10 000)孵育相應(yīng)的條帶，4 ℃搖床過夜。用TBST洗條帶3次，每次10 min，加入HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(稀釋度為1∶10 000)，室溫孵育1 h，孵育完成后以TBST洗3次，每次10 min。加ECL發(fā)光液避光孵育1 min顯影。利用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 FAC、Ferritin和Apoferritin對(duì)原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元VMAT-2表達(dá)的影響

對(duì)照組、FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組細(xì)胞內(nèi)的VMAT-2蛋白表達(dá)水平分別為1.175±0.075、0.938±0.044、0.945±0.046和0.921±0.062(n=17)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組VMAT-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.295，q=3.952～4.370，P<0.05)，而Ferritin處理組與Apoferritin處理組相比差異無(wú)顯著意義(q=0.417，P>0.05)。

2.2 FAC、Ferritin和Apoferritin對(duì)原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元DAT表達(dá)的影響

對(duì)照組、FAC處理組、Ferritin處理組和Apoferritin處理組細(xì)胞內(nèi)DAT蛋白表達(dá)水平分別為0.910±0.055、0.931±0.679、0.937±0.056、0.958±0.088(n=12)，各組間比較，差異均無(wú)顯著性(F=0.084，q=0.297～0.706，P>0.05)。

3 討 論

PD是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病與年齡老化、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、環(huán)境因素、遺傳因素等有關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，SN鐵過度沉積參與了PD的發(fā)病，過多的鐵激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放大量的神經(jīng)炎性因子，增加了DA能神經(jīng)元的變性[24]。在腦內(nèi)，鐵主要與鐵蛋白結(jié)合，鐵蛋白兩種亞型以互補(bǔ)的方式儲(chǔ)存細(xì)胞內(nèi)的鐵[25]。

有研究提出DA作用的區(qū)域概念，VMAT-2和DAT在調(diào)節(jié)這些區(qū)域之間DA轉(zhuǎn)移中起著核心作用[26-27]。VMAT-2將突觸前神經(jīng)元合成的DA攝取到突觸囊泡中，釋放到突觸間隙，從而作用到相應(yīng)的受體。而DAT可以將突觸間隙的DA重新攝取到突觸前神經(jīng)元。它們共同調(diào)節(jié)DA活性，從而改變DA的含量[28]。本文研究結(jié)果顯示，給予高鐵會(huì)導(dǎo)致原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元的VMAT-2表達(dá)降低。有實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)VMAT-2水平降低約95%時(shí)，小鼠表現(xiàn)為DA穩(wěn)態(tài)失調(diào)，而且神經(jīng)元對(duì)多種有毒化合物的敏感性增強(qiáng)[29-34]。這提示高鐵導(dǎo)致的VMAT-2表達(dá)降低可能影響了DA的釋放，從而引起DA穩(wěn)態(tài)失調(diào)。本文結(jié)果還顯示，給予鐵蛋白后，細(xì)胞VMAT-2的表達(dá)也會(huì)下降，說(shuō)明腹側(cè)中腦神經(jīng)元VMAT-2的表達(dá)變化不是鐵依賴性的，鐵蛋白和鐵均可通過影響VMAT-2的表達(dá)參與DA穩(wěn)態(tài)調(diào)控。Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)高鐵及鐵蛋白處理的腹側(cè)中腦神經(jīng)元DAT的表達(dá)沒有發(fā)生明顯變化，提示高鐵及鐵蛋白并不影響DA重新攝取到突觸前神經(jīng)元。以上結(jié)果提示，高鐵及鐵蛋白能夠減少突觸前神經(jīng)元的DA釋放，但并不影響DAT介導(dǎo)的DA重新攝取，這就導(dǎo)致了DA的穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可能增加了神經(jīng)元對(duì)有毒物質(zhì)的敏感性。本實(shí)驗(yàn)以原代細(xì)胞為模型，更好地探究了高鐵誘導(dǎo)的DA代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)情況，為開發(fā)影響DA穩(wěn)態(tài)的鐵螯合劑提供了新的依據(jù)，也為PD的治療提供了新的思路。