側腦室注射orexin B對MPTP帕金森病模型小鼠運動行為影響

卞康,薛雁,陳蕾

(青島大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種由基底神經核運動功能環(huán)路異常導致的神經退行性疾病[1-2]。orexins由orexin A(分子量3 561)和orexin B(分子量2 899)構成[3]。orexin受體(OXR)是G蛋白耦聯(lián)受體，包括orexin 1受體(OX1R)和orexin 2受體(OX2R)。在中樞神經系統(tǒng)中，OX2RmRNA分布在海馬CA3區(qū)、深層皮質和中縫核等區(qū)域[4]，而在外周組織中，OX2RmRNA含量較少[5]。orexin A與OX1R和OX2R結合的親和力幾乎相等，但是orexin B與OX2R結合的親和力遠遠大于與OX1R結合的親和力[4,6]。有研究結果表明，腦內orexins參與學習記憶、進食、獎賞等多種生理功能[7]。最近有研究報道，orexins在運動控制方面也發(fā)揮重要作用，多數(shù)中樞運動控制區(qū)域均接受orexin能纖維支配[8]。有研究表明，orexins與PD密切相關，PD病人腦脊液中orexins的含量顯著降低[9-14]。研究已證實，orexin B在細胞水平對多巴胺能神經元具有保護作用[15]。然而，orexin B是否可調控小鼠的運動行為尚不清楚。因此，本研究利用轉棒實驗進行行為學觀察，旨在探討側腦室注射orexin B對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)PD模型小鼠運動行為的影響。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 體質量為22～24 g、8～10周齡的正常雄性C57BL/6小鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。每籠4～6只小鼠，在溫度為22～25 ℃、濕度為50%～55%、12 h光照(早8：00到晚20:00開燈)12 h黑暗(晚20:00到早8：00關燈)的環(huán)境下飼養(yǎng)，及時添水加糧、更換墊料。

1.1.2實驗藥品 orexin B(Cat. No. 1456)購自Tocris公司；MPTP(Cat. No. M0896)購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1側腦室埋管 腹腔注射水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，并將其置于腦立體定位儀上。將導管帽和給藥導管(型號為62102和62003，瑞沃德生物科技有限公司)植入右側腦室(前囟后0.3 mm，向右旁開1.0 mm，顱骨表面下2.2 mm)，并用牙托水泥固定。小鼠術后恢復7 d，其中前4 d連續(xù)肌肉注射青霉素20 000 U/d。

1.2.2實驗分組及處理 側腦室埋管7 d后將小鼠隨機分為正常對照組、MPTP組、orexin B組和orexin B+MPTP組。各組首先側腦室注射相應的藥物3 d進行預處理，再腹腔注射相應的藥物5 d。正常對照組給予生理鹽水側腦室注射和腹腔注射；MPTP組給予生理鹽水側腦室注射和MPTP腹腔注射；orexin B組給予orexin B側腦室注射和生理鹽水腹腔注射；orexin B+MPTP組給予orexin B側腦室注射和MPTP腹腔注射。根據(jù)預實驗結果，orexin B給藥劑量為600 ng/d，MPTP給藥劑量為30 mg/(kg·d)。側腦室注射體積為2 μL，注射時間為3 min，留針3 min；腹腔注射體積為0.005 mL/g。注射時小鼠可自由活動，注射器隨小鼠的活動而移動。在給藥的8 d內均注射青霉素預防感染。

1.2.3轉棒實驗 將小鼠背對著測試者放在旋轉棒上適應2 min。第2天進行實驗，轉速為4～40 r/min，記錄小鼠在旋轉棒上停留的時間，最長時間設為300 s。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

對照組(n=8)、MPTP組(n=8)、orexin B組(n=7)和orexin B+MPTP組(n=8)小鼠在旋轉棒上停留的時間分別為(74.44±2.71)、(39.94±4.67)、(80.50±6.68)和(52.19±2.91)s。析因設計方差分析結果顯示：FMPTP=63.76，P<0.01；Forexin B=8.382，P<0.01；FMPTP×orexin B=2.275，P>0.05。因兩因素無交互作用，故進行單獨效應分析：與正常對照組相比，MPTP組小鼠在旋轉棒上停留的時間顯著縮短(t=6.83，P<0.01)，說明MPTP組小鼠運動功能受損；側腦室注射orexin B的正常小鼠在旋轉棒上停留的時間與正常對照組相比差異無顯著性(P>0.05)，然而，側腦室注射orexin B的MPTP模型小鼠在旋轉棒上停留的時間較MPTP組明顯延長(t=3.17，P<0.05)，提示orexin B可改善MPTP誘導的運動障礙。

3 討 論

Orexins廣泛分布于全腦，與orexin A相比，orexin B的脂溶性低，在血液中降解速度快，而且不易透過血-腦脊液屏障，故腦內orexin B的含量較高[16]。orexin A與OX1R和OX2R結合的親和力幾乎相等，但orexin B與OX2R結合的親和力遠遠大于與OX1R結合的親和力[4,6]。orexins參與調節(jié)多種生理過程，包括進食、運動控制和學習記憶功能等[17-18]。有文獻報道，側腦室給予orexins可增加食物攝入量，而外周注射orexins沒有引起攝食的變化[19]。orexins缺乏可導致學習和記憶缺陷，而orexins可增強海馬神經再生，改善空間學習和記憶能力[7]。有文獻報道，側腦室給予orexin B可改善大鼠學習能力和鞏固其記憶能力，而orexin B鞏固記憶的作用可以被OX2R拮抗劑所逆轉[20]。orexins與PD的發(fā)病密切相關，PD病人腦脊液中orexins的含量降低25%[21]。

Orexins與運動控制的關系越來越受到關注。有研究表明，微量注射orexin A到腹外側視前區(qū)、伏隔核、黑質和藍斑等均可以刺激大鼠的自發(fā)性運動[22-25]。鼻腔給予orexin A后，小鼠的運動能力顯著增加，但持續(xù)時間較短[26]。有文獻報道，orexin A可以提高金魚的自發(fā)性運動而且可被OX1R阻斷劑SB 334867所阻斷[27]。orexin A可以增加6-羥基多巴胺(6-OHDA)PD模型大鼠的運動能力，而注射SB 334867會加重運動缺陷[28]。

以往電生理學和行為學研究提示，腦內orexin B參與運動功能調控。側腦室注射orexin B增加大鼠挖掘和修飾行為，但作用較orexin A弱[29]。有文獻報道，orexin B可通過OX2R興奮與運動密切相關的小腦間質核和前庭下核神經元[30-31]。藍斑接受致密的orexin能纖維投射，orexin B可激活藍斑核神經元，進而增加肌張力[32]。眾所周知，PD是黑質致密帶多巴胺能神經元退變導致的運動障礙性疾病。本文研究結果表明，側腦室注射orexin B可改善MPTP誘導的PD模型小鼠運動障礙癥狀。我們前期的電生理實驗結果顯示，orexin B增加黑質致密帶多巴胺能神經元的自發(fā)放電頻率[33]。由此我們推測，側腦室給予orexin B可能通過增加PD模型小鼠黑質多巴胺能神經元自發(fā)放電，通過基底神經核功能通路，解除基底神經核輸出核團對大腦皮質運動區(qū)的抑制效應，從而改善運動障礙癥狀。

轉棒實驗是評價小鼠運動協(xié)調能力常用的一種行為學方法[34-35]。它通過比較小鼠在旋轉棒上停留時間的長短來反映小鼠的運動協(xié)調能力，在旋轉棒上停留的時間越長，表明小鼠的運動能力越好。本實驗結果顯示，側腦室注射orexin B可增加MPTP模型小鼠在旋轉棒上停留的時間，提示側腦室給予orexin B可改善MPTP模型小鼠的運動能力。本實驗室前期通過曠場和爬桿實驗研究證實，側腦室給予orexin A可改善MPTP誘導的PD模型小鼠的運動障礙癥狀[36]。因為側腦室給予orexin A和orexin B可以作用于不同核團的不同受體，故在今后的行為學實驗中，可進一步觀察側腦室聯(lián)合給予orexin A和orexin B是否會產生協(xié)同效應。

PD可累及運動系統(tǒng)，導致運動障礙。本研究結果提示側腦室注射orexin B可改善MPTP誘導的PD模型小鼠的運動障礙癥狀，這為進一步深入探討orexin B與PD發(fā)病機制及治療的相關性提供了一定的理論和實驗依據(jù)。