外源激素和溫度對切花菊側芽萌發(fā)與內源激素含量的影響

趙 鳳， 王小樂， 房偉民， 張 飛， 陳發(fā)棣， 管志勇， 姚建軍， 薛建平

(1.南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095； 2.上海虹華園藝有限公司，上海 200070)

菊花(Chrysanthemummorifolium)是中國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，也是中國主要出口鮮切花，其中單頭標準菊是其主要類型[1]。標準切花菊生產(chǎn)需要大量人工進行側芽側蕾的抹除工作，而少側芽標準切花菊品種的選育與應用可減少該環(huán)節(jié)工作，節(jié)省大量人力物力。但少側芽品種在繁育階段也面臨母本萌芽少、采穗率低等問題，在高溫階段尤其突出，難以通過扦插的方式大量繁育種苗。因此，研究少側芽標準切花菊品種的側芽萌發(fā)和生長的調控技術及其機理具有重要的實踐和理論意義。

植株側枝的生長發(fā)育與其自身部位、激素和溫度有關，如甘蔗中不同部位植株側芽萌發(fā)有顯著的差異[2-3]。而植物激素對側枝的發(fā)育有重要影響，其中，IAA和6-BA是在生產(chǎn)上應用比較廣泛的植物生長調節(jié)劑，如外源生長素IAA可以顯著抑制水稻分蘗[4]和楊樹枝條的形成[5],而6-BA能促進梨枝條的發(fā)育[6]，也影響蘋果幼苗的分枝[7-8]。此外，植株側枝發(fā)育還與溫度有關，如相關實踐和李俊香等研究結果均表明，隨著溫度升高，菊花的側芽生長加快，但在高溫下會受到明顯抑制[9]。目前，植物生長調節(jié)劑促進分枝的應用主要集中在果樹和大田作物等方面，在菊花的生產(chǎn)上未見報道。切花菊精の一世屬于少側芽標準型切花菊品種，近幾年得到了市場的認可并在生產(chǎn)中大量應用，但育苗時也面臨側芽少、采穗率低的問題，在一定程度上限制了它的大量擴繁應用。

本研究主要利用精の一世組培苗，探究不同部位的側芽發(fā)生特點及生長素、細胞分裂素和溫度對精の一世側芽發(fā)生與生長的影響，為了解其側芽萌發(fā)生長的調控機制，進而為提高少側芽菊花品種的繁殖效率提供技術和理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為標準切花菊品種精の一世無菌苗，來源于南京農業(yè)大學中國菊花種質資源保存中心，該品種側芽萌發(fā)量較少。試驗所用的試劑6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)為化學純，冰醋酸(CH3COOH)為分析純，甲醇(CH3OH)為色譜純。ZT(玉米素)、GA(赤霉素)、IAA(3-吲哚乙酸)、ABA(脫落酸)為色譜純。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同部位的離體莖段側芽萌發(fā)特點 取生長旺盛的組培苗，以1LB(第一節(jié)位)為靠近頂芽向下數(shù)的第一片葉子所在的節(jié)位，以此類推將其分成上部(1LB和2LB)、中部(3LB和4LB)和下部(5LB和6LB)，分別接種到MS培養(yǎng)基中， 3次重復，每個重復5瓶，每瓶接種3～4個莖段，常溫下培養(yǎng)。分別在第7 d、第14 d、第21 d、第35 d統(tǒng)計組培苗不同部位側芽萌發(fā)(展開2片成熟葉)的數(shù)目，并計算萌芽率。同時測定35 d時側芽長度、長枝(長度大于等于1 cm)數(shù)目，并計算長枝率(長枝數(shù)目除以萌芽數(shù)目)。

內源激素測定：35 d時，取不同位置側芽, 液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。每次取?株，3次重復。超高效液相色譜(UPLC)法同時測定樣品中的IAA、ZT、GA和ABA含量，測定方法參照侯凱等的方法[10]。

1.2.2 6-BA和NAA對離體莖段側芽萌發(fā)的影響 取生長旺盛的組培苗中部節(jié)位的莖段，在MS培養(yǎng)基中分別添加0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L的NAA和0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 的6-BA，MS培養(yǎng)基為對照，常溫下培養(yǎng)。28 d后測定莖段側芽萌發(fā)數(shù)、畸形(側芽矮化)數(shù)、側芽長度、長枝數(shù)并計算萌芽率(萌芽數(shù)目除以節(jié)位數(shù)目)、畸形率(畸形芽數(shù)目除以節(jié)位數(shù)目)和長枝率，并取樣測定IAA、ZT、GA和ABA含量，測定方法同方法1.2.1。

1.2.3 不同溫度對離體莖段側芽萌發(fā)的影響 取生長旺盛的組培苗中部節(jié)位的莖段接種到MS培養(yǎng)基，設4個溫度處理，分別為晝/夜溫25 ℃/20 ℃、22 ℃/17 ℃、28 ℃/ 23 ℃、30 ℃/ 25 ℃，其中25 ℃/20 ℃為對照，光周期為光照16 h/黑暗8 h，光照度為3 000 lx。每處理3次重復，每重復3瓶，每瓶接3個莖段。在處理后第14 d、第21 d、第35 d時分別跟蹤調查莖段萌芽數(shù)，并計算萌芽率，在35 d時測定側芽長度、長枝數(shù)目，計算長枝率，并測定IAA、ZT、GA和ABA含量，測定方法同方法1.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)與分析

應用SPASS20.0和Microsoft Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 精の一世不同部位側芽萌發(fā)特點及其內源激素含量差異

表1表明，精の一世側芽的萌發(fā)速度和生長狀況與其部位有關，中部莖段側芽萌發(fā)速度比上部和下部快，其中在接種7 d時，中部側芽的萌芽率達36%，上部為18%，下部為10%；14 d時，中部側芽萌發(fā)率也最高，為70%；35 d時，上部、中部、下部的側芽萌發(fā)率均達到100%。而35 d時中部和下部的側芽長度分別為2.42 cm和2.32 cm，均顯著高于上部的1.32 cm；長枝率從上部至下部逐步提高，下部側芽長枝率最高，達98%，上部側芽的長枝率最低，僅為56%，說明中部和下部側芽的質量較上部好。

表1精の一世不同部位側芽萌發(fā)

Table1Axillarybuddingsatdifferentpartofinvitrostemof‘SeiNoIssei’

部位萌芽率(%)7d14d35d側芽長度(cm)長枝率(%)上部18b52b100a1.32b56b中部36a70a100a2.42a72b下部10b67ab100a2.32a98a

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1表明，不同部位的內源激素含量有顯著差異，上部的IAA和ABA含量最高，分別達到860.58 ng/g和639.49 ng/g，均顯著高于中部、下部。而不同部位的ZT和GA的含量也均有顯著差異，下部最高、中部最低。圖2表明，不同部位ZT/ABA、GA/ABA、IAA/ABA、ZT/IAA和(GA+IAA+ZT)/ABA均有顯著差異，中部ZT/IAA最高，為0.36，下部次之，為0.21，上部最低，僅為0.11，因此中部莖段最易萌發(fā)，而中、下部ZT/ABA、GA/ABA、IAA/ABA、ZT/IAA和(GA+IAA+ZT)/ABA均高于上部，也印證了中部、下部側芽萌發(fā)率、側芽長度和長枝率均高于上部的現(xiàn)象。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 精の一世不同部位側芽的內源ZT、GA、IAA、ABA含量Fig.1 The levels of endogenous ZT, GA, IAA and ABA in axillary buds at different part of ‘Sei No Issi’

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 精の一世不同部位側芽的內源激素比例Fig.2 Ratio of different endogenous hormones in axillary buds at different part of in vitro stem of cut chrysanthemum ‘Sei No Issi’

2.2 不同濃度的NAA和6-BA對側芽萌發(fā)的影響及對內源激素的影響

表2表明，隨著NAA濃度的增加，精の一世側芽的萌發(fā)率降低，由83%下降到30%；各處理的側芽長度也顯著低于對照，由1.28 cm減少到0.45 cm；側芽的長枝率也降低，由對照的50%下降到20%。

表2不同濃度NAA處理對精の一世側芽萌發(fā)的影響

Table2EffectofdifferentconcentrationsofNAAonaxillarybuddingsof‘SeiNoIssei’stem

NAA濃度(mg/L)萌芽率(%)畸形率(%)側芽長度(cm)長枝率(%)083a11ab1.28a50a0.179a21a0.69bc26b0.555b0b0.91b35b1.030c0b0.45c20c

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3表明， 0.5 mg/L和1.0 mg/L 6-BA均促進了側芽的萌發(fā)， 2.0 mg/L 6-BA則抑制了側芽萌發(fā)。此外，1.0 mg/L和2.0 mg/L 6-BA處理的側芽畸形率均有明顯提高，最高達到70%?？梢?，6-BA明顯抑制了側芽的生長，各處理的側芽長度顯著低于對照，長枝率也隨之明顯下降。

表3不同濃度6-BA處理對精の一世側芽萌發(fā)的影響

Table3Effectofdifferentconcentrationsof6-BAonaxillarybuddingsof‘SeiNoIssei’

6-BA濃度(mg/L)萌芽率(%)畸形率(%)側芽長度(cm)長枝率(%)083a11b1.28a50a0.5100a11b0.63b5b1.0100a70a0.54bc1b2.028b56a0.43c0b

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖3表明，外源NAA會引起植物體內ZT含量顯著下降，由89.9 ng/g下降到12.5 ng/g，減少了86.1%；IAA含量顯著上升，高達656.4 ng/g，增加了45.8%；而GA和ABA含量沒有顯著變化。而外源6-BA主要導致ZT含量顯著升高，達121.2 ng/g；GA和IAA含量顯著下降，GA僅為50.6 ng/g，下降了72.1%，IAA僅為273.6 ng/g，下降了39.2%。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 NAA和6-BA處理對精の一世側芽內源激素含量的影響Fig.3 Effects of NAA and 6-BA on levels of four endogenous hormones in ‘Sei No Issei’

圖4表明，外源NAA對內源激素的比例也產(chǎn)生了影響，生長類激素與抑制類激素(GA+IAA+ZT)/ABA比例提高，達到11.1，而生長類激素相對含量的上升可以顯著促進側芽生長；外源NAA處理引起ZT/ABA和ZT/IAA顯著降低，與對照相比ZT/ABA下降了87.3%，ZT/IAA下降了90.5%,而IAA/ABA則有顯著提高，GA/ABA沒有顯著變化。而外源6-BA處理后顯著提高了ZT/IAA，較對照增加了120%，ZT/ABA沒有顯著變化,而GA/ABA、IAA/ABA均有顯著下降。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 NAA和6-BA處理對精の一世側芽四種內源激素比例的影響Fig.4 Effects of NAA and 6-BA on ratio of four endogenous hormones in ‘Sei No Issei’

2.3 不同溫度對莖段側芽萌發(fā)生長及內源激素含量的影響

表4表明，溫度的升高會顯著抑制精の一世離體莖段側芽的萌發(fā)和生長。22 ℃日溫時，莖段在35 d的萌發(fā)率達100%，但是側芽長度比25 ℃顯著降低。在超過25 ℃日溫后，隨著溫度的升高，側芽的萌發(fā)率、側芽長度、長枝率均逐漸降低。而在30 ℃日溫培養(yǎng)條件下，莖段在14 d、21 d、35 d時萌發(fā)率、側芽長度和長枝率都下降到最低，僅分別為55%、58%、67%，說明高溫顯著抑制精の一世側芽的萌發(fā)和生長。

表4不同溫度處理對精の一世側芽萌發(fā)的影響

Table4Effectsoftemperaturesontheaxillarybuddingsof‘SeiNoIssei’

溫度(℃)萌芽率(%)14d21d35d側芽長度(cm)長枝率(%)2268b92a100a1.65b88a2583a92a100a2.08a92a2871b75b79b1.88a89a3055c58c67c1.37c77b

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖5表明，與25 ℃對照相比，30 ℃高溫使側芽ZT極顯著降低，僅為219.2 ng/g，F(xiàn)W，降低了80.9%；而GA和ABA極顯著升高，GA增加了1.21倍，達367 ng/g，F(xiàn)W，ABA增加了1.75倍，達603.5 ng/g，F(xiàn)W，IAA則沒有顯著變化。

*和**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。圖5 不同溫度處理對精の一世側芽四種內源激素含量的影響Fig.5 Effects of different temperatures on the level of four endogenous hormones in ‘Sei No Issei’

圖6表明，高溫使ZT/ABA、IAA/ABA以及ZT/IAA極顯著降低，從而使生長促進類激素和生長抑制類激素比值(GA+IAA+ZT)/ABA極顯著降低，由5.03降低到1.29，而GA/ABA沒有顯著變化。生長促進類激素和生長抑制類激素的比例極顯著降低是引起30 ℃高溫抑制側芽萌發(fā)和生長的內在原因。

*和**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。圖6 不同溫度處理對精の一世側芽四種內源激素比例的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the ratio of four endogenous hormones in ‘Sei No Issei’

3 討 論

植株側芽的萌發(fā)與生長受到側芽中內源激素含量和激素間比例的變化調控，而側芽的不同部位、外源激素和外界溫度等均影響內源激素的變化。

激素是調控側芽萌發(fā)的主要因素，抑制生長素的極性運輸，能促進植株側芽的生長[11-12]，而CTK(細胞分裂素)能促進側芽生長，從而抑制植株側芽內IAA的合成及向外運輸[13-14]，赤霉素則能協(xié)同細胞分裂素共同促進植株側芽的生長[15]。高貴賓等[16]對美麗箬竹盆栽苗地下莖側芽萌發(fā)特征研究發(fā)現(xiàn)，IAA、GA對側芽發(fā)筍影響比較大。本試驗中，上部側芽IAA和ABA含量均顯著高于中下部，且中部ZT/IAA最高，下部次之，上部最低，較高的ZT/IAA比值會促進側芽的萌發(fā)生長，這從精の一世離體莖段上部側芽的萌發(fā)與伸長受到抑制，中部的萌發(fā)率和長枝率均高于上部的結果也得到了印證，這與肖關麗等[2]在甘蔗離體莖段的研究一致。

施用外源IAA和6-BA會對植株側枝的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。劉凱等[5]用0.01 mg/L IAA噴施楊樹，可以明顯抑制楊樹枝條的形成；張慶偉等[7]發(fā)現(xiàn)噴施500 mg/L 6-BA能有效促進蘋果幼苗分枝。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的外源生長素NAA抑制了精の一世側芽的萌發(fā)生長， 0.5 mg/L 6-BA則促進側芽的萌發(fā)，而1.0 mg/L 6-BA雖能促進側芽萌發(fā)生長，但側芽畸形率增加。外源激素會引起植株體內內源激素含量發(fā)生變化，從而影響植株的分枝發(fā)育，并且影響側芽與側枝的形成[17-18]。Kalousek等[19]發(fā)現(xiàn)細胞分裂素對生長素的合成與運輸有重要影響，從而通過生長素的合成與運輸來調控側芽的萌發(fā)生長；劉楊等[20]認為，外源GA3和NAA提高了分蘗節(jié)中ABA的含量從而抑制分蘗節(jié)的生長；蔡鐵等[21]認為外源激素主要通過影響內源IAA、ZT含量以及IAA/ZT和ABA/ZT來影響分蘗芽的生長進而調控小麥分蘗的發(fā)生。本試驗發(fā)現(xiàn)精の一世側芽的形成并不是受外源單一某種激素的影響，而是受多種激素相互作用的影響，外源NAA處理引起ZT/ABA和ZT/IAA顯著降低，ZT/ABA降低則會抑制側芽的發(fā)生，這與劉楊[20]、蔡鐵[21]的研究結果一致；外源6-BA處理菊花試管苗中ZT/IAA上升，GA/ABA、IAA/ABA顯著下降，而ZT/IAA的上升和GA/ABA的下降則會導致側芽的發(fā)生與生長，這與Miguel等[17]、Kalousek等[19]和黃堅欽等[22]的研究結果一致。

精の一世在常溫下側芽正常萌發(fā)生長，30 ℃高溫抑制了側芽的萌發(fā)生長，表明精の一世側芽的萌發(fā)生長與外部環(huán)境溫度相關。這與李俊香等[9]發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，深志的側芽在高溫33 ℃下會受到明顯抑制的結果相同，Schoellhorn 等[23]、Huh等[24]在菊花上的研究結果也類似。

溫度會引起植株體內內源激素含量發(fā)生變化，從而影響植株的分枝發(fā)育。李俊香等[9]研究結果表明，溫度可能通過影響深志莖尖中ZR含量及IAA/ZR值調控其側芽的形成[9]。本試驗中，對內源激素含量的測定發(fā)現(xiàn)，30 ℃高溫下側芽中ZT的含量極顯著降低，GA和ABA含量極顯著升高，引起ZT/IAA顯著降低。由此推測，溫度主要是通過影響內源細胞分裂素與生長素的含量與比例影響側芽的萌發(fā)生長。同時本研究還發(fā)現(xiàn)生長促進類激素和生長抑制類激素比例(GA+IAA+ZT)/ABA的降低抑制了側芽的萌發(fā)生長，表明側芽的萌發(fā)生長可能是幾種激素共同調控的結果。

綜上所述，選擇植株中部或下部莖段、添加0.5 mg/L 6-BA，25 ℃左右的培養(yǎng)溫度有利于精の一世離體側芽萌發(fā)和生長。當然，由于菊花側芽的萌發(fā)與生長受到多種因素的影響，各種因素復合處理對側芽萌發(fā)生長的影響還需要進一步的研究。

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