響應(yīng)面法優(yōu)化馬齒莧黃酮超聲波提取工藝

王 波， 張曉艷， 黃 攀， 呂德雅， 嚴(yán) 帆， 劉 輝

(安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

馬齒莧(PortulaceoleraceaL.)是馬齒莧科馬齒莧屬一年生肉質(zhì)草本植物，又名螞蟻菜、長(zhǎng)命菜、瓜子菜、五行草等，在中國(guó)南北方均有分布，資源十分豐富[1-3]。馬齒莧含有黃酮、多糖、多酚、生物堿等多種生物活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理活性及營(yíng)養(yǎng)保健功能[4-7]，是中國(guó)衛(wèi)生部劃定的101種藥食同源野生植物之一，曾經(jīng)被列入2008年北京奧運(yùn)會(huì)的菜譜[8-9]，對(duì)馬齒莧功能性成分的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。黃酮類(lèi)化合物具有較低的毒性和廣譜的藥學(xué)功能，具有抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒、抗衰老、降低心肌耗氧量、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[10-11]。近年來(lái)，對(duì)于馬齒莧黃酮的研究，主要涉及提取工藝[12-14]、抑菌和抗氧化性等方面[15-17]，但目前未見(jiàn)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬齒莧黃酮提取工藝方面的報(bào)道。響應(yīng)面分析法通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型解決受多種因素影響的最優(yōu)組合問(wèn)題，用于確定各因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)響應(yīng)值的影響，常用于原料功效成分提取工藝條件的優(yōu)化[18-21]。超聲波提取技術(shù)具有快速、廉價(jià)和高效的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物的提取[22]。本研究采用超聲波法提取馬齒莧黃酮，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為馬齒莧植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 馬齒莧樣品

馬齒莧樣品2015年10月15日采于安徽省安慶市潛山縣。新鮮馬齒莧先用自來(lái)水沖洗掉泥沙，然后用蒸餾水沖洗干凈，最后用濾紙迅速吸干表面附著水分，于90 ℃條件下殺青30 min，60 ℃下烘干至恒質(zhì)量。烘干后的馬齒莧樣品用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目尼龍篩，分別存于自封袋中編號(hào)備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品),KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品),SHZ-D(Ш)型循環(huán)水式真空泵(上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品)。

主要試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,無(wú)水乙醇，以上試劑均為分析純。

1.3 馬齒莧黃酮超聲波提取工藝

準(zhǔn)確稱取已過(guò)60目篩的馬齒莧干燥樣品1.000 0 g，進(jìn)行超聲波提取，然后過(guò)濾，最后將濾液定容至50 ml，即得馬齒莧黃酮提取液。

1.4 馬齒莧黃酮提取率的測(cè)定

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.008 0 g，加60%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[21]。分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 ml至10只10 ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液補(bǔ)充至5.0 ml。先分別加入5%NaNO2溶液0.3 ml搖勻,放置6 min后，分別加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml搖勻,放置6 min后，再分別加入1.0 mol/L NaOH溶液4.0 ml，用蒸餾水定容至10.0 ml搖勻,放置15 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度值[23]。以吸光度值為縱坐標(biāo)，黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是Y=18.419 0x+0.012 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。精密移取馬齒莧黃酮提取液1.5 ml至10 ml容量瓶中，同上操作加入5%NaNO2、10% Al(NO3)3和1.0 mol/L NaOH，定容，在510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)得的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算馬齒莧中黃酮的含量，然后計(jì)算馬齒莧黃酮提取率，馬齒莧黃酮提取率=(馬齒莧黃酮質(zhì)量/馬齒莧質(zhì)量) ×100%。

1.5 馬齒莧黃酮提取的單因素試驗(yàn)

前人研究結(jié)果表明，在黃酮的超聲波輔助提取過(guò)程中，黃酮提取率受乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度等提取工藝參數(shù)的影響[20,24]。因此，分別以這4個(gè)工藝參數(shù)為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響，各因素水平見(jiàn)表1。

1.6 馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用4因素3水平對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，同時(shí)采用Design-Expert.V8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定超聲波法提取馬齒莧黃酮的最優(yōu)工藝。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

Table1FactorsandcodedlevelsofresponsesurfaceanalysisforextractingflavonoidfromPortulaceoleraceaL.

水平乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)液料比(ml/g)提取時(shí)間(min)提取溫度(℃)-16010∶1405007020∶1606018030∶18070

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用SPSS 17.0 for Windows 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用origin86軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為液料比 30∶1(ml/g)，反應(yīng)溫度50 ℃，提取時(shí)間60 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%時(shí)的黃酮提取率。由圖1可知，黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值(1.16%)。再增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，黃酮提取率反而下降。這可能是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大黃酮類(lèi)化合物的溶解度也隨之增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)樣品中的其他醇溶性物質(zhì)被浸出，與黃酮形成競(jìng)爭(zhēng)[20]，從而導(dǎo)致黃酮提取率降低。因此確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid extraction yield

2.1.2 液料比對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，反應(yīng)溫度50 ℃，提取時(shí)間60 min，考察液料比分別為 5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (ml/g)時(shí)的黃酮提取率。由圖2可知，黃酮提取率隨液料比的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為 20∶1時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值(1.36%)。如果溶劑用量少，則黃酮溶出量少；如果溶劑用量過(guò)大，雜質(zhì)溶出量也增加，且成本增加[22]。因此確定最佳液料比為 20∶1。

圖2 液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid-to-solid on flavonoid extraction yield

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為液料比 30∶1(ml/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，反應(yīng)溫度50 ℃，考察超聲波提取時(shí)間分別為20 min、40 min、60 min、 80 min、100 min及120 min時(shí)的黃酮提取率。由圖3可知，黃酮提取率隨提取時(shí)間的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值(1.44%)。提取時(shí)間較短時(shí)黃酮沒(méi)有完全溶出，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)溶出的黃酮可能被氧化分解掉，使得提取率下降。因此，確定最佳提取時(shí)間為60 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on flavonoid extraction yield

2.1.4 提取溫度對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響 控制反應(yīng)條件為液料比 30∶1(ml/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間60 min，考察反應(yīng)溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃ 時(shí)的黃酮提取率。由圖4可知，黃酮提取率隨提取溫度的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值(1.44%)。這種變化主要是由于溫度在一定范圍內(nèi)升高時(shí)，物質(zhì)的溶解度會(huì)增加，分子間的黏滯度下降，使得更多的黃酮得以溶出。但過(guò)高的溫度會(huì)破壞黃酮的分子結(jié)構(gòu)，從而降低黃酮的提取率[25]。因此，確定最佳提取溫度為60 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on flavonoid extraction yield

2.2 馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立和方差分析 采用Design-Expert V8.0.6.1軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)4因素作為自變量，以馬齒莧黃酮提取率作為響應(yīng)值，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)分析點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)[26-28]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立四元二次響應(yīng)面回歸方程(編碼方程)：黃酮提取率=1.300 0-0.009 2A+0.130 0B+0.013 0C+0.013 0D+0.042 0AB-0.020 0AC-0.020 0AD+0.050 0BC-0.043 0BD+0.040 0CD-0.000 3A2-0.057 0B2-0.059 0C2-0.046 0D2。

表2Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

Table2Box-Behnkenexperimentaldesignandcorrespondingresults

試驗(yàn)號(hào)因素水平乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)液料比(B)提取時(shí)間(C)提取溫度(D)黃酮提取率(%)11-1001.052-1-1001.20300001.37401011.305-11001.326100-11.3070-1100.97800001.319-100-11.20100-10-10.991101101.41120-1-101.1113-10-101.1814010-11.301511001.3416-10101.331710-101.171800-1-11.251900111.192000-111.102100001.2522-10011.302300001.312401-101.352500001.262610101.2427001-11.182810011.32290-1011.16

表3響應(yīng)面二次回歸方程各項(xiàng)與黃酮提取率的方差分析

Table3Analysisofvarianceforeachtermoftheresponsesurfacequadraticregressionequationandtheextractionrateofflavonoid

項(xiàng)目平方和自由度均方差F值P值模型0.280140.0204.500.0040**A0.00110.0010.220.6429B0.20010.20044.18<0.0001**C0.00210.0020.480.4993D0.00210.0020.440.5178AB0.00710.0071.610.2253AC0.00210.0020.360.5601AD0.00210.0020.360.5601BC0.01010.0102.200.1597BD0.00810.0081.690.2152CD0.00610.0061.430.2524A20.00010.00000.9913B20.02110.0214.680.0483*C20.02310.0235.010.0419*D20.01410.0143.030.1037殘差0.063140.004失擬項(xiàng)0.054100.0052.330.2150純誤差0.00940.002總離差0.35028

A:乙醇體積分?jǐn)?shù)；B：液料比；C：提取時(shí)間；D：提取溫度。*、**分別表示該項(xiàng)目對(duì)黃酮提取率的影響顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)，R2=0.818 2。

響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果(表3)顯示：失擬項(xiàng)不顯著(P=0.215 0>0.05)，說(shuō)明模型的擬合程度良好，殘差均由隨機(jī)誤差引起，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小[29]；模型的P值為0.004 0，表明該二次方程模型為極顯著[30]；四元二次響應(yīng)面回歸方程的決定系數(shù)R2=0.818 2，說(shuō)明回歸方程擬合性好。綜上所述，該二次響應(yīng)面回歸方程的失擬項(xiàng)很小，模型極顯著，試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明模型擬合非?？煽浚虼丝捎迷摶貧w方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[31]。

根據(jù)模型擬合結(jié)果，馬齒莧黃酮最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比 30∶1 (ml/g)、提取時(shí)間55.40 min、提取溫度64.19 ℃，此條件下馬齒莧黃酮提取率為1.42%。為方便操作，將馬齒莧黃酮最佳提取工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比30∶1(ml/g)、提取時(shí)間55 min、提取溫度64 ℃。在此最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)，結(jié)果表明馬齒莧黃酮的提取率為1.38%，接近模型預(yù)測(cè)的馬齒莧黃酮提取率，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間具有較好的擬合性，從而也證明了響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬齒莧黃酮提取工藝的可行性。

2.2.2 馬齒莧黃酮提取的響應(yīng)面分析 由乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)馬齒莧黃酮提取率所構(gòu)成的響應(yīng)圖，可反映兩因素交互作用對(duì)黃酮提取率的影響。固定2個(gè)因素在0水平上，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度交互作用對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果，采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件作出響應(yīng)曲面圖(圖5)。響應(yīng)曲面圖中，曲線走勢(shì)越陡，影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，影響越小[32]。由圖5可知：液料比對(duì)馬齒莧黃酮提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，其次為提取時(shí)間和提取溫度，影響最不顯著的是乙醇體積分?jǐn)?shù)，表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化，馬齒莧黃酮提取率的變化較小。

圖5 各因素間交互作用對(duì)黃酮提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on the extraction rate of flavonoid

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert，對(duì)自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度4因素與因變量黃酮提取率的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了回歸分析，得到的數(shù)學(xué)模型擬合性好，表明該模型準(zhǔn)確可靠，能夠用該模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)馬齒莧黃酮的最佳提取條件及其理論最大提取率。根據(jù)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)出的試驗(yàn)條件和實(shí)際操作的可行性，確定馬齒莧黃酮最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比30∶1(ml/g)、提取時(shí)間55 min、提取溫度64 ℃，此條件下馬齒莧黃酮提取率為1.38%，與預(yù)測(cè)值1.42%相差較小。

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