辣椒類甜蛋白基因家族鑒定及表達分析

劉 潮， 韓利紅， 宋培兵， 王德琴， 王海波， 唐利洲

(曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源保護與利用研究中心/生物資源與食品工程學(xué)院/云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進化重點實驗室，云南 曲靖 655011)

類甜蛋白(Thaumatin-like protein，TLP)因與西非竹竽(Thaumatococcusdanielli)果實中分離到的甜蛋白序列有較高的同源性而得名，主要包括類索瑪甜蛋白和滲透蛋白(Osmotin)，屬于病程相關(guān)蛋白第5家族，存在于多種植物、動物及微生物中[1-2]，能被多種生物或非生物信號所誘導(dǎo)表達[3]，參與植物的防御反應(yīng)[4-5]。TLP轉(zhuǎn)基因或過表達植物提高了對病原的抗性[6-8]和脅迫環(huán)境的耐受性[8-9]。體外試驗結(jié)果表明TLPs具有抗真菌活性[10]，可通過裂解真菌孢子，抑制孢子萌發(fā)等方式對病原性和非病原性真菌產(chǎn)生抑制作用[1]。TLPs也參與了植物的發(fā)育進程，一些果實成熟時多個TLP基因高表達[11-13]。TLPs在多種水果、農(nóng)作物和花粉中具有致敏原活性[14]。目前，已鑒定出28個擬南芥TLPs、31個水稻TLPs和55個楊樹TLPs[15-16]。研究者發(fā)現(xiàn)，水稻和擬南芥TLP基因存在染色體內(nèi)和染色體間復(fù)制現(xiàn)象[17]，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示TLP基因在生物進化上發(fā)生了不對稱的增加[2]，陸生植物進化過程中TLP基因含量和多樣性得到顯著增加[18]。

目前對TLP家族的研究主要限于擬南芥和水稻等模式植物，而辣椒(Capsicumannuum)中該家族的研究未見報道。辣椒屬于茄科辣椒屬，原產(chǎn)墨西哥，因其維生素C含量高以及食藥等多重特殊功效，在世界各國普遍栽培。辣椒苗期、成株期均易發(fā)生多種病害，往往造成辣椒生產(chǎn)上毀滅性的損失[19-20]。為全面了解辣椒基因組中TLP家族基因結(jié)構(gòu)和功能特征，本研究從基因組水平上分析TLP家族基因的數(shù)目和結(jié)構(gòu)、染色體位置分布、啟動子區(qū)順式作用元件、蛋白保守基序、系統(tǒng)進化及時空表達，為進一步研究該家族成員的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 辣椒TLP家族數(shù)據(jù)獲取與鑒定

辣椒(C.annuum)基因組大小為2 936 Mb，分布于12條染色體[21]。以典型TLP蛋白1Z3Q(Musaacuminate)為探針，分別搜索GenBank辣椒蛋白數(shù)據(jù)庫和辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(http://peppersequence.genomics.cn)，候選蛋白序列在SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)中對蛋白功能域進行確認(rèn)，剔除重復(fù)序列和不含索馬甜家族典型結(jié)構(gòu)域(Thaumatin，THN)序列。

1.2 辣椒TLP蛋白理化特性分析

蛋白質(zhì)生理生化特征通過Expasy(http://www.expasy.org/tools/)預(yù)測，蛋白質(zhì)信號肽使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測，蛋白質(zhì)疏水性使用Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測。

1.3 辣椒TLP基因及其染色體定位分析

辣椒TLP蛋白對應(yīng)的基因序列和編碼序列(Coding sequence，CDS)從辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中下載。使用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。通過MEME SUITE在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測辣椒TLPs序列的保守基序，基序搜索數(shù)目為5，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。通過Mapinspect(http://mapinspect.software.informer.com/)繪制染色體基因位置分布圖。

1.4 辣椒TLP蛋白氨基酸序列比對與系統(tǒng)進化分析

使用Clustal X對TLP蛋白氨基酸序列進行比對，應(yīng)用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。NJ進化樹分析步長值為1 000，采用泊松校驗(Poisson correction)的方法計算距離，其余參數(shù)取默認(rèn)值。

1.5 辣椒TLP基因啟動子區(qū)特征分析

通過GenBank數(shù)據(jù)庫獲取辣椒TLP家族基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 kb序列，通過PlantCARE(http://oberon.fvms.ugent.be:8080/PlantCARE/)數(shù)據(jù)庫進行基因啟動子區(qū)順式作用元件分析。

1.6 辣椒TLP基因時空表達分析

從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[22]，組織特異性取樣部位為根、莖、葉、蕾、花和9個發(fā)育時期的果實，果實9個發(fā)育時期為F-Dev1(自花授粉階段)、F-Dev2(果實長度1～3 cm)、F-Dev3(果實長度3～4 cm)、F-Dev4(果實長度4～5 cm)、F-Dev5(果實青熟階段)、F-Dev6(果實成熟階段)、F-Dev7(果實成熟后3 d)、F-Dev8(果實成熟后5 d)和F-Dev9(果實成熟后7 d)。使用HemI 1.0軟件繪制基因表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒TLP家族成員的鑒定

本研究鑒定了28個具有THN結(jié)構(gòu)域的辣椒TLP家族成員(表1)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，最長的蛋白質(zhì)序列Capana08g002709包含400個氨基酸殘基，最短的Capana01g002559包含191個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)分子量介于20 721～40 535，蛋白質(zhì)等電點介于 4.29～8.72，酸性蛋白占60.71%，且多數(shù)為疏水蛋白。

序列比對分析發(fā)現(xiàn)，26個辣椒TLPs均含有16個半胱氨酸殘基，成員Capana01g002559氨基酸數(shù)目較少，缺少前端信號肽序列，只含有15個半胱氨酸殘基，成員Capana04g002384的C端包含跨膜序列，僅含有9個半胱氨酸殘基。所有成員均具有索瑪甜家族標(biāo)簽和保守的REDDD氨基酸殘基，后者有助于蛋白質(zhì)維持適當(dāng)?shù)娜S構(gòu)象和保持酸裂周圍的表面靜電勢，對TLPs抗真菌活性至關(guān)重要[23]。

2.2 辣椒TLP家族基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化分析

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，辣椒TLP家族基因主要有4種類型(圖1)，其中不含內(nèi)含子和含有1個、2個和3個內(nèi)含子的基因數(shù)目分別為11、9、6和2，含有1個內(nèi)含子的基因主要為1型相位類型，含有2個內(nèi)含子的基因主要為1～2型相位組合類型。同一聚類組中內(nèi)含子相位類型一致的基因可能來源于同一祖先基因或可能新近發(fā)生了基因復(fù)制擴張事件，而內(nèi)含子相位不同的基因可能是發(fā)生了內(nèi)含子單獨獲取或丟失的結(jié)果。

對辣椒TLP家族保守氨基酸基序分析，發(fā)現(xiàn)5類基序的保守性較強，分別為基序 1(TCGPTDYSKFFKQACPDAYSYAYDD)、基序 2(LDFYDVSLVDGFNLPMSVSPT)、基序 3(TWSGRIWGRTGCNFD)、基序 4(VVGCKSACTAFGTDZYCCTGG)和基序 5(VNNCPYTVWPGILPGAGGAQL)。同一聚類組的辣椒TLPs含有的保守基序一致。28條序列含有基序 2和基序 3，27條序列含有基序 1、基序 4和基序 5。說明該家族蛋白保守性較強。

為全面了解辣椒TLP基因與其他物種同源基因的進化關(guān)系，分別選取了擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和楊樹(Populustrichocarpa)各10個TLPs與辣椒28個TLPs一起構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹(圖2)。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果[2,16]相似，代表性的擬南芥、水稻和毛果楊的10個TLPs分別屬于10個聚類組，辣椒TLPs分布在除聚類組1和4外的其他8個聚類組中。其中聚類組5中包含10個辣椒TLPs，成員最多，其他物種該聚類組的TLPs與植株對病原或環(huán)境脅迫響應(yīng)有關(guān)，具有抑菌或葡糖苷酶活性[8-9]，聚類組5中的辣椒TLPs可能也具有類似活性，具體功能有待深入研究。其次為聚類組6，包含5個辣椒TLPs成員。

表1辣椒中TLP家族信息

Table1TheinformationofpepperTLPfamily

編號氨基酸長度(aa)分子量等電點總平均疏水指數(shù)Capana00g000465252273147.87-0.061Capana00g001983231248108.72-0.077Capana01g000278223242508.57-0.355Capana01g000279230250836.54-0.356Capana01g000280228249584.99-0.268Capana01g000281229252237.36-0.237Capana01g000283251271558.45-0.278Capana01g000284250267927.84-0.285Capana01g000285250274356.18-0.306Capana01g000288253277796.49-0.291Capana01g002559191207214.76-0.241Capana02g002572332344074.63-0.011Capana02g002575303308084.290.258Capana03g001796297314875.200.086Capana04g000180250267574.49-0.204Capana04g000181325339355.03-0.102Capana04g000429249259174.880.023Capana04g001741267288338.24-0.098Capana04g002337303315624.770.054Capana04g002384276296458.040.301Capana05g002197226241118.06-0.101Capana06g000760252262844.540.207Capana08g001931241259015.23-0.117Capana08g002705253270788.100.039Capana08g002709400405364.39-0.116Capana10g001695245260807.370.090Capana12g001167227248384.88-0.284Capana12g001168227248384.88-0.284

2.3 辣椒TLP家族基因染色體位置分析

基因染色體位置分布分析結(jié)果顯示，辣椒TLP基因分布在9條染色體上(圖3)。其中最多的1號染色體上有9個TLP基因，其次為4號染色體，而3號、5號、6號和10號染色體上分別只有1個TLP基因。分析發(fā)現(xiàn)，辣椒TLP基因在多條染色體上存在聚集現(xiàn)象，如在1號染色體的5 Mb和167 Mb、2號染色體147 Mb、4號染色體的2 Mb、8號染色體的151 Mb以及12號染色體的52 Mb位置都存在2個或2個以上的基因集中分布的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，聚類組5中的成員來自1號和12號染色體，在染色體上的位置臨近，且基因中均僅含有1個外顯子，說明這些基因可能來源于共同的祖先基因，是染色體內(nèi)或染色體間基因復(fù)制的結(jié)果。

圖1 辣椒TLP家族聚類樹與基因結(jié)構(gòu)Fig.1 The unrooted phylogenetic tree and gene structure of TLP family in pepper

AT開頭的為擬南芥TLP蛋白氨基酸序列;Os開頭的為水稻TLP蛋白氨基酸序列;gw開頭的為楊樹TLP蛋白氨基酸序列(序列g(shù)w.IX0046全稱為estExt_fgenesh4_kg.C_LG_IX0046);TLPs聚類組編號參照文獻[2]和[15]。圖2 辣椒與擬南芥、水稻、楊樹TLP家族系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of pepper, arabidopsis, rice, poplar TLPs

圖3 辣椒TLP家族基因在染色體上的位置分布Fig.3 The chromosome location of pepper TLP genes

2.4 辣椒TLP家族基因啟動子區(qū)特征分析

本研究對辣椒TLP家族基因上游1 kb啟動子區(qū)順式作用元件進行了分析，發(fā)現(xiàn)多個激素響應(yīng)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件和增強啟動元件等(表2)。激素響應(yīng)元件包括脫落酸(ABRE)、茉莉酸(CGTCA-motif)、赤霉素(GARE-motif)、水楊酸(TCA-element)等響應(yīng)元件，這些元件的存在說明這些基因處在激素調(diào)控的下游，可能在特定的信號通路中發(fā)揮作用。非生物脅迫元件包括熱激響應(yīng)元件(HSE)、干旱脅迫(MBS)和防御性響應(yīng)元件(TC-rich repeats)，這些元件的存在說明這些基因在植物應(yīng)對高溫、干旱和其他環(huán)境脅迫過程中起作用。還有部分基因含有病原響應(yīng)元件W box，可能在植物應(yīng)對病原微生物等生物脅迫過程中發(fā)揮作用。所有成員均含有多個啟動增強(CAAT-box)和核心啟動子(TATA-box)元件，說明該家族基因具有較強的表達潛力。

2.5 辣椒TLP家族基因組織表達分析

通過Qin等[22]發(fā)表的辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對TLP家族基因在辣椒中的時空表達進行分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)TLP基因表達數(shù)值較高。其中基因Capana01g000283、Capana01g000284、Capana00g000465、Capana04g000181、Capana08g002705在檢測的所有組織和時期均表現(xiàn)出較強的表達，分別屬于聚類組3、聚類組5、聚類組6，而基因Capana01g002559、Capana08g001931和Capana06g000760在多數(shù)組織和發(fā)育時期均表達較弱，分別屬于聚類組8和聚類組10?；駽apana01g000281在辣椒組織中表達較高，而在果實發(fā)育各個時期均不表達?；駽apana00g001983、Capana01g000180、Capana04g001741、Capana08g002709和Capana10g001695在果實成熟后表達較低或不表達?；駽apana04g002337和Capana04g002384在辣椒器官中表達較低或不表達，而在果實發(fā)育的部分階段有一定的表達。

3 討 論

TLPs廣泛分布于微生物、植物及動物中[1-2]，超過20個來自不同物種的TLPs具有抗真菌活性[15]。研究結(jié)果表明，TLP轉(zhuǎn)基因作物顯著提高了對病原真菌的抗性和對多種非生物脅迫的耐受性[8]。本研究共獲得28條辣椒TLPs序列，主要有4種基因結(jié)構(gòu)類型，基因結(jié)構(gòu)類型相對單一，同一聚類組中的基因結(jié)構(gòu)一致，說明該家族基因保守性較強。

表2辣椒TLP家族基因啟動子區(qū)順式作用元件信息

Table2Informationaboutputativecis-actingelementsinthe1kbupstreampromoterregionofpepperTLPgenes

基因ABRECAAT-boxCGTCA-motifGARE-motifGATA-motifHSEMBSTATA-boxTCA-elementTC-richrepeatsWboxCapana00g000465341Capana00g0019831231241Capana01g000278113371Capana01g00027927113411Capana01g00028035125721Capana01g0002813221511Capana01g0002831319514Capana01g000284120112762Capana01g00028512527511Capana01g0002882951111Capana01g0025592811481Capana02g00257224123711Capana02g0025751721130221Capana03g001796101112401Capana04g0001801811145113Capana04g00018125116921Capana04g00042922151111Capana04g0017412311149121Capana04g00233717214812Capana04g0023841712611Capana05g002197111391Capana06g0007602711232Capana08g00193111612232Capana08g0027052135Capana08g00270912832316Capana10g00169525111383Capana12g001167291135Capana12g001168291135總計86061612917191235202810

ABRE：脫落酸響應(yīng)元件；CAAT-box：啟動增強元件；CGTCA-motif：茉莉酸響應(yīng)元件；GARE-motif：赤霉素響應(yīng)元件；HSE：熱激響應(yīng)元件；MBS：干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點；TATA-box：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)-30 bp核心啟動子元件；TCA-element：水楊酸響應(yīng)元件；TC-rich repeats：防御和脅迫響應(yīng)元件；W box：受傷和真菌激發(fā)響應(yīng)元件。

圖中數(shù)據(jù)為TLP基因在不同組織和果實9個發(fā)育時期的表達，表達倍數(shù)經(jīng)過lg2處理，圖中顏色越深表示相對表達越強。a：根；b：莖；c：葉；d：蕾；e：花；f：自花授粉階段；g：果實長度1～3 cm；h：果實長度3～4 cm；i：果實長度4～5 cm；j：果實青熟階段；k：果實成熟階段；l：果實成熟后3 d；m：果實成熟后5 d；n：果實成熟后7 d。圖4 辣椒TLP家族基因的表達Fig.4 The expression of pepper TLP gene family

系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，辣椒TLP家族基因主要分為8個聚類組，與擬南芥、水稻和楊樹分組類似[15-16]，說明該家族基因較保守。基因染色體位置分析發(fā)現(xiàn)，辣椒TLP家族多個基因在染色體上存在聚集現(xiàn)象，其中成員最多的聚類組5中的基因主要來自1號和12號染色體，這些結(jié)構(gòu)類型一致的基因可能是進化過程中染色體內(nèi)或染色體間基因復(fù)制的結(jié)果。聚類組5中的其他物種TLPs能響應(yīng)病原或環(huán)境脅迫[24]，該組中辣椒TLPs是否具有類似功能有待進一步研究。

研究結(jié)果表明，TLP基因在植物器官中持續(xù)表達，因該家族成員眾多，導(dǎo)致不同的基因在不同的器官或不同的發(fā)育期表達不同[4,25]。本研究通過分析辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，大部分基因在根中表達較高，該結(jié)果與大豆中部分TLP基因表達類似[26]，水稻中多個OsPR1成員在根中的表達也顯著高于葉中的表達[27]。基因Capana01g000283、Capana01g000284和Capana00g000465在各器官和果實的各發(fā)育期均表達較強，說明其屬于泛表達基因，可能在辣椒整個生命過程中均發(fā)揮作用。部分基因在各器官和果實成熟前表達，而果實成熟后表達較低或不表達，說明這些基因參與了辣椒果實的成熟過程。部分基因在根、莖、葉等器官中表達較低，而在果實成熟的中期表達較高，說明這些基因可能在果實成熟的過程中起作用?？傮w而言，聚類組5和聚類組6中的基因多數(shù)表達較高，而聚類組8和聚類組10中的基因多數(shù)表達較低。以上結(jié)果表明，辣椒TLP家族不同成員在時空表達上具有器官特異性，暗示特定的基因存在著功能的特異性，可能參與了特定器官或生長階段的發(fā)育過程，其具體功能值得深入研究。

對基因啟動子區(qū)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，基因Capana01g000283和Capana01g000284啟動子區(qū)TATA-box數(shù)量較高，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示其在辣椒多個器官中具有較強的表達水平。該家族多數(shù)成員含有多個激素響應(yīng)元件、生物/非生物響應(yīng)元件，不同的家族成員含有的順式作用元件類型和數(shù)量不同，基因Capana02g002575和Capana04g000180啟動子區(qū)均同時含有多個激素和環(huán)境脅迫響應(yīng)元件，說明該家族成員功能復(fù)雜多樣，可能參與了植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫的多種進程，但是具體哪些基因參與了哪些進程值得進一步深入研究。

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