Nrf2介導姜黃素對四氯化碳誘導鯽魚肝損傷的保護作用

張春云， 曹麗萍 , 杜金梁， 賈 睿， 顧?quán)嶇?殷國俊,， Galina Jeney

(1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081； 2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081； 3.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部魚類免疫藥理學國際聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫 214081； 4.Research Institute for Fisheries, Aquaculture and Irrigation, Anna light 8, Szarvas H-4440, Hungary)

近年來中國集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷提高，但也隨之產(chǎn)生諸多問題，如養(yǎng)殖密度過高、過度投喂、養(yǎng)殖水體污染、藥物濫用、飼料營養(yǎng)組分不平衡等，造成魚類病害頻發(fā)，其中以肝損傷為特征的疾病尤為頻繁，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失[1]。肝臟是魚類物質(zhì)和能量代謝的重要器官[2]，肝損傷或病變往往導致魚類機體代謝機能紊亂和抗病力降低，甚至導致死亡。魚類肝損傷致病因素很多，但其共同點為均伴隨著嚴重的氧化應激，產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，破壞細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。因此，有研究者認為可通過抑制肝組織內(nèi)氧化應激或提高抗氧化能力來防治肝損傷[3]。

中草藥由于其毒副作用小，不易在魚體內(nèi)富集，在水產(chǎn)動物病害防治中被廣泛應用。已有研究結(jié)果表明，一些中草藥提取物具有抗氧化作用，對魚類肝膽綜合征肝損傷有一定的治療作用[4-5]。姜黃為常用中草藥，主要來源于姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖。姜黃素為姜黃中主要藥用活性成分，是一種酸性多酚類物質(zhì)。在哺乳動物中，研究證實姜黃素具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗突變[8]、護肝[9-10]等功效。在水生動物中，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可促進魚類生長，改變腸道酶活性[11-12]。

精密肝切片(Precision-cut liver slices，PCLS)技術(shù)是一種新的介于器官與細胞水平間的肝臟體外實驗技術(shù)。該技術(shù)無需使用膠原酶，避免了細胞分離過程中膠原酶對細胞造成的損傷，且能夠保存較完整的組織結(jié)構(gòu)，維持細胞間及細胞與基質(zhì)間的聯(lián)系，既保留了游離肝細胞的功能特點，又維持了組織的完整性，因而能最大限度地模擬體內(nèi)狀態(tài)，被廣泛應用于哺乳動物藥理學和毒理學研究[13-15]。而在水產(chǎn)動物中，通過該技術(shù)研究姜黃素保肝機理的報道還未發(fā)現(xiàn)。

核因子NF-E2相關(guān)因子(Nuclear factor-ery throid 2-related，Nrf2)是機體對抗氧化應激最主要的調(diào)節(jié)因子[16]。正常狀態(tài)下，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)結(jié)合處于相對抑制狀態(tài)。當受到氧化應激刺激時，Nrf2被激活與Keap1解離進入胞質(zhì)啟動Ⅱ相解毒酶及抗氧化基因的表達，隨后Nrf2與抗氧化反應元件(Antioxidant response element, ARE)相結(jié)合，啟動下游相關(guān)抗氧化酶基因表達，使細胞抗氧化應激能力增強[17]。在小鼠中，姜黃素可抑制四氯化碳(CCl4)誘導的肝損傷并促進Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA及蛋白質(zhì)表達[18-19]。在水產(chǎn)生物中還未見相關(guān)報道。

本研究采用PCLS技術(shù)分離鯽魚肝組織，并進行體外培養(yǎng)。以CCl4誘導建立肝組織損傷模型。通過一些肝功能生化指標的變化，評價姜黃素對鯽魚肝組織的保護作用。同時在分子水平探究Nrf2和Keap1基因在姜黃素保肝中的作用，為魚類保肝藥物的研究和開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

鯽魚(Carassiusauratus)取自中國水產(chǎn)科學院淡水漁業(yè)研究中心養(yǎng)魚場。大小規(guī)格為500 g左右，在25 ℃循環(huán)水中飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥品、試劑及儀器

姜黃素(Curcumin)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、1640培養(yǎng)基、鏈霉素和青霉素購自Sigma公司(美國)，胎牛血清(FBS)、48孔板、12孔板購于GIBCOGO公司(美國)，CCl4(分析純)購于國藥集團化學試劑有限公司(上海)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、乳酸脫氫酶(LDH)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所科技有限公司，Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA總RNA抽提試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司(大連)。

1.3 鯽魚肝切片的制備和培養(yǎng)

將鯽魚消毒麻醉后，無菌條件下于超凈臺內(nèi)取肝組織，置于含青鏈霉素混合液(Penicillin-Streptomycin solution)的磷酸鹽緩沖夜(Phosphate buffered solution, PBS)中，持續(xù)通入含95% O2和5% CO2的混合氣體。將肝組織在PBS中清洗3遍，修整肝組織成體積為 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，包埋于低熔點膠內(nèi)進行切片操作，切片厚度為300 μm。選取完整切片置于含5%新生小牛血清(FCS)1640培養(yǎng)基的48孔培養(yǎng)板中，每組4孔，每孔6片，于27 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)備用。

1.4 肝切片分組與處理

將肝組織切片放置48孔板內(nèi)，預培養(yǎng)1 h后，吸出培養(yǎng)基。加入CCl4和不同濃度的姜黃素培養(yǎng)基，觀察姜黃素對四氯化碳致肝損傷的保護作用。分組如下：空白對照組，加入1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，棄培養(yǎng)基，用1640培養(yǎng)基洗1遍，加入新的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集上清液及肝組織切片。CCl4損傷對照組，用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，棄培養(yǎng)基，用1640培養(yǎng)基洗1遍，加入12 mmol/L CCl4繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集上清液及肝組織切片。姜黃素對照組，加入1640培養(yǎng)基養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)基，用1640培養(yǎng)基洗1遍，換10 μg/ml姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集上清液與組織切片。姜黃素處理組，用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度(1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml)姜黃素的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用1640培養(yǎng)基洗1遍后，再加入含12 mmol/L CCl4的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集上清液與組織切片。每組設4個重復。

1.5 生化指標測定

按照試劑盒操作說明分別測定培養(yǎng)上清液中GPT、GOT、LDH、AKP活性，以及肝組織勻漿中SOD、GSH-Px活性和腺苷三磷酸(ATP)、MDA、GSH、TP、Alb含量。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測Nrf2 mRNA和Keap1 mRNA表達

收集肝切片組織，加入適量TRIZOL試劑(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行勻漿，參照RNAiso Reagent (TaKaRa公司產(chǎn)品)說明書提取總RNA。

采用紫外-可見分光光度計(Gene Quant1300)，測定RNA濃度和純度(OD260/OD280值達到 1.8～2.0為符合標準)，用DEPC水調(diào)至適當濃度。RT-PCR反應體系：總RNA 10 μg，OligodT(50 μmol/L) 2 μl，反轉(zhuǎn)錄緩沖液8 μl，dNTP(10 mmol/L) 4 μl，RNase inhibitor(40 U/μl) 1 μl，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl) 1 μl，其余為RNase free dH2O，反應體系總體積40 μl。實時熒光定量PCR反應按照ExScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司產(chǎn)品)說明書，在熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(ABI PRISM7500 sequence detection system)上進行。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s，72 ℃ 45 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。內(nèi)參引物及基因特異引物采用Primer premier 5.0軟件設計，由上海杰瑞生物技術(shù)有限公司合成。目的基因引物序列如下：Nrf2基因正向引物為5′-GCGAGCGTAGCTCCAGTCTGA-3′，反向引物5′-AAGGCTTGCCGTGCTCGTCT-3′；Keap1基因正向引物為5′-TGCGTGTTGTTCGGGCTCCT-3′，反向引物TCTGGGCGTGTTGAGCGGAG-3′；β-actin基因正向引物為5′-TTGAGCAGGAGATGGAACCG-3′，反向引物5′-AGAGCCTCAGGGCAACGGAAA-3′。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0進行處理分析。采用One-Way ANOVA檢驗法進行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對鯽魚肝切片活力的影響

圖1顯示，鯽魚肝切片經(jīng)CCl4處理后ATP含量明顯降低，僅為空白對照的60.8% (P<0.01)。加入不同濃度姜黃素后，肝切片ATP活力明顯上升，姜黃素濃度為1 μg/ml和5 μg/ml時，肝切片ATP活力活性顯著提高(P<0.05)。

2.2 姜黃素對鯽魚肝切片中GPT、GOT、LDH及AKP活性的影響

鯽魚肝切片經(jīng)過CCl4損傷后，引起細胞內(nèi)酶的釋放，培養(yǎng)上清液中GPT、GOT、LDH及AKP的活性明顯增加(P<0.01)(圖2)。姜黃素處理組中，GPT、GOT、AKP及LDH酶活性較CCl4對照組降低，其中1 μg/ml和5 μg/ml姜黃素處理組中，4種酶的活性被顯著抑制(P<0.01或P<0.05)，但10 μg/ml姜黃素對4種酶活性的影響不顯著。

1：空白對照組；2：CCl4損傷對照組(肝切片與12 mmol/L CCl4共培養(yǎng))；3：姜黃素對照組(肝切片與10 μg/ml姜黃素共培養(yǎng))；4：1 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；5：5 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；6：10 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組。*、**分別表示與CCl4對照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖1 姜黃素對CCl4損傷的鯽魚肝切片中ATP含量的影響Fig.1 Effects of curcumin on ATP content in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

2.3 姜黃素對鯽魚肝切片中Alb、TP含量的影響

圖3表明，與空白對照組相比，鯽魚肝組織中TP、Alb含量因CCl4的作用而明顯下降(P<0.01)。用5 μg/ml姜黃素處理后， 鯽魚肝切片中TP、Alb含量顯著高于CCl4對照組。

2.4 姜黃素對鯽魚肝切片中SOD、CAT、POD活性及總抗氧化能力(T-AOC)的影響

CCl4可顯著降低鯽魚肝組織中SOD、CAT、POD活性和T-AOC(圖4)。而1 μg/ml姜黃素處理后，SOD、CAT、POD活性及T-AOC均明顯升高(P<0.05), 同時5 μg/ml姜黃素處理后，POD和CAT活性也顯著提高。

1：空白對照組；2：CCl4損傷對照組(肝切片與12 mmol/L CCl4共培養(yǎng))；3：姜黃素對照組(肝切片與10 μg/ml姜黃素共培養(yǎng))；4：1 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；5：5 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；6：10 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組。*、**分別表示與CCl4對照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖2 姜黃素對CCl4損傷的鯽魚肝切片中GPT、GOT、LDH及AKP酶活性的影響Fig.2 Effects of curcumin on GPT, GOT, LDH and AKP activities in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

1：空白對照組；2：CCl4損傷對照組(肝切片與12 mmol/L CCl4共培養(yǎng))；3：姜黃素對照組(肝切片與10 μg/ml姜黃素共培養(yǎng))；4：1 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；5：5 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；6：10 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組。*、**分別表示與CCl4對照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖3 姜黃素對CCl4損傷的鯽魚肝切片中Alb和TP含量的影響Fig.3 Effects of curcumin on contents of Alb and TP in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

1：空白對照組；2：CCl4損傷對照組(肝切片與12 mmol/L CCl4共培養(yǎng))；3：姜黃素對照組(肝切片與10 μg/ml姜黃素共培養(yǎng))；4：1 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；5：5 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；6：10 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組。*、**分別表示與CCl4對照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖4 姜黃素對CCl4損傷的鯽魚肝切片中SOD、CAT、POD活性及總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig.4 Effects of curcumin on the activities of SOD, CAT and POD and total antioxidant capacity (T-AOC) in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

2.5 姜黃素對鯽魚肝切片中GSH-Px活性及GSH和MDA含量的影響

圖5顯示，CCl4可顯著降低GSH-Px活性和GSH含量，導致MDA大量生成(P<0.05)。與CCl4對照組相比，1 μg/ml姜黃素顯著抑制GSH-Px活性和GSH含量的降低。MDA含量在不同濃度姜黃素處理組中也顯著降低(P<0.05)。

1：空白對照組；2：CCl4損傷對照組(肝切片與12 mmol/L CCl4共培養(yǎng))；3：姜黃素對照組(肝切片與10 μg/ml姜黃素共培養(yǎng))；4：1 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；5：5 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；6：10 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組。*、**分別表示與CCl4對照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖5 姜黃素對CCl4損傷的鯽魚肝切片中GSH-Px活性及GSH和MDA含量的影響Fig.5 Effects of curcumin on GSH-Px activity and contents of GSH and MDA in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

2.6 姜黃素對鯽魚肝切片中Nrf2、Keap1 mRNA表達的影響

與空白對照相比，CCl4顯著抑制了Nrf2、Keap1基因表達(圖6)。而姜黃素處理后，Nrf2基因表達量明顯提升，但姜黃素對Keap1基因表達量無明顯影響。

1：空白對照組；2：CCl4損傷對照組(肝切片與12 mmol/L CCl4共培養(yǎng))；3：姜黃素對照組(肝切片與10 μg/ml姜黃素共培養(yǎng))；4：1 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；5：5 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組；6：10 μg/ml姜黃素+12 mmol/L CCl4處理組。*、**分別表示與CCl4對照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖6 姜黃素對CCl4損傷的鯽魚肝切片中Nrf2及Keap1基因表達量的影響Fig.6 Effects of curcumin on Nrf2 and Keap1 gene expression in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

3 討 論

CCl4是一種常見的肝臟毒物，可誘導肝細胞或組織構(gòu)建損傷模型[20-21]。本實驗室前期的研究結(jié)果顯示，CCl4也適用于魚類肝損傷模型的構(gòu)建[22]。 CCl4主要是經(jīng)過細胞色素P450酶進行代謝，產(chǎn)生三氯甲基和氯自由基，引起脂質(zhì)過氧化，最終導致肝細胞壞死[23]。本試驗通過CCl4損傷鯽魚肝切片，探討姜黃素對肝組織的保護作及對Nrf2-ARE抗氧化通路的影響。

腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP) 是生物體內(nèi)組織細胞生命活動所需能量的直接來源，ATP含量的變化直接影響器官的能量代謝[24]。細胞內(nèi)缺少ATP，會導致?lián)p傷甚至死亡。因此，ATP含量常作為評價器官活力的重要指標[25]。本試驗中，CCl4處理后，肝切片活力明顯降低，而經(jīng)不同濃度的姜黃素處理后，肝切片活力有所上升。表明姜黃素可有效抑制四氯化碳對肝組織的損傷。

GPT和GOT為肝臟內(nèi)兩種轉(zhuǎn)氨酶，當肝細胞受到損傷或膜通透性增大時，該酶就會從肝細胞漿中逸出細胞外[26]。GPT活性升高表明胞漿受損，細胞膜通透性增加，GOT活性升高表明肝細胞線粒體受損[27-28]。本試驗中，經(jīng)CCl4處理后，肝切片培養(yǎng)上清液中GPT、GOT、LDH及AKP活性明顯上升，表明肝細胞受到損傷。而用姜黃素干預后，這些酶活性顯著降低，表明姜黃素可促進鯽魚肝細胞膜系統(tǒng)的修復。在小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，Naik等[29]用酒精誘導小鼠肝組織損傷后，GPT、GOT和LDH活性顯著升高，而用姜黃素處理后，這些酶活性顯著降低。

白蛋白(Albumin, Alb)的合成與分泌是由肝臟實質(zhì)部分完成的。當肝臟受到自由基(ROS)損害時，機體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整性被破壞[30]，蛋白質(zhì)的合成速率降低。試驗結(jié)果表明CCl4可明顯降低蛋白質(zhì) (Alb、TP) 含量，這與Folmar等[31]研究結(jié)果一致。姜黃素處理顯著抑制CCl4誘導的Alb和TP含量降低，與寧康健等[32]研究結(jié)果類似，說明姜黃素可以促進蛋白質(zhì)合成，保護受損傷的肝組織。

諸多研究結(jié)果表明，魚類肝損傷與抗氧化系統(tǒng)的破壞以及脂質(zhì)過氧化有關(guān)[32-33]。在魚類中，CCl4可誘導大量ROS形成，導致抗氧化物質(zhì)如SOD、CAT和GSH等的大量消耗。同時ROS還可以攻擊細胞膜，引起脂質(zhì)過氧化，導致細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的變化[34]。本試驗中也有類似現(xiàn)象，當鯽魚肝切片在CCl4中暴露4 h后，其抗氧化物質(zhì)(SOD、CAT、POD、GSH-Px活性及GSH含量和T-AOC)顯著降低，同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，這些變化反映了肝細胞受自由基損壞的程度[35]。在哺乳動物中，姜黃素的保肝作用主要與其抗氧化能力相關(guān)[36]。姜黃素通過提高機體抗氧化能力，減少細胞膜受到的損傷，同時改善脂質(zhì)過氧化作用，發(fā)揮保護肝臟的作用[37-38]。Magda等[39]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以顯著抑制酒精誘導的肝細胞損傷中抗氧化酶(SOD、CAT及GSH-Px)活力的降低。鐘越等[37]也報道姜黃素對CCl4誘導的脂質(zhì)過氧化物MDA的產(chǎn)生具有顯著的抑制作用。本試驗結(jié)果顯示，1 μg/ml和5 μg/ml姜黃素可抑制鯽魚肝組織中抗氧化酶(SOD、CAT、POD和GSH-Px)活性以及GSH含量的降低，有利于清除由CCl4誘導產(chǎn)生的自由基，進而降低脂質(zhì)過氧化物的形成，保護肝細胞。

Keap1-Nrf2/ARE信號通路對抗氧化酶表達起著調(diào)控的作用[39-40]，其中Nrf2是該通路中的關(guān)鍵因子。在細胞質(zhì)中Nrf2與其負調(diào)控蛋白Keap1偶聯(lián)后以失活狀態(tài)固定于胞質(zhì)內(nèi)，在自由基的作用下，Keap1結(jié)構(gòu)改變，與Nrf2解偶聯(lián)通過氧化應激調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，激活抗氧化反應元件(ARE)和抗氧化酶Ⅱ相解毒酶，啟動下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄[41-43]，調(diào)控細胞內(nèi)抗氧化酶的表達，因而Keap1-Nrf2信號通路是抗氧化應激機制中較為重要的通路[44-45]。CCl4誘導大鼠肝損傷中，增強Nrf2蛋白表達可顯著提高抗氧化酶活性，有效改善肝組織損傷程度[46-47]。本試驗結(jié)果顯示，CCl4損傷后，鯽魚肝組織Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA相對含量明顯低于空白對照，同時對應的抗氧化酶(SOD、GSH-Px、POD及CAT)活性也明顯降低，表明CCl4誘導的自由基，抑制Keap1基因表達，同時促使Nrf2移出細胞核，導致機體中抗氧化酶表達水平降低[48]。用姜黃素處理后，肝細胞中Nrf2 mRNA水平升高，其效果隨著劑量升高而增加，而Keap1 mRNA增加趨勢不明顯，說明姜黃素主要通過促進Nrf2基因表達，促進抗氧化酶產(chǎn)生，抑制肝細胞受損。

總之，本研究中1 μg/ml和5 μg/ml姜黃素對CCl4致鯽魚肝損傷具有保護作用，其作用機制可能與姜黃素激活Keap1/Nrf2-ARE通路，促進抗氧化蛋白生成，增強機體對自由基清除能力有關(guān)。但是，高濃度(10 μg/ml)的姜黃素保肝作用不明顯，其原因還需進一步研究。

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