家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫構(gòu)建及其毒素-16序列和活性分析

卓城潔， 袁 萌， 伍文攀， 鄧娟華， 喻振國， 向小亮， 胡朝暾

(懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院/民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008)

近年來隨著研究的不斷深入，蜘蛛毒素的重要性日益顯現(xiàn)。蜘蛛毒素的專一性和高效性使其成為潛在的新型藥物、離子通道工具試劑和殺蟲劑等領(lǐng)域重要的原料來源[1-2]，其在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、神經(jīng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、天然藥物開發(fā)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。由于蜘蛛毒液分泌量很少，且其毒液是由很多性質(zhì)不同、含量差異很大的成分組成的混合物，除了幾個(gè)主要成分外，大多數(shù)成分在粗毒中含量很低，因此很難獲得足夠的單體毒素用于相關(guān)研究[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用毒腺cDNA 文庫的構(gòu)建結(jié)合基因工程表達(dá)的方法可以有效解決毒素來源問題。近十年來，已經(jīng)構(gòu)建了很多有毒動物毒腺cDNA文庫[4-9]，獲得了大量的編碼毒素的ESTs序列。

疼痛是世界醫(yī)學(xué)面臨的重大難題，也是急需攻克的頑固性疾病。目前，這種疾病嚴(yán)重影響到數(shù)百萬人的生命[10]。研究發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉通道的改變與炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)[11]。能阻斷這些鈉通道亞型的成分具有開發(fā)成為治療疼痛的藥物分子的潛能。由于蜘蛛毒素是一類主要作用于離子通道及具有特定藥理學(xué)特性的多肽毒素[12-13]，因此，從蜘蛛粗毒中篩選一些治療疼痛的藥物分子成為研究人員夢寐以求的事情。家福捕鳥蛛是一種生活在廣西、云南等地的蜘蛛新種。本實(shí)驗(yàn)室最先對該蜘蛛毒素進(jìn)行了研究[14]。目前，未見家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫相關(guān)研究的報(bào)道。為了闡明家福捕鳥蛛毒素的分子多樣性和獲得其毒素序列，構(gòu)建了一個(gè)定向的毒腺全長cDNA 文庫，獲得了752條高質(zhì)量的EST序列，并開展了EST聚類分析。另外，從家福捕鳥蛛粗毒中篩選到了1種對DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道具有明顯抑制作用的毒素分子(命名為JF-16)，并對該毒素進(jìn)行了序列分析和活性測定。這些試驗(yàn)的開展為家福捕鳥蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組以及JF-16潛在鎮(zhèn)痛活性分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 家福捕鳥蛛捕自廣西寧明縣、SD大鼠購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物房。

1.1.2 試劑 cDNA文庫試劑盒為Clontech公司產(chǎn)品,Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品,DNA Marker、焦碳酸二乙酯、氯霉素、NaOH、葡萄糖、冰乙酸、KCl、MgCl2、溴化乙錠、溴酚藍(lán)、甘油、蛋白酶K、乙醇、氯仿、異丙醇等購自上海生工生物工程有限公司，RNase Free的槍頭和離心管為Axygen公司產(chǎn)品,三氟乙酸(Trifluoroacetic acid ,TFA)、河豚毒素、α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CCA)、胰蛋白酶、膠原酶、胰蛋白酶抑制劑、HEPES 、EGTA 、D-glucose 、氯化銫 、氫氧化銫等購自Sigma公司，色譜純乙腈購自湖南化工研究所，其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器 PCR儀和電泳儀均為bio-rad公司產(chǎn)品，MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜儀為Bruker公司產(chǎn)品， U-2000型紫外-可見分光光度計(jì)購自Hitachi公司，真空冷凍干燥機(jī)為Thermo Savant公司產(chǎn)品，Waters Alliance 2695高效液相色譜儀為美國Waters公司產(chǎn)品， EPC-10膜片鉗儀為德國HEKA公司產(chǎn)品，491型蛋白質(zhì)測序儀為美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品，高速冷凍離心機(jī)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與分析 將解剖的家福捕鳥蛛毒腺加入到研缽中液氮研磨30 min至粉狀。采用Trizol試劑提取總RNA，用核酸測定儀測定總RNA在260 nm、280 nm處的吸光值，計(jì)算OD260/OD280的值?？俁NA的純度和完整性通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳來檢測。

1.2.2 家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫構(gòu)建 以總RNA為模板，按照SMARTTM cDNA Library Construction Kit (Clontech) 試劑盒說明書方法合成cDNA第一條鏈，采用LD-PCR法擴(kuò)增合成雙鏈cDNA。將合成的雙鏈cDNA進(jìn)行蛋白酶K消化及SfiI酶切。酶切后雙鏈cDNA用CHROMASPIN- 400 柱分級分離，選取優(yōu)化的cDNA用T4 DNA 連接酶連接到載體。用電轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coliHST08，將轉(zhuǎn)化后的宿主菌接種到含氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫。

1.2.3 cDNA 文庫的滴度測定和插入片段檢測 從文庫中取1.0 μl 細(xì)菌培養(yǎng)液，分別稀釋不同倍數(shù)，再從中取1 μl稀釋菌液與200 μl LB液體培養(yǎng)基混勻后分別涂布于含氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h 后計(jì)算菌落生長個(gè)數(shù)并計(jì)算文庫滴度。隨機(jī)選取16個(gè)單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)得到插入片段。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；4 ℃冷卻。反應(yīng)完成后，取5 μl產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將符合要求的單克隆菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 EST 序列分析和功能預(yù)測 將測序的序列處理后得到高質(zhì)量的EST序列。利用DNAStar 軟件對EST序列進(jìn)行聚類分析。應(yīng)用在線分析軟件Translate tool(http://www.expasy.org/tools/dna.html)對測序獲得的EST序列進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列分析。EST及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，可以獲取與目的序列匹配的序列信息及功能注釋。

1.2.5 家福捕鳥蛛毒液采集和JF-16的分離純化 按文獻(xiàn)[3]的方法采集毒液，采集得到的家福捕鳥蛛毒液冷凍干燥后為粗毒。粗毒用超純水配制成濃度為10 mg/ml的溶液，8 000 r/min離心15 min。毒液經(jīng)RP-HPLC分離純化，上樣量為100 μl。反相柱為C18柱 (Phenomenex 100 ?, 4.6 mm×250 mm, 5 μm)。洗脫液A為含0.1 % TFA的水溶液，洗脫液B為含0.1% TFA的乙腈溶液。在50 min內(nèi) 0～50%洗脫液B的線性梯度洗脫，流速為1.0 ml/min ，柱溫40 ℃，在215 nm下收集洗脫峰冷凍干燥或質(zhì)譜分析。

1.2.6 JF-16的MALDI-TOF分析 質(zhì)譜分析在MALDI-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行。N2激光器，離子源加速電壓為20 kV，檢測電壓16.5 kV，激光波長337 nm，陽離子模式。用含0.1 % TFA 的50 % 乙腈溶液溶解CCA基質(zhì)至終濃度為10 mg/ml，取 0.5 μl樣品與1.0 μl CCA基質(zhì)液混合，再取0.5 μl混合液點(diǎn)樣室溫干燥后質(zhì)譜鑒定。使用外標(biāo)(混合標(biāo)準(zhǔn)樣品)進(jìn)行校正。

1.2.7 大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的急性分離培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

1.2.8 鈉電流的全細(xì)胞膜片鉗記錄 將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為細(xì)胞外液，20～25 ℃置于倒置顯微鏡下選擇質(zhì)膜光滑飽滿的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞模式(Whole-cell)膜片鉗試驗(yàn)。玻璃電極經(jīng)電極拉制儀(PC-10，Narishige)兩步拉制后熱拋光，加電極內(nèi)液后電阻為 1.8～3.0 MΩ。電極內(nèi)液：CsCl 145 mmol/L，MgCl24 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，ATP-Mg 2 mmol/L，用1 mol/L CsOH 調(diào)節(jié)pH至7.2。細(xì)胞外液：NaCl 145.0 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，D-glucose 10.0 mmol/L，用1 mol/L NaOH調(diào)至7.2。2種溶液都用蔗糖調(diào)至280 mOsm/L。試驗(yàn)細(xì)胞形成穩(wěn)定電流后經(jīng)過3 kHz和10 kHz的雙重過濾，采用P/4程序刪除電容電流和線性漏電流。采用低壓微量進(jìn)樣器施加毒素。毒素先配制成1 mmol/L的母液，-20 ℃儲存。試驗(yàn)時(shí)稀釋至目的濃度，加藥劑量為10 μl。

1.2.9 JF-16的氨基酸序列測定 氨基酸序列分析是利用Edman降解原理，在Perkin Elmer Procise 491A型氣相測序儀上進(jìn)行的。選用碘乙酰胺烷基化修飾后的毒素肽作為測序樣品。根據(jù)毒素分子量大小設(shè)定測序循環(huán)數(shù)。

1.2.10 JF-16的cDNA序列分析 根據(jù)JF-16 Edman降解測定的氨基酸序列和EST編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對，找到JF-16的cDNA序列。應(yīng)用在線分析軟件SignalP 4.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行JF-16 前體信號肽預(yù)測。根據(jù)Von等[16]的方法確定JF-16前體肽酶切割位點(diǎn)。根據(jù)在線分析軟件(http://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算JF-16成熟肽序列的理論等電點(diǎn)和理論分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取與分析

Trizol提取的家福捕鳥蛛毒腺總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測, 測得總RNA 的OD260/OD280=1.87，比值在 1.8～2.0，說明家福捕鳥蛛毒腺總RNA純度較好。總RNA 濃度為0.49 μg/μl。總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后顯示出28S、18S和5S 3個(gè)條帶(圖1)。從圖譜中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，表明家福捕鳥蛛毒腺總RNA提取成功。

M：Marker。圖1 家福捕鳥蛛毒腺總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA from venom glands of Selenocosmia jiafu

2.2 雙鏈cDNA的合成和片段大小的選取

取1.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，再以第一鏈產(chǎn)物為模板通過長距離PCR合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，條帶分布在 300～3 000 bp，且在 400～750 bp區(qū)域形成亮帶 (圖2)。雙鏈cDNA經(jīng)蛋白酶K和SfiI酶切消化，再通過CHROMASPIN-400柱分離并收集液滴，最后從每1管中取出適量樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，保留 400～750 bp (短片段部分，主要是毒素基因)和 750～2 000 bp(長片段部分，主要是細(xì)胞蛋白基因)兩部分(圖3)。保留這兩部分片段是基于下列考慮：研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛毒素主要是由 20～65個(gè)氨基酸殘基組成的多肽類毒素。根據(jù)毒素氨基酸殘基數(shù)目大致估計(jì)其前體肽的大小，再加上5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)部分，最終估算家福捕鳥蛛毒素cDNA片段大小大致在400～750 bp。另外，蜘蛛毒腺完成毒液的合成和分泌等生命活動需要很多相關(guān)蛋白質(zhì)參與。因此，保留長片段部分是為了得到相關(guān)蛋白質(zhì)的信息，以期對蜘蛛毒腺分泌毒液的機(jī)理有初步的了解。

M：Marker。圖2 家福捕鳥蛛毒腺雙鏈cDNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of double-stranded cDNA from venom glands of S. jiafu

M：Marker；a：400～750 bp；b：750～2 000 bp。圖3 家福捕鳥蛛毒腺雙鏈cDNA柱分離后電泳圖Fig.3 Electrophoresis of double-stranded cDNA from venom glands of S. jiafu by column separation

2.3 文庫庫容和插入片段大小分析

將家福捕鳥蛛毒腺cDNA進(jìn)行放大培養(yǎng)檢測，結(jié)果顯示短片段部分cDNA文庫的初級文庫滴度為 2.0×107CFU/ml，長片段部分cDNA文庫的初級文庫滴度為 1.4×106CFU/ml，均符合cDNA文庫構(gòu)建的要求(一般要求文庫滴度在 1.0×105CFU/ml以上即為有效庫容)。長片段和短片段各隨機(jī)抽取16個(gè)克隆進(jìn)行插入片段大小檢測。圖4為插入片段電泳檢測圖，從圖中可知短片段長度為 400～750 bp，平均長度約500 bp，長片段長度為 750～2 000 bp，平均長度為1 500 bp。

A:400～750 bp 插入片段電泳圖;B:750～2 000 bp 插入片段電泳圖。圖4 家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫插入片段電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the inserted fragments of cDNA library from venom glands of S. jiafu

2.4 EST序列分析和功能預(yù)測

選取899個(gè)短片段菌落和400個(gè)長片段菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，最后獲得高質(zhì)量的EST序列752條。752條EST經(jīng)聚類分析得到257個(gè)唯一序列(Unique sequence)，其中61個(gè)重疊群(Contigs)和196個(gè)單一序列(Singletons)。61個(gè)重疊群中，2個(gè)重疊群包含50條以上的ESTs，4個(gè)重疊群包含 20～49條ESTs，9個(gè)重疊群包含 10～19條ESTs，46個(gè)重疊群包含 2～9條ESTs。752條EST序列中毒素序列438條(毒素序列必須同時(shí)滿足2個(gè)條件：序列含有信號肽和含有4個(gè)或4個(gè)以上半胱氨酸)，普通蛋白序列220條，另外有94條序列沒有匹配到相似的序列。

EST序列的豐度能反映該轉(zhuǎn)錄組的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。因此，按EST序列重復(fù)數(shù)高低將EST序列的豐度分成5個(gè)區(qū)段。(1)≥50 ESTs：包含2個(gè)重疊群，每個(gè)重疊群含50條以上的EST序列，這是家福捕鳥蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組中最豐富的部分，該2族占所有族的比例為0.78%(2/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例卻高達(dá)21.94% (165/752)，這2個(gè)重疊群全部是毒素基因。(2) 20～49 ESTs：包含4個(gè)重疊群，該4族占所有族的比例為1.56%(4/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為16.62% (125/752)，這4個(gè)重疊群全部是毒素基因。(3)10～19 ESTs：包含9個(gè)重疊群，該9族占所有族的比例為3.50%(9/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為15.03% (113/752)，這9個(gè)重疊群中有7個(gè)重疊群是毒素基因， 2個(gè)重疊群是普通細(xì)胞蛋白基因。(4)2～9 ESTs：包含46個(gè)重疊群，該46族占所有族的比例為17.90%(46/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為20.35% (153/752)，這46個(gè)重疊群中有11個(gè)重疊群是毒素基因，另外35個(gè)重疊群為普通細(xì)胞蛋白基因。(5)1 EST：196個(gè)單拷貝序列，其所占族的比例為76.26%(196/257)，而所包含的EST序列占整個(gè)EST序列的比例為26.06% (196/752)，這196個(gè)單一序列中有9個(gè)是毒素基因，另外187個(gè)是普通細(xì)胞蛋白基因。因此，家福捕鳥蛛毒腺轉(zhuǎn)錄組中絕大部分的單一序列基因?yàn)榉嵌舅鼗颉?/p>

2.5 JF-16的分離純化、分子量和活性鑒定

圖5為家福捕鳥蛛粗毒反相高效液相色譜圖。粗毒經(jīng)RP-HPLC后得到40多個(gè)色譜峰，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)將各個(gè)色譜峰進(jìn)行TTX-R通道活性篩選。發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為29.81 min的標(biāo)注為16的色譜峰(命名JF-16)經(jīng)全細(xì)胞膜片鉗檢測，對DRG細(xì)胞TTX-R通道電流具有抑制作用。JF-16膜片鉗活性鑒定時(shí)，先往細(xì)胞外液中加入200 nmol/L TTX，將DRG細(xì)胞上記錄的河豚毒素敏感性(Tetrodotoxin-sensitivity, TTX-S)鈉電流阻斷。選取小直徑(<10 μm)的DRG細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗試驗(yàn)，將膜電位控制在-80 mV，給予脈沖寬度為50 ms，以10 mV步幅遞增的去極化電壓刺激引出DRG細(xì)胞TTX-R電流，再加入JF-16進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗TTX-R通道活性的測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)JF-16對DRG細(xì)胞上TTX-R通道具有抑制作用。濃度為400 nmol/L 的JF-16大約抑制 36.17%±3.2% (n=5) TTX-R鈉通道電流，當(dāng)JF-16濃度增到1 μmol/L時(shí)大約能抑制 49.89%±4.70% (n=5)的TTX-R鈉通道電流(圖6A)。JF-16經(jīng)MALDI-TOF鑒定分子量為3 954.616(圖6B)。

圖5 JF-16反相高效液相色譜圖Fig.5 Reversed phase-HPLC of JF-16

圖6 JF-16對大鼠DRG細(xì)胞TTX-R鈉電流的影響(A)及其質(zhì)譜分析圖譜(B)Fig.6 Effects of JF-16 on TTX-R sodium currents in rat dorsal root ganglion neurons (A) and MALDI-TOF mass analysis (B)

眾所周知，DRG細(xì)胞表達(dá)的TTX-R鈉電流為Nav1.8和Nav1.9電流，其中以Nav1.8為主。這2類鈉通道電流也是目前研究的熱點(diǎn)。Nav1.8被認(rèn)為和神經(jīng)性疼痛相關(guān)[10]，而Nav1.9通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性從而與炎癥反應(yīng)和疼痛調(diào)節(jié)緊密相關(guān)[17]。Nav1.8主要在小直徑和中等直徑感覺神經(jīng)元上高表達(dá)，可被閾上電位激活，且呈現(xiàn)緩慢激活,緩慢失活及快速去失活的動力學(xué)特征，從而介導(dǎo)大量鈉離子內(nèi)流引起細(xì)胞膜快速去極化，因此是動作電位上升相的主要電流成分[18]。大量研究結(jié)果表明Nav1.8在機(jī)體炎癥、神經(jīng)病理性以及多種傷害性刺激誘發(fā)的疼痛中具有重要作用，因此靶向Nav1.8已成為新型鎮(zhèn)痛藥研發(fā)的新策略和熱點(diǎn)[19-20]。由于JF-16能夠抑制DRG細(xì)胞TTX-R鈉通道電流，因此，JF-16是一個(gè)潛在的可能具有鎮(zhèn)痛活性的毒素分子。

2.6 JF-16的序列測序與分析

通過Edman降解法進(jìn)行全序列測定，發(fā)現(xiàn)JF-16是1個(gè)由35個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，全序列為：H2N-ECTKLLGGCTKSSECCPHLGCRRKWPYHCGWDGTF-COOH，序列中包含有6個(gè)Cys。根據(jù)在線分析軟件計(jì)算得到該序列的理論分子量為3 960.5,這與質(zhì)譜鑒定所測定的值相差約6.0，表明該多肽分子的6個(gè)半胱氨酸殘基形成了3對二硫鍵。該序列中包含3個(gè)極性帶負(fù)電荷的酸性氨基酸(1Asp+2 Glu)和5個(gè)極性帶正電荷的堿性氨基酸(2Arg+3Lys)，堿性氨基酸數(shù)大于酸性氨基酸數(shù)使得整個(gè)多肽分子偏堿性，這與在線分析軟件計(jì)算出的該序列理論等電點(diǎn)為8.35相符。

2.7 JF-16的cDNA序列分析

根據(jù)JF-16 Edman降解測定的氨基酸序列和EST編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列比對，找到編碼JF-16的cDNA序列。研究發(fā)現(xiàn)JF-16的全長cDNA為518 bp，其中開放閱讀框ORF長261 bp，編碼87個(gè)氨基酸(前體肽)。5′-端非翻譯區(qū)(5′-UTR)長116 bp, 3′-端非翻譯區(qū)(3′-UTR)長141 bp, 具有典型的polyA 尾結(jié)構(gòu)。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，在前體肽N末端含有1個(gè)21個(gè)氨基酸組成的信號肽序列, 切割位點(diǎn)位于21位A和22位A之間。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。前體肽具有典型的“EER”蛋白酶水解位點(diǎn)(48～50)和酰胺化標(biāo)記殘基“GF”(86、87)。毒素前體被蛋白水解酶在“EER”位點(diǎn)水解為成熟肽儲存于毒囊中，尾部的2個(gè)酰胺化標(biāo)記氨基酸殘基“GF”也會切割。最終形成由35個(gè)氨基酸組成的成熟肽，與Edman降解法測定的序列完全吻合。JF-16的cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列見圖7。

灰色部分表示信號肽序列(1～21)；下劃線表示蛋白水解酶位點(diǎn)(EER)；▲表示保守的半胱氨酸殘基；*表示終止密碼子。圖7 JF-16 cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.7 Deduced amino acid sequence and cDNA sequence of JF-16

3 討 論

cDNA文庫構(gòu)建是研究基因功能和發(fā)現(xiàn)新基因的主要技術(shù)方法，而高質(zhì)量的RNA 是cDNA文庫構(gòu)建成功的必要條件。本試驗(yàn)采用Trizol法提取家福捕鳥蛛毒腺總RNA，所提取的毒腺總RNA經(jīng)電泳檢測未見明顯的降解，純度和含量都符合要求，表明家福捕鳥蛛毒腺總RNA提取成功。影響文庫質(zhì)量的另一個(gè)因素是構(gòu)建方法的選擇。本試驗(yàn)采用SMART 法構(gòu)建了家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫。SMART 法是Clontech公司發(fā)明的一種全長cDNA文庫構(gòu)建方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)[21]：(1)文庫構(gòu)建時(shí)所需mRNA量少，一般只需要 0.5～1.0 μg；(2)文庫構(gòu)建過程中mRNA 不會損耗和降解；(3)試驗(yàn)快速和簡便。cDNA文庫構(gòu)建后進(jìn)行了文庫滴度和cDNA片段大小的檢測分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的文庫滴度和獲得的插入片段大小均符合文庫構(gòu)建的要求，表明家福捕鳥蛛毒腺cDNA文庫構(gòu)建成功。

BLAST序列比對發(fā)現(xiàn)JF-16與敬釗纓毛蛛部分毒素[22]及一種生活在澳大利亞的捕鳥蛛Phlogiussp.毒素分子μ-TRTX-Phlo1a、μ-TRTX-Phlo1b相似性很高[23]。這些毒素分子的Cys不但高度保守且位置也基本相同，為第2、第9、第15、第16、第21、第29位，第15和第16位Cys緊密相鄰。其他很多氨基酸殘基也高度保守，如第7位的Gly，第18、第19位的His、Leu，第24、第25位的Lys、Trp，第26位的Pro，第31、第32位的Trp、Asp。BLAST比對發(fā)現(xiàn)JF-16與JZTX-9有高達(dá)94%的序列相似性[24]。JZTX-9是一個(gè)含有6個(gè)半胱氨酸，由35個(gè)氨基酸殘基組成的C端酰胺化的多肽分子。與JZTX-9相比，JF-16的第12位由極性帶負(fù)電荷的酸性氨基酸Asp變成極性不帶電荷的中性氨基酸Ser，第21位由極性帶正電荷的堿性氨基酸Lys變成Arg。因此，JF-16的理論等電點(diǎn)會高于JZTX-9。JZTX-9空間結(jié)構(gòu)屬于典型的抑制型胱氨酸結(jié)構(gòu) (Inhibitor cystine knot，ICK) 模體，由于JF-16與JZTX-9序列相似性很高，推斷JF-16的空間結(jié)構(gòu)也很有可能屬于ICK模體。

由于JF-16 對DRG細(xì)胞上TTX-R鈉通道電流具有抑制作用，因此，可以將JF-16作為一個(gè)潛在的鎮(zhèn)痛藥物開展相關(guān)研究。當(dāng)然，JF-16 對DRG細(xì)胞上TTX-R鈉電流具有抑制作用并不意味著JF-16就能夠成為鎮(zhèn)痛藥物。首先，JF-16開發(fā)成為鎮(zhèn)痛藥物分子需要其具有高度的專一性。近十年來，在靶向Nav1.8鎮(zhèn)痛新藥研發(fā)領(lǐng)域， 國際上主要集中在專一性抑制劑的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制研究。雖然取得一些進(jìn)展[25-26]，但是國際上該研究領(lǐng)域進(jìn)展緩慢，具有應(yīng)用前景的Nav1.8 專一性抑制劑很少。其次，JF-16必須具有高效低毒性的特性。另外，本研究只開展了JF-16 對DRG細(xì)胞上TTX-R鈉通道活性的初步檢測，未開展通道的分子水平作用機(jī)理研究，后續(xù)可以開展這方面的研究。

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