HPLC-MS/MS檢測血漿百草枯濃度方法的建立

岳曉靜， 李 衛(wèi)， 李平法

（1.焦作市婦幼保健院檢驗科，河南 焦作 454000；2.焦作市第一人民醫(yī)院檢驗科，河南 焦作 454000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453004）

百草枯是一種有效成分為l，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶陽離子鹽的除草劑，被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1]。由于百草枯對環(huán)境、水的污染作用，且對人體的毒性作用很強，因此在20世紀(jì)80年代后期，許多國家已經(jīng)開始禁用。然而，我國和東南亞地區(qū)目前仍在使用百草枯，且中毒現(xiàn)象仍很常見，每年都有很多百草枯中毒死亡案例[2-4]。百草枯中毒死亡率為60%～70%[5]，目前尚無特效藥可以解毒。有研究表明，百草枯中毒的死亡率與血中百草枯濃度高度相關(guān)[6-7]，因此其濃度是臨床診斷百草枯中毒最重要的指標(biāo)[8-9]。一般來說，如果患者血中百草枯濃度在中毒后4、6、10、24 h分別高于2 000、600、300和100 ng/mL，其生存的機率將非常低[10]。因此，早期快速、準(zhǔn)確地測定血中百草枯濃度至關(guān)重要。目前，用于百草枯檢測的方法有光譜法和色譜法，但穩(wěn)定性不能滿足要求，且操作復(fù)雜繁瑣。質(zhì)譜法具有高選擇性和高敏感性的優(yōu)點，其在臨床上的應(yīng)用已受到了廣泛關(guān)注。本研究擬建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測血中百草枯濃度的方法，為臨床早期診斷百草枯中毒提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年7月—2016年6月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科住院治療的百草枯急性中毒患者75例，其中男37例、女38例，年齡16～62歲，均為口服20%百草枯溶液中毒患者（均以自殺為目的），于服藥后2～6 h入院，入院后采用常規(guī)治療（如洗胃、抗氧化劑治療、激素治療、血液灌流等）。排除既往有嚴(yán)重肺部疾病或心、肝、腎功能不全者，伴有其他藥物中毒者，入院放棄治療或30 d內(nèi)失訪者以及資料信息不全者。采集所有患者入院后30 min內(nèi)的血液樣本，以乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTAK2）抗凝， 2 200×g離心5 min，分離血漿，保存于-80 ℃。根據(jù)入院30 d后是否死亡分為存活組（22例）和死亡組（53例）。2個組之間性別、年齡、中毒至就診的時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器和材料

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），API 4000三重四級桿質(zhì)譜儀（美國愛博才思公司），PAL-CAXXBIOM2型超純水儀（美國頗爾公司），AUW2201型分析天平（日本島津公司），UGC-24CE型氮吹儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司），TGL-16M型高速離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司），OF1型旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）。百草枯標(biāo)準(zhǔn)品（批號：MM40TC28）、內(nèi)標(biāo)乙基百草枯標(biāo)準(zhǔn)品（批號：DD40TC99）購自上海子起生物科技有限公司，甲醇（色譜級，美國飛世爾公司）、甲酸銨（色譜級）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水為自制；空白血液（健康獻(xiàn)血者血液）購自新鄉(xiāng)市中心血站。

1.3 方法

1.3.1 儀器設(shè)置 百草枯及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件見表1。選擇電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源及正離子條件下多離子反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式。色譜條件：Phenomenex Kinetex 2.6 μm HILIC色譜柱（100.0 mm×2.1 mm），以1%甲酸水溶液（含250 mmol/L甲酸銨）為流動相A、乙腈為流動相B，梯度洗脫（0.01 min→0.30 min，45% B→35%B；0.30 min→4.00 min，35% B；4.00 min→5.00 min，35% B→45% B；5.00 min→6.50 min，45% B），流速為0.35 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為40 ℃。

表1 百草枯及其內(nèi)標(biāo)乙基百草枯的質(zhì)譜條件

1.3.2 百草枯及其內(nèi)標(biāo)乙基百草枯工作液的制備方法 稱取26.38 mg百草枯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇于100 mL容量瓶中定容，從中吸取5 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為13 190 ng/mL的百草枯工作液。稱取33.66 mg乙基百草枯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇于100 mL的容量瓶中定容，從中吸取1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為3 366 ng/mL的乙基百草枯工作液。

1.3.3 百草枯標(biāo)準(zhǔn)液分析制備方法 取1.5 mL Eppendorf管，吸取對應(yīng)編號的百草枯標(biāo)準(zhǔn)液各100 μL，加入Eppendorf管底部，再加入100 μL空白血漿，然后加入50 μL內(nèi)標(biāo)（3 366 ng/mL乙基百草枯）和350 μL甲醇，密封，漩渦30 s，室溫（25 ℃）下22 560×g離心10 min。分2次，每次吸取200 μL上清液于1.5 mL進樣小瓶中，再加入200 μL超純水，混勻后待測。

1.3.4 樣本處理 取100 μL血漿置于1.5 mL Eppendorf管中，吸入50 μL內(nèi)標(biāo)（3 366 ng/mL乙基百草枯）和450 μL甲醇，22 560×g高速離心10 min，沉淀蛋白。而后分2次，每次吸取200 μL于1.5 mL進樣小瓶中，加入200 μL超純水，混勻后采用HPLC-MS/MS檢測。根據(jù)百草枯峰面積與內(nèi)標(biāo)乙基百草枯峰面積的相對值計算血漿百草枯濃度。

1.4 方法學(xué)評價

1.4.1 百草枯標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及線性評價 取百草枯工作液適量，逐級稀釋配成6種濃度：13 190.00、8 793.00、4 397.00、1 467.00、489.00、54.28 ng/mL。采用HPLC-MS/MS重復(fù)檢測3次。以百草枯濃度為X軸，百草枯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸繪圖，觀察其線性情況。

1.4.2 準(zhǔn)確度和精密度評價 將高、中、低及定量下限4種濃度標(biāo)準(zhǔn)液按標(biāo)準(zhǔn)液分析制備方法處理。高濃度（9 893 ng/mL）的配制方法：取1 500μL百草枯工作液，加500 μL甲醇，混勻；中濃度（6 595 ng/mL）的配制方法：取500 μL百草枯工作液，加500 μL甲醇，混勻。低濃度（163 ng/mL）的配制方法：取489 ng/mL的百草枯溶液1 mL，加2 mL甲醇，混勻。定量下限濃度為54.28 ng/mL。各濃度標(biāo)準(zhǔn)液平行制備5份，進樣分析來考察批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度，每個濃度每天檢測1次，共檢測3 d，以此觀察批間準(zhǔn)確度和精密度。

1.4.3 選擇性和基質(zhì)效應(yīng)評價 通過計算6份空白血漿響應(yīng)值與定量下限響應(yīng)值均值的比值以及6份空白血漿響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值均值的比值來觀察方法的選擇性。通過計算6批空白基質(zhì)的經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)來考察基質(zhì)效應(yīng)（在高濃度和低濃度下進行）。

1.4.4 穩(wěn)定性評價 分別觀察高、低濃度樣本處理后的室溫放置穩(wěn)定性（室溫放置2 h、8 h及1 d后檢測）、凍融穩(wěn)定性（樣本置于-80 ℃冰箱中凍存，然后室溫融化，重復(fù)凍融1、2及3次）以及長期存儲穩(wěn)定性（分別置于-80 ℃冰箱中凍存1個月和放置2～8 ℃保存1周，然后室溫融化或放置到室溫）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料呈非正態(tài)分布，采用中位數(shù)（范圍）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估血漿百草枯濃度對臨床結(jié)局的判斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線性評價

百草枯濃度在54.28～13 190.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.000 1X+0.011 6，r2=0.998 3。HPLC-MS/MS檢測百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 HPLC-MS/MS檢測百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 準(zhǔn)確度和精密度評價

當(dāng)百草枯濃度處于定量下限時，批內(nèi)準(zhǔn)確度為96.31%～120.04%，批間準(zhǔn)確度為104.43%；高、中、低濃度批內(nèi)和批間檢測值與理論值的偏差均在±15%范圍內(nèi)，符合要求。高、中、低濃度及定量下限的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均 ＜15%，符合要求（定量下限處的RSD＜20%）。見表2。

表2 HPLC-MS/MS測定百草枯的準(zhǔn)確度和精密度（%）

2.3 選擇性和基質(zhì)效應(yīng)評價

采用HPLC-MS/MS測定6份空白血漿，結(jié)果顯示百草枯對應(yīng)保留時間均無干擾峰，響應(yīng)值為零，選擇性符合要求。百草枯標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣本內(nèi)標(biāo)、空白樣本百草枯、內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子流圖見圖2～圖5。高、低濃度計算得到的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子變異系數(shù)分別為7.53%、13.3%，符合要求，見表3。

圖2 百草枯標(biāo)準(zhǔn)品選擇離子流圖

圖3 空白樣本內(nèi)標(biāo)選擇離子流圖

圖4 空白樣本百草枯選擇離子流圖

圖5 內(nèi)標(biāo)選擇離子流圖

表3 HPLC-MS/MS測定百草枯的基質(zhì)效應(yīng)分析

2.4 穩(wěn)定性評價

除高濃度樣本處理后放置8 h的準(zhǔn)確度（118.66%）略高于上限要求（115.00%）外，其他樣本均符合要求。見表4。

2.5 臨床驗證

2.5.1 死亡組和存活組血漿百草枯濃度比較 75例百草枯中毒患者均為口服20%百草枯溶液后2～6 h采血，血漿百草枯濃度為2 820（0～22 200）ng/mL。死亡組血漿百草枯濃度為6 650（1 950～22 200）ng/mL，明顯高于存活組[680（0～2 990）ng/mL]（P＜0.05）。

2.5.2 血漿百草枯濃度判斷臨床結(jié)局的ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，血漿百草枯濃度判斷百草枯中毒患者臨床結(jié)局的曲線下面積為0.855，95%可信區(qū)間為0.772～0.937，P=0.000。血漿百草枯濃度越高，患者死亡的可能性越大。Youden指數(shù)最大為0.589，其對應(yīng)的百草枯濃度（最佳臨界值）為2 431 ng/mL，敏感性為78.9%，特異性為80.0%。見圖6。

表4 HPLC-MS/MS測定百草枯濃度的穩(wěn)定性評價 （%）

圖6 血漿百草枯濃度判斷臨床結(jié)局的ROC曲線

3 討論

由于百草枯極性較強，在溶液中帶雙重陽離子的化學(xué)特性，因此適合用HPLC-MS/MS檢測。在百草枯生物樣本檢測中，很多色譜分析法常有繁瑣的樣本前處理過程，包括液-液萃取、固相萃取、微波輔助的溶劑萃取以及磁性碳納米管萃取等[11-14]，導(dǎo)致操作繁瑣、耗時。本研究中的樣本處理只需用甲醇沉淀蛋白1個步驟，簡便、省時。

本研究所選用的HILIC色譜柱較普通的C18色譜柱更適合分離強極性、高水溶性的有機化合物。HILIC色譜法是串聯(lián)質(zhì)譜中極性化合物分析的一種替代方法[15]，適合于質(zhì)譜分析中反相色譜柱不保留的極性物質(zhì)的分析。本研究曾選擇了不同的色譜柱和流動相進行預(yù)試驗：（1）選擇C18色譜柱，以含250 mmol/L乙酸銨的超純水溶液為流動相A、乙腈為流動相B，結(jié)果顯示百草枯及其內(nèi)標(biāo)不出峰；（2）選擇C18色譜柱，以含250 mmol/L乙酸銨和1.0%乙酸的超純水溶液為流動相A、乙腈為流動相B，結(jié)果顯示百草枯及其內(nèi)標(biāo)在色譜柱中不保留；（3）選擇HILIC 100A LC色譜柱（100.0 mm×2.1 mm），以含250 mmol/L乙酸銨和1.0%乙酸的超純水溶液為流動相A、乙腈為流動相B，結(jié)果顯示百草枯及其內(nèi)標(biāo)在色譜柱中吸附較強，形成蘑菇峰；（4）選擇HILIC 100A LC色譜柱（100.0 mm×2.1 mm），以含250 mmol/L乙酸銨和1.0%乙酸的超純水溶液為流動相A、乙腈為流動相B，結(jié)果顯示百草枯及其內(nèi)標(biāo)出峰較好。另外，甲酸銨的選擇也是本研究所建方法的一大特點。傳統(tǒng)的離子對試劑，如七氟丁酸[16]和三氟乙酸[11]常被用于HPLC-MS/MS分析中。然而，由于這些離子對試劑在流動相中產(chǎn)生離子抑制作用，使得分析靈敏度大大下降，而且給質(zhì)譜系統(tǒng)帶來額外的污染物。而本研究選擇的甲酸銨能夠彌補傳統(tǒng)離子對試劑的缺陷。

本研究方法學(xué)評價結(jié)果顯示，本法的線性范圍為54.28～13 190.00 ng/mL，能夠涵蓋臨床上大部分樣本的濃度范圍；具有較好的準(zhǔn)確度和精密度；除定量下限處第3批平均準(zhǔn)確度略微高于上限要求（120%）外，其余均符合要求；方法選擇性好，百草枯出峰位置無干擾，基質(zhì)效應(yīng)符合要求；樣本在-80 ℃儲存可穩(wěn)定1個月，由于研究時間的關(guān)系，未能觀察更長時間的儲存穩(wěn)定性。

采用本研究建立的HPLC-MS/MS方法測定75例百草枯中毒患者的血漿百草枯濃度，結(jié)果顯示死亡組血漿百草枯濃度明顯高于存活組（P＜0.05）。ROC曲線分析顯示血漿百草枯濃度判斷百草枯中毒患者臨床結(jié)局的最佳臨界值為2 431 ng/mL，敏感性為78.9%，特異性為80.0%，曲線下面積為0.855。本研究結(jié)果與杜宇等[17]的研究結(jié)果基本一致。由于本研究樣本例數(shù)較少，HPLC-MS/MS檢測血漿百草枯濃度的臨床應(yīng)用價值還有待今后積累更多的病例進行評價。

綜上所述，本研究建立的檢測血漿百草枯濃度的HPLC-MS/MS方法具有準(zhǔn)確、可靠、特異性好、干擾少等優(yōu)點，并可即時檢測、30 min內(nèi)出結(jié)果，因此可作為血漿百草枯濃度檢測的常規(guī)方法。

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