溫經(jīng)湯調(diào)節(jié)HER-2陽(yáng)性乳腺癌術(shù)后患者陰陽(yáng)平衡及對(duì)PD-1/PD-L1的影響

鄭 琎 傅春燕 陳述政

乳腺癌是女性常見(jiàn)的發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，全球每年乳腺癌發(fā)病人數(shù)有135萬(wàn)左右，死亡人數(shù)約33萬(wàn)[1]，尤其是2012年，其發(fā)病人數(shù)高達(dá)170萬(wàn)，且死亡人數(shù)高達(dá)52萬(wàn)[2]。在臨床醫(yī)學(xué)手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等手段下，仍為當(dāng)前危害女性健康的頭號(hào)殺手。按照2007年發(fā)表于柳葉刀腫瘤學(xué)雜志分型法[3]，將乳腺癌分 為 LuminalA、LuminalB、HER-2positive 和Basal-like 4種亞型。曲妥珠單抗為第一個(gè)靶向治療HER-2（人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2）的人源性單克隆抗體，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑等作用成為乳腺癌靶向治療的基石，在HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者輔助治療中有著重要地位[4]。腫瘤免疫逃逸機(jī)制使得免疫治療已成為當(dāng)前研究重點(diǎn)，筆者應(yīng)用溫經(jīng)湯研究中醫(yī)“陰陽(yáng)平衡”對(duì)HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者機(jī)體免疫紊亂的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

選取本院2011年1月—2013年12月HER-2陽(yáng)性乳腺癌手術(shù)后患者共65例，均為女性，分為治療組 33例，年齡 28～74歲，平均（43.5±16.5）歲，平均病程（6.4±3.7）年；對(duì)照組 32例，年齡 27～76歲，平均（42.3±17.3）歲，平均病程（5.9±3.1）年。兩組患者年齡及病程等一般資料方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性?；颊呔橥馇液炇鹬橥鈺?shū)，經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。兩組患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2011年版《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范》[5]。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]，符合下焦虛寒、陰陽(yáng)失調(diào)證型。均為HER-2陽(yáng)性 [標(biāo)準(zhǔn)免疫組化（IHC）+++，或原位熒光雜交法（FISH）陽(yáng)性；免疫組化檢測(cè)顯示 HER-2（+++），可以直接判斷為HER-2陽(yáng)性；FISH檢測(cè)，比值＞2.2則可判斷為HER-2陽(yáng)性]，及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＞60%者。

2 方法

治療組予曲妥珠單抗聯(lián)合中藥“溫經(jīng)湯”治療，對(duì)照組給予曲妥珠單抗治療。曲妥珠單抗周療劑量為2mg/kg（首次劑量為4mg/kg），或3周1次劑量為6mg/kg（首次劑量為8mg/kg），共1年?！皽亟?jīng)湯”組方：吳茱萸 9g（先煎 30min），桂枝 5g，川芎 6g，當(dāng)歸12g，白芍 9g，丹皮 12g，干姜 3g，麥冬 20g，清半夏10g（水洗），黨參 15g，生甘草 6g，東阿膠（烊化）、重樓各9g。1天1劑，加入700mL飲用水，浸泡30min，自動(dòng)煎藥機(jī)煎煮，文火煎煮40min，液體包裝機(jī)灌裝每袋150mL，1天2袋，空腹或餐后1～2h口服?；颊呙恐苋∷?次。兩組其他綜合治療均一致，總治療周期均為48周。

觀察指標(biāo)：檢測(cè)兩組患者治療前、治療后第24周、48周的血常規(guī)、腫瘤指標(biāo)，外周血程序性死亡因子（PD-1）、程序性死亡因子配體-1（PD-L1），外周血IL-17，心臟彩超，常規(guī)B超；記錄每位患者治療前和治療后第24周、48周的中醫(yī)證候，以“八綱”為目，由副主任及以上中醫(yī)師辨別表里、寒熱、虛實(shí)；若左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）較治療前絕對(duì)數(shù)值下降≥16%或者LVEF＜正常范圍并且較治療前絕對(duì)數(shù)值下降≥10%，應(yīng)停止曲妥珠單抗治療；若4～8周內(nèi)LVEF回升至正常范圍或LVEF較治療前絕對(duì)數(shù)值下降≤15%，可恢復(fù)使用曲妥珠單抗。LVEF持續(xù)下降（＞8周），或者3次以上因心肌病而停止曲妥珠單抗治療，應(yīng)永久停止使用曲妥珠單抗。常規(guī)B超提示有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移證據(jù)，則按2011年指南相應(yīng)措施規(guī)范化治療。

血常規(guī)檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑（編號(hào)E1003）；IL-17檢測(cè)：取清晨空腹外周靜脈血5ml，EDTA 抗凝，離心機(jī) 4000r/min，離心 5min，分離血漿后，置于零下20℃冰箱凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。PD-1/PD-L1表達(dá)水平檢測(cè)：取3支專(zhuān)用流式管，分別加入抗人CD4-FITC抗體10μL和MouseIgG1-PE同型質(zhì)控2.5μL、抗人CD4-FITC抗體10μL和抗PD-1-PE抗體2.5μL、抗人CD-FITC抗體10μL和抗人B7-H1-PE抗體2.5μL，然后每管各加入全血50μL，混勻，避光15min后加入1mL溶血?jiǎng)?，室溫放?0min，1500r離心，5min棄上清，再分別加入1mL生理鹽水，混勻，1500r離心，5min棄上清，最后加入500mL生理鹽水重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMANCOULTE公司）檢測(cè)。采用FS-SS參數(shù)分析基礎(chǔ)上，對(duì)全PBMC設(shè)門(mén)，設(shè)定CD4陽(yáng)性細(xì)胞門(mén)，檢測(cè)CD4+T細(xì)胞上PD-L1/PD-1的表達(dá)水平，并扣除同型對(duì)照的非特異性本底值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

治療過(guò)程中治療組有3例LVEF第4周持續(xù)下降，對(duì)照組1例持續(xù)下降，1例鎖骨上淋巴結(jié)腫大而更改方案治療，最終兩組各30例入組數(shù)據(jù)分析。

3.1 兩組外周血PD-1表達(dá)水平比較 治療前兩組PD-1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組PD-1均不同程度下降，治療48周后，治療組PD-1低于對(duì)照組，與治療前和對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

3.2 兩組外周血PD-L1表達(dá)水平比較 治療前兩組PD-L1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組PD-L1均不同程度下降，治療48周后，治療組PDL1低于對(duì)照組，與治療前和對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

3.3 兩組WBC、RBC、PLT比較 治療前兩組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，治療組患者WBC計(jì)數(shù)與治療前相比有所升高，對(duì)照組反而稍有下降，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組RBC和PLT比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 3。

表2 兩組HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者血 PD-L1表達(dá)水平比較[例（%）]

表3 兩組HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者WBC、RBC、PLT比較（×109/L，x±s）

3.4 兩組外周血IL-17表達(dá)水平比較 治療前兩組IL-17差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組IL-17均不同程度下降，但對(duì)照組治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療組治療48周與治療前及對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者血IL-17表達(dá)水平比較（pg/mL，x±s）

3.5 兩組“八綱”條目比較 治療組治療前后“里虛寒”患者構(gòu)成比由36%下降到13.7%，對(duì)照組“里虛寒”構(gòu)成比由37%下降到26%，治療組療效更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 5。

3.6 兩組安全性指標(biāo)比較 治療過(guò)程中，兩組均未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，與對(duì)照組治療后比較，兩組在心超、心電圖、B超、尿常規(guī)等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 6。

4 討論

根據(jù)乳腺癌發(fā)病的四診內(nèi)容，參考?xì)v代醫(yī)家文獻(xiàn)，乳腺癌可以歸于“乳巖”、“乳石癰”、“石榴”、“乳栗”等病證，歷代醫(yī)家對(duì)乳巖的病因、病機(jī)、癥候及證治具有獨(dú)到的見(jiàn)解?！峨y經(jīng)》曰：“積者，陰氣也，其始發(fā)有常處，其痛不離其部，上下有所終始，左右有所窮處?！薄饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“任脈為病，女子帶下癓瘕?！盵7]任脈在女子諸病尤其是積病上至關(guān)重要?！督饏T要略·婦人雜病脈證并治》言：“婦人年五十，暮即發(fā)熱，少腹急，腹?jié)M，手掌煩熱，唇口干燥，何也？師曰：此病屬帶下，瘀血在少腹不去，當(dāng)以溫經(jīng)湯主之。”[8]溫經(jīng)湯亦主婦人少腹寒，久不受胎；兼取崩中去血，或月水來(lái)過(guò)多，及至期不來(lái)。該方是一張調(diào)任脈的祖方，堪稱(chēng)女科第一方，此“帶下”之病機(jī)乃屬地道不通，厥陰虛寒，水不生木，任脈失交與陽(yáng)明土和厥陰木，故主任脈也?！皽亟?jīng)湯”方意可理解為合“吳茱萸湯”、“桂枝湯”、“膠姜湯”、“麥門(mén)冬湯”、“桂枝茯苓丸”而成一方?！肮鹬睘槿悍街?，外調(diào)營(yíng)衛(wèi)氣血，內(nèi)調(diào)七情之雜病，桂枝湯為升厥陰肝木的第一要法。肝藏血，血得溫乃升，桂枝性溫，白芍濡養(yǎng)肝木，當(dāng)歸助肝藏血。地道不通，水生木，腎水竭，補(bǔ)天道生水，故真水只能由脾胃生化而來(lái)，因此用了吳茱萸湯和麥門(mén)冬湯，這便是“一氣周流”。厥陰肝木不能升達(dá)，少陽(yáng)相火不降，則陽(yáng)明不能降，是故手掌心熱，所以用半夏，麥冬來(lái)降陽(yáng)明土。相火下耗腎水，上則口干口苦，發(fā)枯經(jīng)閉，精血橫溢，月經(jīng)淋漓不盡，不得有子，少腹急，厥陰肝木不能達(dá)，小腹?jié)M，脾氣不能升達(dá)。女子以血為主，任脈、厥陰肝都是以血濡養(yǎng)的經(jīng)脈，陽(yáng)明經(jīng)亦是多血多氣之經(jīng)，而任脈下系肝腎上系陽(yáng)明，三經(jīng)皆布散于口唇，因此嘴唇干癟干燥，是女子血虧的第一表現(xiàn)。正如《內(nèi)經(jīng)》言：“二八女子，唇紅齒白?！睔庋溆且?。溫經(jīng)湯，溫的是任脈的經(jīng)血，故溫經(jīng)湯有培補(bǔ)先天以滋后天，凱旋升降，交通左右之功?！秲?nèi)經(jīng)》認(rèn)為陰陽(yáng)乃浮沉生死之門(mén)，左右為其道路，水火為其征兆，故調(diào)陰陽(yáng)之法門(mén)在于其“左右、浮沉、水火”六字，這也是溫經(jīng)湯調(diào)和女子陰陽(yáng)第一主方之原由，正所謂，陰平陽(yáng)秘，精神乃治。

表5 兩組HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者“八綱”條目比較[例（%）]

表6 兩組HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者一般安全性指標(biāo)比較（例）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HER-2受體是人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR家族的第2個(gè)成員，由位于17號(hào)染色體q21上，編碼分子質(zhì)量185k的跨膜蛋白表達(dá)，有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，因此對(duì)于HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者，機(jī)體免疫功能紊亂更為復(fù)雜。HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者通過(guò)體內(nèi)HER1/HER3/HER4與相應(yīng)配體結(jié)合后，與HER-2形成異二聚體，磷酸化膜內(nèi)酪氨酸激酶，生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白及其相關(guān)銜接蛋白通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域連接到HER2的C端激活蛋白SOS，促進(jìn)Ras釋放GDP進(jìn)而使MEK磷酸化，最終激活MAPK[9]，參與腫瘤的生長(zhǎng)、分化、炎癥、凋亡等機(jī)制。曲妥珠單抗是靶向HER-2 的抗體，臨床研究[10]顯示，譬如 NCCTG、N9831、HERA、BCIRG006、I-SPY2等均可以明顯提高HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者無(wú)病生存期（DFS）和總生存（OS）。HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者與機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下密切相關(guān)，乳腺癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子可有效促進(jìn)和抑制腫瘤的生長(zhǎng)，以T淋巴細(xì)胞為主，取決于抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）和T細(xì)胞之間3類(lèi)分子信號(hào)的綜合作用。其中輔助性細(xì)胞T（Th）是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，而輔助性T細(xì)胞17（Thl7）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在炎癥及免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[11]。Th17細(xì)胞通過(guò)其特異性產(chǎn)生的效應(yīng)因子IL-17發(fā)揮致炎作用；IL-17頻率增加，抑制活性升高，減弱特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[12-13]。

程序性死亡因子-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)能夠顯著抑制T細(xì)胞活化和調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的CD28/B7家族成員。PD-1分子主要在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，PD-1受體可通過(guò)與APC表面的配體PD-L1結(jié)合而發(fā)揮抑制T細(xì)胞反應(yīng)的作用。PD-1可通過(guò)與配體PD-L1結(jié)合可通過(guò)阻斷CD28，激活介導(dǎo)的PI3K途徑而抑制T細(xì)胞的增殖和分化[14]。在有效激活T細(xì)胞的信號(hào)途徑中，負(fù)向的協(xié)同共刺激分子PD-1及其配體PD-L1的信號(hào)途徑是最新認(rèn)為與腫瘤疫苗、雙特異性抗體、檢查點(diǎn)抑制劑及共刺激分子激動(dòng)劑等腫瘤免疫治療方面很有治療前景的靶點(diǎn)[15-16]。本研究通過(guò)中醫(yī)調(diào)節(jié)整體“陰陽(yáng)”平衡觀察HER-2陽(yáng)性的乳腺癌術(shù)后患者免疫紊亂情況。治療48周后，治療組“里虛寒”構(gòu)成比較治療前下降，且與對(duì)照組相比有明顯差異，顯示“溫經(jīng)湯”可以通過(guò)“溫里、暖肝、運(yùn)氣、活血”來(lái)調(diào)節(jié)人整體的陰陽(yáng)狀態(tài)，使偏頗的“表里寒熱虛實(shí)”趨向平和，達(dá)到增強(qiáng)正氣、運(yùn)行氣血、通調(diào)任脈的作用，即“正氣存內(nèi)，邪不可干”之意。治療48周后，治療組外周血PD-1、PD-L1頻數(shù)均低于對(duì)照組同期水平，與基線(xiàn)相比也明顯下降。相關(guān)研究[17]發(fā)現(xiàn)，三陰型乳腺癌中PD-1在HER-2陽(yáng)性腫瘤表達(dá)較高，也有報(bào)道[18]稱(chēng)PD-1表達(dá)與HER-2的表達(dá)呈正相關(guān)，與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與PR表達(dá)無(wú)關(guān)，在不同的乳腺癌亞型中無(wú)明顯差異；而治療組IL-17頻數(shù)較對(duì)照組明顯升高，白細(xì)胞也較對(duì)照組數(shù)目增多，機(jī)體整體的免疫功能增強(qiáng)。結(jié)果顯示“溫經(jīng)湯”治療對(duì)患者已紊亂的免疫內(nèi)環(huán)境有趨向再建平衡作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IL-17和PD-1/PD-L1的分泌改善機(jī)體免疫功能，或可為乳腺癌綜合防治及免疫治療瓶頸提供較有前景的靶點(diǎn)和方向。

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