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    畬藥山里黃根水提液對(duì)CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷作用有效部位篩選

    2018-03-07 05:25:08傅躍青俞忠明單云崗
    關(guān)鍵詞:水提液正丁醇存活率

    傅躍青 俞忠明 單云崗

    畬藥山里黃根為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥根,具有清熱、涼血、解毒作用[1],在浙江、福建、廣東、廣西、湖南等地應(yīng)用極廣,主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療,有較好的開發(fā)利用前景[2-3]。四氯化碳(CCl4)是一種強(qiáng)烈的能夠引起肝細(xì)胞壞死的化合物,一直被研究者用來(lái)誘發(fā)各種肝損傷模型,利用肝損傷以后藥物對(duì)于肝細(xì)胞的作用以闡明實(shí)驗(yàn)藥物的肝毒性機(jī)制或肝損傷保護(hù)機(jī)制[4-7]。含有山里黃根的中藥制劑在治療肝病方面的療效尤為顯著[8],對(duì)損傷的肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。我們通過(guò)山里黃根不同極性萃取部位的對(duì)水提液CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,采用MTT法[9-11]測(cè)定細(xì)胞OD值并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率,作為判斷山里黃根不同極性萃取部位水提液對(duì)于CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷作用的重要指標(biāo),從而初步篩選出具有肝保護(hù)作用的藥物有效部位。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)用肝細(xì)胞株:L-02人正常肝細(xì)胞,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中,均在37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),2~3d傳一代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥物及主要試劑 山里黃根采自浙江麗水市蓮都區(qū)天堂山,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定。陽(yáng)性對(duì)照藥:聯(lián)苯雙酯片(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠,批號(hào)150601)。CCl4(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,批號(hào):W20150513);石油醚(杭州石化有限責(zé)任公司,批號(hào)20150704);乙酸乙酯(杭州雙林化工試劑廠,批號(hào)20150515);正丁醇(杭州雙林化工試劑廠,批號(hào)20150508);DMEM培養(yǎng)液(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司,批號(hào)20150318);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批號(hào)20150207);0.25%胰酶-EDTA溶液(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司,批號(hào) 20150210);二甲基亞砜(DMSO,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20151205);細(xì)胞級(jí)(DMSO,美國(guó) Sigma公司,批號(hào) GNM25200);DHank’s液(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司,批號(hào)20151211);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning Costar公司);細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning Costar公司);311型 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation,USA);TD4臺(tái)式低速離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);SO9001電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);Power Wave X340 BIO-TEK酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK儀器有限公司);高壓滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司);HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器設(shè)備有限公司);移液槍(德國(guó)Eppendorf公司);Eclipse TS100/100-F倒置顯微鏡(日本Nikon);Phs-3E Ph計(jì)(上海精科有限公司);DEF-6050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

    1.4 主要試劑的配制 (1)DMEM培養(yǎng)基:分別將DMEM干粉40.2g、NaHCO311.1g、青霉素G鈉鹽30萬(wàn)IU、硫酸鏈霉素0.3g溶于3000mL雙蒸水中,置磁力攪拌器上使其全部溶解,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,-20℃保存,用前 37℃融化,置 4℃?zhèn)溆?;?)0.25%胰蛋白酶:將0.25g胰蛋白酶用D-Hank’s液溶解,定容至100mL,置磁力攪拌器上使其全部溶解,用5.6%NaHCO3調(diào)整pH值在7.2~7.6之間,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝成5mL/瓶,-20℃保存,用前室溫融化,置4℃?zhèn)溆?;?)PBS:分別精密稱取0.20g KCl,0.24g KH2PO4,8.0g NaCl,3.58g Na2HPO4·12H2O,將以上試劑溶于適量雙蒸水中,置磁力攪拌器上使其全部溶解,定容至1000mL,NaOH調(diào)整pH值為7.2,高壓蒸氣滅菌,放冷后置4℃?zhèn)溆?;?)MTT溶液:精密稱取MTT 0.5g,用無(wú)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成5mg/ml的溶液,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,放4℃鋁箔紙包住避光保存。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 山里黃根水提液的四個(gè)不同極性部位的提取

    (1)工藝路線如下:將山里黃根干燥藥材粉碎成粗粉(過(guò)2號(hào)篩),稱取,加入蒸餾水,加熱回流提取2次,料液比分別為1:20和1:10,每次1h,過(guò)濾,合并濾液,減壓濃縮至黏稠狀。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至無(wú)色,將萃取物及萃取后剩余水層減壓抽濾回收溶劑,分別放入真空干燥箱中加壓干燥成干膏,分別得到石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、剩余部位組。重復(fù)以上步驟,提取濃縮干燥成干膏,得到總提取物組。精密稱量,計(jì)算以上5種干膏得率。(2)細(xì)胞液培養(yǎng):用胎牛血清配制成含12%胎牛血清的的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,及20%胎牛血清的的高糖DMEM培養(yǎng)液。

    2.2 L-02肝細(xì)胞的培養(yǎng) (1)傳代培養(yǎng):將L-02肝細(xì)胞株凍存管從-80℃超低溫冰箱中取出,立即放入37℃水浴鍋中,持續(xù)搖晃,將冷存液速度融化,馬上加入到10倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(已提前于37℃預(yù)溫),顛倒混勻,離心,棄上清,將沉淀細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,細(xì)胞長(zhǎng)滿后,胰酶消化,傳代備用。(2)鋪板:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02肝細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,然后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮,用玻璃管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板中,每孔 100μL,置于 5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)24h。

    2.3 CCl4損傷模型的建立 吸取CCl4溶于適量DMEM培養(yǎng)基中,以少量的二甲基亞砜助溶,二甲基亞砜終濃度為0.1%(V/V),配成終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40mmol/L 的 CCl4溶液。加入到細(xì)胞貼壁后的96孔板中,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔(需要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),通過(guò)細(xì)胞抑制率結(jié)果,確定一定的濃度范圍,以確定造模的成功性)。

    2.4 MTT檢測(cè) 培養(yǎng)24h后,倒掉培養(yǎng)基,PBS洗板1次,每孔加入100μL終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液,無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后,倒掉MTT溶液,每孔加入150μL二甲基亞砜,充分震蕩15min,于酶標(biāo)儀570nm處檢測(cè)OD值(需要預(yù)實(shí)驗(yàn),通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定山里黃根水提液與MTT不反應(yīng))。

    2.5 計(jì)算公式 各平行孔取均值后計(jì)算,公式如下:細(xì)胞相對(duì)存活率計(jì)算:(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%;細(xì)胞相對(duì)抑制率計(jì)算:1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

    2.6 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組,使用時(shí)用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,加入細(xì)胞級(jí)DMSO助溶,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每孔加入細(xì)胞液。模型組,終濃度為5mmol/L CCl4,方法參照上文CCl4損傷模型的建立。乙酸乙酯+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組,使用時(shí)用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,加入細(xì)胞級(jí)DMSO助溶,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,加入到CCl4損傷細(xì)胞液中,使藥液在96孔板中的終濃度為 100、300、600、1200、2400μg/mL。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。正丁醇+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組、剩余部位+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組、總提取物+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組方法同正丁醇+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照組(聯(lián)苯雙脂片),用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,加入細(xì)胞級(jí)二甲基亞砜助溶,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,加入到CCl4損傷細(xì)胞液中,使藥液在96孔板中的終濃度為 5、10、20、30、40μg/mL。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0分析應(yīng)用軟件處理分析數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(x±s)表示。各組間比較均采用單因素方差分析,組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率 精密稱取山里黃根干燥根粗粉(過(guò)2號(hào)篩)200g,按照上文2.1(1)項(xiàng)的方法提取分離干燥后,所得干膏得率如表1所示。由于石油醚萃取部位所得干膏比較少,不足以實(shí)驗(yàn)使用,所以后面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)把石油醚部位棄去。

    3.2 CCl4損傷L-02肝細(xì)胞模型的建立 CCl4濃度在0.5~40.0mmol范圍內(nèi),隨CCl4濃度增加,L-02肝細(xì)胞存活率降低。擬合細(xì)胞存活抑制率與CCl4劑量的量效關(guān)系曲線(圖1),可以清晰看出濃度越高抑制率越高,即存活率越低。研究表明,細(xì)胞存活率在50%~60%之間,可很好地顯示CCl4肝細(xì)胞的損傷與保護(hù)作用的差異。通過(guò)表2我們發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,CCl4濃度為5mmol/L時(shí),MTT法檢測(cè)OD值,得到肝細(xì)胞的抑制率為51.98%,細(xì)胞存活率為48.02%。因此,實(shí)驗(yàn)選取5mmol/L CCl4作用24h作為L(zhǎng)-02肝細(xì)胞損傷模型的造模劑量。

    表1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率

    圖1 CCl4不同濃度對(duì)L-02肝細(xì)胞抑制率的影響

    表2 不同濃度CCl4對(duì)細(xì)胞增殖的影響(x±s)

    3.3 山里黃根水提液不同萃取部位對(duì)CCl4造模細(xì)胞增殖的影響及有效部位的確定 根據(jù)上述各部位提取物L(fēng)D1和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,每個(gè)提取物設(shè)定5~6個(gè)劑量,篩選對(duì)CCl4損傷L-02肝細(xì)胞具有保護(hù)作用的部位。結(jié)果表明:用MTT法檢測(cè)山里黃根水提液不同萃取部位及總提取物對(duì)CCl4造模細(xì)胞增殖的作用,不同部位呈現(xiàn)了抑制或者促進(jìn)作用(見(jiàn)表3)。其中對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)作用的是正丁醇提取部位,在600、1200、2400μg/mL濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用且有意義(P<0.05),即細(xì)胞存活率升高。在1200μg/mL濃度時(shí)總提取部位對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用,可以表明山里黃根水提液對(duì)CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷有一定的保護(hù)作用,而保護(hù)作用明顯的是正丁醇部位。

    表3 各組對(duì)CCl4損傷細(xì)胞存活率的影響(x±s)

    4 討論

    有效部位的篩選是研究藥物作用機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié),是研究和開發(fā)新藥的必經(jīng)途徑。山里黃根水提液對(duì)損傷的肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用,因此我們通過(guò)CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷,而藥物作用可以使細(xì)胞生長(zhǎng)或者凋亡,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量的變化來(lái)初步篩選具有肝保護(hù)作用的藥物。目前檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量變化的方法有很多,如同位素法、摻入法等都具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn),但是由于步驟復(fù)雜需要特殊設(shè)備等,不能普遍使用。目前最常用的就是MTT法,該法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。

    MTT方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。MTT法利用96孔板可簡(jiǎn)便快捷規(guī)?;暮Y選藥物。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)(也可選擇570nm)處測(cè)定其光吸收值OD值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。所以缺點(diǎn)就是甲瓚影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,細(xì)胞點(diǎn)板時(shí)一定要吹打均勻,盡量減少誤差,千萬(wàn)不能把藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶析出,否則會(huì)加大結(jié)果誤差。

    畬藥山里黃根的干燥根作為新品種被收錄進(jìn)《浙江省中藥炮制規(guī)范》,并注明其功能為清熱、涼血、解毒,臨床上主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療,表現(xiàn)出較好的開發(fā)利用前景,值得關(guān)注并深入研究。

    本研究采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)山里黃根水提液進(jìn)行了不同極性部位的萃取,一共得到了四個(gè)部位,但是由于石油醚部位的干膏得率過(guò)低(0.042%),因此不能用于實(shí)驗(yàn),考慮到藥物本身對(duì)于MTT的影響,實(shí)驗(yàn)前做了MTT法測(cè)山里黃根水提液,沒(méi)有反應(yīng),所以實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有設(shè)置藥物顏色對(duì)照組。

    本研究以L-02細(xì)胞株建立CCl4損傷模型,測(cè)定了山里黃根不同部位提取物的毒性,明確了各提取物的安全劑量范圍,篩選出抗L-02細(xì)胞株CCl4損傷的有效部位——山里黃根水提液中正丁醇萃取部位,計(jì)算出ED50和TI。該提取物可提高CCl4損傷L-02細(xì)胞存活率,是山里黃根中具有保護(hù)肝損傷的有效部位。值得我們關(guān)注的是,正丁醇萃取部位600μg/mL時(shí)保護(hù)作用最好,隨著濃度的增大細(xì)胞存活率下降,所以可以判斷濃度與細(xì)胞存活率沒(méi)有依從關(guān)系,因此最適濃度是我們進(jìn)一步研究的問(wèn)題之一。此外,總提取物組在濃度1200μg/mL時(shí)具有保護(hù)作用,可能由于相同濃度下正丁醇部位的成分含量少,所以細(xì)胞存活率相對(duì)較低。因此,在以后的研究中,我們將繼續(xù)考察正丁醇部位在藥物作用的不同時(shí)間,如藥物作用24、48、72h后,細(xì)胞存活率的變化。研究正丁醇部位對(duì)受損肝細(xì)胞保護(hù)作用與藥物作用時(shí)間變化的關(guān)系。該有效部位提取物抗CCl4損傷的機(jī)制以及在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需更進(jìn)一步的研究。

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