• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    畬藥山里黃根水提液對(duì)CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷作用有效部位篩選

    2018-03-07 05:25:08傅躍青俞忠明單云崗
    關(guān)鍵詞:水提液正丁醇存活率

    傅躍青 俞忠明 單云崗

    畬藥山里黃根為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥根,具有清熱、涼血、解毒作用[1],在浙江、福建、廣東、廣西、湖南等地應(yīng)用極廣,主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療,有較好的開發(fā)利用前景[2-3]。四氯化碳(CCl4)是一種強(qiáng)烈的能夠引起肝細(xì)胞壞死的化合物,一直被研究者用來(lái)誘發(fā)各種肝損傷模型,利用肝損傷以后藥物對(duì)于肝細(xì)胞的作用以闡明實(shí)驗(yàn)藥物的肝毒性機(jī)制或肝損傷保護(hù)機(jī)制[4-7]。含有山里黃根的中藥制劑在治療肝病方面的療效尤為顯著[8],對(duì)損傷的肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。我們通過(guò)山里黃根不同極性萃取部位的對(duì)水提液CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,采用MTT法[9-11]測(cè)定細(xì)胞OD值并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率,作為判斷山里黃根不同極性萃取部位水提液對(duì)于CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷作用的重要指標(biāo),從而初步篩選出具有肝保護(hù)作用的藥物有效部位。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)用肝細(xì)胞株:L-02人正常肝細(xì)胞,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中,均在37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),2~3d傳一代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥物及主要試劑 山里黃根采自浙江麗水市蓮都區(qū)天堂山,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定。陽(yáng)性對(duì)照藥:聯(lián)苯雙酯片(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠,批號(hào)150601)。CCl4(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,批號(hào):W20150513);石油醚(杭州石化有限責(zé)任公司,批號(hào)20150704);乙酸乙酯(杭州雙林化工試劑廠,批號(hào)20150515);正丁醇(杭州雙林化工試劑廠,批號(hào)20150508);DMEM培養(yǎng)液(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司,批號(hào)20150318);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批號(hào)20150207);0.25%胰酶-EDTA溶液(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司,批號(hào) 20150210);二甲基亞砜(DMSO,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20151205);細(xì)胞級(jí)(DMSO,美國(guó) Sigma公司,批號(hào) GNM25200);DHank’s液(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司,批號(hào)20151211);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning Costar公司);細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning Costar公司);311型 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation,USA);TD4臺(tái)式低速離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);SO9001電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);Power Wave X340 BIO-TEK酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK儀器有限公司);高壓滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司);HWS24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器設(shè)備有限公司);移液槍(德國(guó)Eppendorf公司);Eclipse TS100/100-F倒置顯微鏡(日本Nikon);Phs-3E Ph計(jì)(上海精科有限公司);DEF-6050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

    1.4 主要試劑的配制 (1)DMEM培養(yǎng)基:分別將DMEM干粉40.2g、NaHCO311.1g、青霉素G鈉鹽30萬(wàn)IU、硫酸鏈霉素0.3g溶于3000mL雙蒸水中,置磁力攪拌器上使其全部溶解,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,-20℃保存,用前 37℃融化,置 4℃?zhèn)溆?;?)0.25%胰蛋白酶:將0.25g胰蛋白酶用D-Hank’s液溶解,定容至100mL,置磁力攪拌器上使其全部溶解,用5.6%NaHCO3調(diào)整pH值在7.2~7.6之間,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝成5mL/瓶,-20℃保存,用前室溫融化,置4℃?zhèn)溆?;?)PBS:分別精密稱取0.20g KCl,0.24g KH2PO4,8.0g NaCl,3.58g Na2HPO4·12H2O,將以上試劑溶于適量雙蒸水中,置磁力攪拌器上使其全部溶解,定容至1000mL,NaOH調(diào)整pH值為7.2,高壓蒸氣滅菌,放冷后置4℃?zhèn)溆?;?)MTT溶液:精密稱取MTT 0.5g,用無(wú)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成5mg/ml的溶液,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,放4℃鋁箔紙包住避光保存。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 山里黃根水提液的四個(gè)不同極性部位的提取

    (1)工藝路線如下:將山里黃根干燥藥材粉碎成粗粉(過(guò)2號(hào)篩),稱取,加入蒸餾水,加熱回流提取2次,料液比分別為1:20和1:10,每次1h,過(guò)濾,合并濾液,減壓濃縮至黏稠狀。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至無(wú)色,將萃取物及萃取后剩余水層減壓抽濾回收溶劑,分別放入真空干燥箱中加壓干燥成干膏,分別得到石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、剩余部位組。重復(fù)以上步驟,提取濃縮干燥成干膏,得到總提取物組。精密稱量,計(jì)算以上5種干膏得率。(2)細(xì)胞液培養(yǎng):用胎牛血清配制成含12%胎牛血清的的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,及20%胎牛血清的的高糖DMEM培養(yǎng)液。

    2.2 L-02肝細(xì)胞的培養(yǎng) (1)傳代培養(yǎng):將L-02肝細(xì)胞株凍存管從-80℃超低溫冰箱中取出,立即放入37℃水浴鍋中,持續(xù)搖晃,將冷存液速度融化,馬上加入到10倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(已提前于37℃預(yù)溫),顛倒混勻,離心,棄上清,將沉淀細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,細(xì)胞長(zhǎng)滿后,胰酶消化,傳代備用。(2)鋪板:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02肝細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,然后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮,用玻璃管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板中,每孔 100μL,置于 5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)24h。

    2.3 CCl4損傷模型的建立 吸取CCl4溶于適量DMEM培養(yǎng)基中,以少量的二甲基亞砜助溶,二甲基亞砜終濃度為0.1%(V/V),配成終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40mmol/L 的 CCl4溶液。加入到細(xì)胞貼壁后的96孔板中,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔(需要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),通過(guò)細(xì)胞抑制率結(jié)果,確定一定的濃度范圍,以確定造模的成功性)。

    2.4 MTT檢測(cè) 培養(yǎng)24h后,倒掉培養(yǎng)基,PBS洗板1次,每孔加入100μL終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液,無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后,倒掉MTT溶液,每孔加入150μL二甲基亞砜,充分震蕩15min,于酶標(biāo)儀570nm處檢測(cè)OD值(需要預(yù)實(shí)驗(yàn),通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定山里黃根水提液與MTT不反應(yīng))。

    2.5 計(jì)算公式 各平行孔取均值后計(jì)算,公式如下:細(xì)胞相對(duì)存活率計(jì)算:(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%;細(xì)胞相對(duì)抑制率計(jì)算:1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

    2.6 實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組,使用時(shí)用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,加入細(xì)胞級(jí)DMSO助溶,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每孔加入細(xì)胞液。模型組,終濃度為5mmol/L CCl4,方法參照上文CCl4損傷模型的建立。乙酸乙酯+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組,使用時(shí)用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,加入細(xì)胞級(jí)DMSO助溶,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,加入到CCl4損傷細(xì)胞液中,使藥液在96孔板中的終濃度為 100、300、600、1200、2400μg/mL。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。正丁醇+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組、剩余部位+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組、總提取物+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組方法同正丁醇+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照組(聯(lián)苯雙脂片),用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解,加入細(xì)胞級(jí)二甲基亞砜助溶,用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,加入到CCl4損傷細(xì)胞液中,使藥液在96孔板中的終濃度為 5、10、20、30、40μg/mL。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0分析應(yīng)用軟件處理分析數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(x±s)表示。各組間比較均采用單因素方差分析,組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率 精密稱取山里黃根干燥根粗粉(過(guò)2號(hào)篩)200g,按照上文2.1(1)項(xiàng)的方法提取分離干燥后,所得干膏得率如表1所示。由于石油醚萃取部位所得干膏比較少,不足以實(shí)驗(yàn)使用,所以后面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)把石油醚部位棄去。

    3.2 CCl4損傷L-02肝細(xì)胞模型的建立 CCl4濃度在0.5~40.0mmol范圍內(nèi),隨CCl4濃度增加,L-02肝細(xì)胞存活率降低。擬合細(xì)胞存活抑制率與CCl4劑量的量效關(guān)系曲線(圖1),可以清晰看出濃度越高抑制率越高,即存活率越低。研究表明,細(xì)胞存活率在50%~60%之間,可很好地顯示CCl4肝細(xì)胞的損傷與保護(hù)作用的差異。通過(guò)表2我們發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,CCl4濃度為5mmol/L時(shí),MTT法檢測(cè)OD值,得到肝細(xì)胞的抑制率為51.98%,細(xì)胞存活率為48.02%。因此,實(shí)驗(yàn)選取5mmol/L CCl4作用24h作為L(zhǎng)-02肝細(xì)胞損傷模型的造模劑量。

    表1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率

    圖1 CCl4不同濃度對(duì)L-02肝細(xì)胞抑制率的影響

    表2 不同濃度CCl4對(duì)細(xì)胞增殖的影響(x±s)

    3.3 山里黃根水提液不同萃取部位對(duì)CCl4造模細(xì)胞增殖的影響及有效部位的確定 根據(jù)上述各部位提取物L(fēng)D1和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,每個(gè)提取物設(shè)定5~6個(gè)劑量,篩選對(duì)CCl4損傷L-02肝細(xì)胞具有保護(hù)作用的部位。結(jié)果表明:用MTT法檢測(cè)山里黃根水提液不同萃取部位及總提取物對(duì)CCl4造模細(xì)胞增殖的作用,不同部位呈現(xiàn)了抑制或者促進(jìn)作用(見(jiàn)表3)。其中對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)作用的是正丁醇提取部位,在600、1200、2400μg/mL濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用且有意義(P<0.05),即細(xì)胞存活率升高。在1200μg/mL濃度時(shí)總提取部位對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用,可以表明山里黃根水提液對(duì)CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷有一定的保護(hù)作用,而保護(hù)作用明顯的是正丁醇部位。

    表3 各組對(duì)CCl4損傷細(xì)胞存活率的影響(x±s)

    4 討論

    有效部位的篩選是研究藥物作用機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié),是研究和開發(fā)新藥的必經(jīng)途徑。山里黃根水提液對(duì)損傷的肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用,因此我們通過(guò)CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷,而藥物作用可以使細(xì)胞生長(zhǎng)或者凋亡,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量的變化來(lái)初步篩選具有肝保護(hù)作用的藥物。目前檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量變化的方法有很多,如同位素法、摻入法等都具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn),但是由于步驟復(fù)雜需要特殊設(shè)備等,不能普遍使用。目前最常用的就是MTT法,該法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。

    MTT方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。MTT法利用96孔板可簡(jiǎn)便快捷規(guī)?;暮Y選藥物。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)(也可選擇570nm)處測(cè)定其光吸收值OD值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。所以缺點(diǎn)就是甲瓚影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,細(xì)胞點(diǎn)板時(shí)一定要吹打均勻,盡量減少誤差,千萬(wàn)不能把藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶析出,否則會(huì)加大結(jié)果誤差。

    畬藥山里黃根的干燥根作為新品種被收錄進(jìn)《浙江省中藥炮制規(guī)范》,并注明其功能為清熱、涼血、解毒,臨床上主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療,表現(xiàn)出較好的開發(fā)利用前景,值得關(guān)注并深入研究。

    本研究采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)山里黃根水提液進(jìn)行了不同極性部位的萃取,一共得到了四個(gè)部位,但是由于石油醚部位的干膏得率過(guò)低(0.042%),因此不能用于實(shí)驗(yàn),考慮到藥物本身對(duì)于MTT的影響,實(shí)驗(yàn)前做了MTT法測(cè)山里黃根水提液,沒(méi)有反應(yīng),所以實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有設(shè)置藥物顏色對(duì)照組。

    本研究以L-02細(xì)胞株建立CCl4損傷模型,測(cè)定了山里黃根不同部位提取物的毒性,明確了各提取物的安全劑量范圍,篩選出抗L-02細(xì)胞株CCl4損傷的有效部位——山里黃根水提液中正丁醇萃取部位,計(jì)算出ED50和TI。該提取物可提高CCl4損傷L-02細(xì)胞存活率,是山里黃根中具有保護(hù)肝損傷的有效部位。值得我們關(guān)注的是,正丁醇萃取部位600μg/mL時(shí)保護(hù)作用最好,隨著濃度的增大細(xì)胞存活率下降,所以可以判斷濃度與細(xì)胞存活率沒(méi)有依從關(guān)系,因此最適濃度是我們進(jìn)一步研究的問(wèn)題之一。此外,總提取物組在濃度1200μg/mL時(shí)具有保護(hù)作用,可能由于相同濃度下正丁醇部位的成分含量少,所以細(xì)胞存活率相對(duì)較低。因此,在以后的研究中,我們將繼續(xù)考察正丁醇部位在藥物作用的不同時(shí)間,如藥物作用24、48、72h后,細(xì)胞存活率的變化。研究正丁醇部位對(duì)受損肝細(xì)胞保護(hù)作用與藥物作用時(shí)間變化的關(guān)系。該有效部位提取物抗CCl4損傷的機(jī)制以及在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需更進(jìn)一步的研究。

    [1]浙江省食品藥品監(jiān)督管理局.浙江省中藥炮制規(guī)范[S].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2006:550.

    [2]于洋,高昊,戴毅,等.梔子屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].中草藥,2010,41(1):148-153.

    [3]王偉影,毛菊華,陳張金,等.畬藥山里黃根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥物分析雜志,2015,(6):1105-1109.

    [4]周瓊,劉芳萍,劉穎姝,等.四氯化碳致小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型建立方法的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(6):77-81.

    [5]魏小果.甘露消毒丹對(duì)四氯化碳所致急性肝損傷大鼠的影響[J].西部中醫(yī)藥,2015,28(7):17-19.

    [6]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生版社,2002:1346.

    [7]劉建文.藥理實(shí)驗(yàn)方法一新技術(shù)與新方法[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003:168.

    [8]應(yīng)躍躍,趙白,王喜周.梔子根化學(xué)成分和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,23(6):511-513.

    [9]曹慶生,李志超,楊寶友,等.矮地茶黃酮對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].華西藥學(xué)雜志,2016,31(1):43-45.

    [10]趙杰,孫設(shè)宗,官守濤,等.半枝蓮多糖對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷保護(hù)作用的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2012,19(1):39-40.

    [11]苗明三,魏榮銳.大棗多糖對(duì)乙硫氨酸及撲熱息痛所致小鼠肝損傷模型的保護(hù)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,8(25):1290-1293.

    猜你喜歡
    水提液正丁醇存活率
    正丁醇和松節(jié)油混合物對(duì)組織脫水不良的補(bǔ)救應(yīng)用
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬(wàn)噸的魚要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬(wàn)斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    大風(fēng)子正丁醇部位化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:48
    三葉青藤正丁醇部位化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:08
    中華抱莖蓼正丁醇部位化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:25
    續(xù)斷水提液誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:52
    桂枝等18種中藥材水提液對(duì)5-脂肪氧化酶(5-LOX)活性的抑制作用
    人參水提液通過(guò)免疫調(diào)節(jié)TAMs影響A549增殖
    中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:15
    十分钟在线观看高清视频www| 曰老女人黄片| 又大又爽又粗| 国产精品九九99| 国产不卡av网站在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 精品久久久精品久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲人成电影观看| 午夜福利欧美成人| 免费看a级黄色片| 亚洲欧美激情在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 日韩视频一区二区在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 久久九九热精品免费| 精品免费久久久久久久清纯 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产一区二区在线观看av| 少妇的丰满在线观看| 久热这里只有精品99| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品国产乱码久久久久久小说| 最新美女视频免费是黄的| 手机成人av网站| 精品亚洲成国产av| 亚洲熟妇熟女久久| 久久国产精品大桥未久av| 又紧又爽又黄一区二区| 91字幕亚洲| 我的亚洲天堂| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美在线黄色| 亚洲欧美激情在线| 欧美久久黑人一区二区| 午夜老司机福利片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99香蕉大伊视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品少妇内射三级| 亚洲专区字幕在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久国产精品影院| 12—13女人毛片做爰片一| 国产成人啪精品午夜网站| 久久香蕉激情| 十八禁网站网址无遮挡| 宅男免费午夜| 少妇被粗大的猛进出69影院| 1024香蕉在线观看| 国产精品.久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 中文字幕最新亚洲高清| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲视频免费观看视频| 69精品国产乱码久久久| 色播在线永久视频| 91成人精品电影| 国产在线免费精品| bbb黄色大片| 在线观看免费高清a一片| 亚洲专区中文字幕在线| 大香蕉久久网| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产av国产精品国产| 999精品在线视频| 精品乱码久久久久久99久播| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲色图综合在线观看| 韩国精品一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜91福利影院| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 激情在线观看视频在线高清 | 老司机靠b影院| 国产精品.久久久| 婷婷成人精品国产| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产成人啪精品午夜网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 午夜免费成人在线视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜福利视频在线观看免费| 黄色视频不卡| 日本a在线网址| 午夜福利在线观看吧| 国产成人精品久久二区二区91| 无人区码免费观看不卡 | 精品久久蜜臀av无| xxxhd国产人妻xxx| 女同久久另类99精品国产91| 欧美日韩亚洲高清精品| 91成人精品电影| 男女床上黄色一级片免费看| 男女边摸边吃奶| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄色 视频免费看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线观看免费高清a一片| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 国产日韩欧美视频二区| 国产不卡一卡二| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产在视频线精品| 另类亚洲欧美激情| 91av网站免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 捣出白浆h1v1| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美精品一区二区免费开放| 一二三四在线观看免费中文在| 免费av中文字幕在线| 国产麻豆69| 国产激情久久老熟女| 69av精品久久久久久 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 老汉色∧v一级毛片| 国产日韩欧美在线精品| 考比视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美性长视频在线观看| 少妇 在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 99在线人妻在线中文字幕 | 狠狠狠狠99中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品国产一区二区久久| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久国产精品大桥未久av| 无人区码免费观看不卡 | 欧美日韩黄片免| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品一区二区免费欧美| 精品一区二区三区av网在线观看 | 成人国产一区最新在线观看| 一区二区av电影网| 久热这里只有精品99| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费在线观看日本一区| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美人与性动交α欧美软件| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 丝袜在线中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜福利一区二区在线看| 国产真人三级小视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 大陆偷拍与自拍| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 婷婷成人精品国产| 亚洲成人免费av在线播放| 精品人妻1区二区| 我要看黄色一级片免费的| 色播在线永久视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品亚洲成a人片在线观看| 考比视频在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 丁香六月天网| 曰老女人黄片| 不卡av一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 美女午夜性视频免费| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | www日本在线高清视频| 亚洲一区中文字幕在线| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美黑人精品巨大| 久久久水蜜桃国产精品网| 99国产精品一区二区蜜桃av | 十八禁高潮呻吟视频| 国产亚洲一区二区精品| av线在线观看网站| 两个人免费观看高清视频| 视频区欧美日本亚洲| av超薄肉色丝袜交足视频| 中文字幕色久视频| 午夜老司机福利片| 国产在线免费精品| 欧美乱妇无乱码| 国产精品电影一区二区三区 | 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 午夜视频精品福利| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 啦啦啦免费观看视频1| 99re在线观看精品视频| 精品一品国产午夜福利视频| 人妻 亚洲 视频| 妹子高潮喷水视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产av国产精品国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 91成年电影在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品1区2区在线观看. | 一边摸一边做爽爽视频免费| www日本在线高清视频| 国产1区2区3区精品| 青青草视频在线视频观看| 在线播放国产精品三级| 大码成人一级视频| 桃花免费在线播放| 久久香蕉激情| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲美女黄片视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国精品久久久久久国模美| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美精品av麻豆av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 少妇精品久久久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看 | 日韩中文字幕视频在线看片| 午夜日韩欧美国产| 在线观看www视频免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99riav亚洲国产免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 日日夜夜操网爽| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品国产区一区二| 久热这里只有精品99| 18禁美女被吸乳视频| 美女主播在线视频| 一级毛片女人18水好多| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲全国av大片| 国产三级黄色录像| 国产成人影院久久av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲国产看品久久| a级片在线免费高清观看视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产熟女午夜一区二区三区| 怎么达到女性高潮| 久久精品国产a三级三级三级| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 多毛熟女@视频| 国产精品亚洲一级av第二区| tube8黄色片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 麻豆国产av国片精品| 久久久久精品国产欧美久久久| av国产精品久久久久影院| 亚洲avbb在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品熟女久久久久浪| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人av一区二区三区在线看| 午夜激情av网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 热99国产精品久久久久久7| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 高清欧美精品videossex| av网站免费在线观看视频| 香蕉国产在线看| 国产av又大| 美女视频免费永久观看网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩欧美国产一区二区入口| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲avbb在线观看| 国产激情久久老熟女| 国产成人免费无遮挡视频| xxxhd国产人妻xxx| 脱女人内裤的视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费不卡黄色视频| 性少妇av在线| 成人18禁在线播放| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久精品国产a三级三级三级| 成人免费观看视频高清| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品 欧美亚洲| 丰满少妇做爰视频| 亚洲第一av免费看| 久久狼人影院| 在线观看人妻少妇| 久久中文看片网| 久久性视频一级片| av电影中文网址| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美日韩精品网址| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 极品人妻少妇av视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久中文看片网| 国产精品免费大片| 一区福利在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品乱久久久久久| videos熟女内射| 桃红色精品国产亚洲av| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久国内视频| 午夜两性在线视频| 国产黄频视频在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲天堂av无毛| 一区二区三区激情视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看www视频免费| 亚洲av国产av综合av卡| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产欧美日韩一区二区三| 在线av久久热| 天天影视国产精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 大片电影免费在线观看免费| 男人舔女人的私密视频| 久久亚洲真实| 五月天丁香电影| 性色av乱码一区二区三区2| 一区二区三区乱码不卡18| 一个人免费在线观看的高清视频| 伦理电影免费视频| 一进一出好大好爽视频| 91老司机精品| 一区福利在线观看| av一本久久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产主播在线观看一区二区| 黄色丝袜av网址大全| 久久久欧美国产精品| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 久9热在线精品视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一夜夜www| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩欧美免费精品| 757午夜福利合集在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 91九色精品人成在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品国产综合久久久| 国产有黄有色有爽视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 成在线人永久免费视频| 久久精品国产综合久久久| 天天添夜夜摸| 国产精品久久久久成人av| 男女免费视频国产| 水蜜桃什么品种好| 亚洲人成电影观看| 国产成人欧美| 最黄视频免费看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| www.自偷自拍.com| 日本wwww免费看| 91字幕亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 丝瓜视频免费看黄片| 一区在线观看完整版| 动漫黄色视频在线观看| 男人操女人黄网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 无人区码免费观看不卡 | 国产精品欧美亚洲77777| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 成人特级黄色片久久久久久久 | 老司机深夜福利视频在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 岛国在线观看网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99香蕉大伊视频| 男人舔女人的私密视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 丝袜喷水一区| 一级片'在线观看视频| 男女无遮挡免费网站观看| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲第一青青草原| 国精品久久久久久国模美| 国产欧美亚洲国产| 亚洲专区字幕在线| 国产成人精品无人区| 9热在线视频观看99| a在线观看视频网站| 国产亚洲av高清不卡| 99riav亚洲国产免费| 激情在线观看视频在线高清 | 欧美大码av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利视频在线观看免费| 老司机午夜福利在线观看视频 | 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品影院久久| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美黑人精品巨大| xxxhd国产人妻xxx| 女性生殖器流出的白浆| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产精品 国内视频| 曰老女人黄片| 久久性视频一级片| 成人国产一区最新在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 正在播放国产对白刺激| 日本黄色日本黄色录像| 无限看片的www在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av福利片在线| 精品亚洲成国产av| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品 国内视频| 午夜激情av网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产成人一精品久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日本欧美视频一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲久久久国产精品| 色播在线永久视频| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩黄片免| 色婷婷av一区二区三区视频| 午夜福利欧美成人| 久久ye,这里只有精品| 岛国毛片在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲五月色婷婷综合| 99热国产这里只有精品6| 亚洲成人免费av在线播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 我的亚洲天堂| 老司机影院毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 两性夫妻黄色片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一级片'在线观看视频| 黄片小视频在线播放| 亚洲国产欧美网| 日本a在线网址| 麻豆乱淫一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲欧美色中文字幕在线| 精品第一国产精品| 在线观看免费视频网站a站| 777米奇影视久久| 亚洲专区字幕在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 成人黄色视频免费在线看| 成人特级黄色片久久久久久久 | 免费观看a级毛片全部| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲,欧美精品.| 在线看a的网站| 色播在线永久视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久精品94久久精品| 乱人伦中国视频| 操出白浆在线播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 电影成人av| 亚洲色图av天堂| 久久人妻熟女aⅴ| 色婷婷久久久亚洲欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99国产精品一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 交换朋友夫妻互换小说| 岛国在线观看网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 91成人精品电影| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜激情久久久久久久| 日韩视频在线欧美| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜福利乱码中文字幕| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品一区二区三卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 乱人伦中国视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 999久久久国产精品视频| 亚洲人成电影免费在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 十八禁人妻一区二区| 蜜桃国产av成人99| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩免费av在线播放| 日本一区二区免费在线视频| 嫩草影视91久久| 日本wwww免费看| tube8黄色片| 亚洲国产av新网站| 老司机靠b影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 色精品久久人妻99蜜桃| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 搡老乐熟女国产| 18禁国产床啪视频网站| av天堂久久9| 免费在线观看完整版高清| 精品国内亚洲2022精品成人 | 他把我摸到了高潮在线观看 | 深夜精品福利| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 女性被躁到高潮视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美性长视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 在线 av 中文字幕| 久久免费观看电影| 国产日韩欧美视频二区| 一区二区三区精品91| 男人舔女人的私密视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 男女午夜视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品久久久av美女十八| 一级片'在线观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡| 满18在线观看网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕制服av| 久9热在线精品视频| 亚洲熟女毛片儿| 操出白浆在线播放| 新久久久久国产一级毛片| 黄色片一级片一级黄色片| 老熟女久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲伊人色综图| 亚洲免费av在线视频| 啦啦啦免费观看视频1| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成人免费无遮挡视频| 香蕉丝袜av| www日本在线高清视频| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 欧美日韩黄片免| 欧美在线黄色| 中文字幕色久视频| 午夜福利乱码中文字幕| www.熟女人妻精品国产| 天堂动漫精品| 丝袜美足系列| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲人成电影观看|