脂聯(lián)素基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征的相關(guān)性研究

林峰芳孫 霞 張玲云

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種多基因遺傳病，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)其遺傳特點(diǎn)展開了大量研究，但是并未發(fā)現(xiàn)有與PCOS發(fā)病直接相關(guān)的基因[1-2]。近年來脂聯(lián)素基因（ADIPOQ）與PCOS的相關(guān)性成為研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ADIPOQ單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)包括rs1501299和rs2241766[3]，研究[4]顯示這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與糖尿病、心血管疾病、肥胖等相關(guān)，也有研究[5]顯示這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與PCOS相關(guān)，但尚存爭(zhēng)議。另外有報(bào)道[6]稱ADIPOQ的另兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs17300539和rs12495941與脂聯(lián)素水平有關(guān)，但鮮有其與PCOS的相關(guān)性報(bào)道。本研究通過分析PCOS患者與不孕不育對(duì)照組患者 ADIPOQ的 rs17300539、rs1501299、rs2241766、rs12495941四個(gè)單核苷酸多肽位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布的差異探討ADIPOQ多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性，為研究PCOS的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選擇2012年3月—2016年10月奉化區(qū)婦幼保健院收治的多囊卵巢綜合征患者65例，平均年齡（27.85±4.18）歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）（25.45±3.87）kg/m2。多囊卵巢綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）偶發(fā)排卵或者沒有排卵；（2）臨床生化指標(biāo)顯示雄激素過多癥；（3）卵巢多囊樣改變：B超檢查顯示卵巢體積增加10mL以上，至少有一側(cè)的卵巢的直徑在2～9mm卵泡在12個(gè)以上。另外根據(jù)研究組患者的年齡、BMI等隨機(jī)選擇同期在我院就診的不孕不育患者60例作為對(duì)照組，平均年齡（27.79±6.25）歲，BMI（25.41±4.13）kg/m2。該組患者主要是由于男方因素或者輸卵管因素導(dǎo)致不孕。兩患者年齡、民族、BMI等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。排除標(biāo)準(zhǔn)：有分泌雄激素腫瘤；先天腎上腺皮質(zhì)增生；Cushing綜合征；有吸煙、酗酒等不良習(xí)慣的患者；有甲狀腺疾病、高血壓、心血管疾病、糖尿病等患者；近半年內(nèi)服用過避孕藥、促排卵藥物、雄激素藥物、糖皮質(zhì)激素、高血壓藥物等的患者。本研究獲得了奉化區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，每位參與研究的患者均簽署了知情同意書。

1.2 方 法 采集所有研究對(duì)象的空腹靜脈血約4mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用全血基因組抽提試劑盒抽提基因組DNA，試劑盒為QIAamp DNA抽提試劑盒（Qiagen，編號(hào)51183），抽提后使用50μLddH2O洗脫。PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因位點(diǎn)，rs17300539位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列（軟件為Primer Premier 6.0）為：上游 5’-ACTCTGCTGAGATGGACG GA-3’；下游上游 5’-GGGATGAGGGTGAAGATGG G-3’。rs1501299位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列為：上游5’-GGCCTCTTTCATCACAGACC-3’；下游上游5’-AGA TGCAGCAAAGCCAAAGT-3’。rs2241766 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列為：上游5’-GAAGTAGACTCTGCTGAGAT GG-3’；下游上游 5’-TATCAGTGTAGGAGGTCTGTG ATG-3’。rs12495941位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物為：上游5’-T AGTGAGCCGAGATTGTGC-3’；下游 5’-TCCTTAGG CATGTAGCTTTCC—3’。PCR 擴(kuò) 增體系為：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）5μL，dNTP mix 5μL，上下游引物各 1μL，TaKaRa LA Taq（5U/μL）0.5μL，模板 DNA2μL，ddH2O35.5μL，總體積 50μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃，5min；94℃，30sec；60℃（rs2241766）或者 58℃（rs17300539、rs1501299、rs12495941），30sec；72℃，45sec；35個(gè)循環(huán)后 72℃延伸 10min。將 PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化后送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判定等位基因和基因型情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件，計(jì)數(shù)資料表示方法為[n（%）]，采用 χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用 Logistic 回歸分析基因型的OR值，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs17300539位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

研究組和對(duì)照組rs17300539位點(diǎn)基因型之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.85；P=0.03），且研究組患者rs17300539位點(diǎn)A等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.38；P=0.04），rs17300539 位點(diǎn)AA基因型患者PCOS的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于GG基因型（OR=3.15，P=0.00），見表 1。

2.2 rs1501299位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較

研究組和對(duì)照組rs1501299位點(diǎn)基因型之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.75；P=0.02），且研究組患者rs1501299位點(diǎn)C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，A等位基因頻率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.38；P=0.04），rs1501299 位點(diǎn) CC 基因型患者PCOS的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于AA基因型（OR=2.75，P=0.01），詳見表 2。

2.3 rs2241766位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較研究組和對(duì)照組rs2241766位點(diǎn)基因型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組rs2241766位點(diǎn)T等位基因和G等位基因頻率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

2.4 rs12495941位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較

研究組和對(duì)照組rs12495941位點(diǎn)基因型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組rs12495941位點(diǎn)G等位基因和T等位基因頻率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 4。

3 討論

PCOS是由多個(gè)基因控制的遺傳病，能夠影響機(jī)體組織、細(xì)胞的功能，嚴(yán)重影響患者的生命健康，研究PCOS的遺傳學(xué)特性成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，主要是一些參與調(diào)控生育的基因與PCOS的發(fā)病相關(guān)，例如與促性腺激素有關(guān)的基因等[9]。另外，臨床研究[10-11]顯示，由于與PCOS的發(fā)病相關(guān)的基因具有多態(tài)性，因而其臨床表現(xiàn)也呈現(xiàn)多樣性。近年來關(guān)于ADIPOQ基因多態(tài)性位點(diǎn)的研究也成為熱點(diǎn)之一，這其中以 rs17300539、rs1501299、rs2241766、rs12495941四個(gè)單核苷酸多肽位點(diǎn)為主，但是由于受到人種、地域的差異以及樣本量的影響，研究結(jié)果并不一致[12-13]。

3.1 rs17300539位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs17300 539位點(diǎn)位于ADIPOQ基因的啟動(dòng)子區(qū)域，相關(guān)研究顯示該區(qū)域主要與高血壓、糖尿病等相關(guān)疾病的發(fā)病有關(guān)[12]。有研究[14]顯示，rs17300539基因位點(diǎn)與肥胖的發(fā)生相關(guān)，研究[15]顯示rs17300539與胰島素的分泌水平和血清脂聯(lián)素的分泌水平相關(guān)，從本研究結(jié)果中可以看出，研究組患者rs17300539位點(diǎn)A等位基因頻率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），rs17300539位點(diǎn)AA基因型患者PCOS的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于GG基因型（P＜0.05），由此 rs17300539與 PCOS的發(fā)生具有相關(guān)性。

表1 rs17300539位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表2 rs1501299位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表3 rs2241766位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表4 rs12495941位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

3.2 rs1501299位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs1501 299位點(diǎn)在ADIPOQ基因上位于第二個(gè)內(nèi)含子，據(jù)相關(guān)對(duì)韓國(guó)PCOS患者的研究顯示其與PCOS有相關(guān)性[16]，但是據(jù)相關(guān)研究顯示該位點(diǎn)與伊朗人的PCOS的發(fā)病并無相關(guān)性[17]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者rs1501299位點(diǎn)C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，A等位基因頻率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），rs1501299位點(diǎn)CC基因型患者PCOS的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于AA基因型（P＜0.05），說明 rs1501299位點(diǎn)與 PCOS的發(fā)生具有相關(guān)性。

3.3 rs2241766位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs2241 766位點(diǎn)位于ADIPOQ基因的第二個(gè)外顯子區(qū)域，該位點(diǎn)與PCOS的相關(guān)性具有一定的爭(zhēng)議，有研究[18]顯示其與PCOS的發(fā)病關(guān)系密切，也有研究[5]顯示其與PCOS的發(fā)生并無顯著相關(guān)性，本研究結(jié)果可以看出研究組和對(duì)照組rs2241766位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分析原因可能是該位點(diǎn)與PCOS的相關(guān)性受人種、地域和樣本量等因素影響。

3.4 rs12495941位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs12495 941位點(diǎn)分布于ADIPOQ基因的第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，針對(duì)該位點(diǎn)的研究目前較少，且研究多針對(duì)該位點(diǎn)與糖尿病或者心血管疾病相關(guān)，有研究[15]顯示該位點(diǎn)與PCOS的發(fā)病并不相關(guān)，本研究結(jié)果顯示研究組和對(duì)照組rs12495941位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布之間的差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），由此可以看出rs12495941位點(diǎn)與PCOS的發(fā)病并不相關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果[5]一致。然而本次研究受客觀條件的限制導(dǎo)致樣本量比較小，并沒有區(qū)分患者的民族差異等因素，因此可能對(duì)研究結(jié)果造成一定的影響，有必要增加樣本量和區(qū)分不同民族患者，以深度分析其內(nèi)在相關(guān)性。

綜上所述，rs17300539位點(diǎn)與rs1501299位點(diǎn)可能是多囊卵巢綜合征的易感基因位點(diǎn)，但是還需要進(jìn)一步研究數(shù)據(jù)支持。

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