結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株大片段的多態(tài)性研究

謝彤 孫蕊 巨韓芳 王春花 穆成 王志銳 趙慧

結(jié)核病的分子流行病學(xué)研究提示，受環(huán)境和宿主因素的影響，全球不同地區(qū)流行的主要結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的主要基因型并不相同。在所發(fā)現(xiàn)的MTB基因型中，北京基因型的流行在全球傳播的范圍最廣[1]。北京基因型MTB菌株與其他基因型菌株相比，該基因型在低流行區(qū)更容易在人群中發(fā)生近期傳播，從而導(dǎo)致感染該基因型的結(jié)核病患者比例呈逐年升高的趨勢[2]。北京基因型MTB較其他基因型菌株更容易產(chǎn)生耐藥，而產(chǎn)生的耐藥菌株又促進了北京基因型MTB在人群中的傳播，因此，在有些地區(qū)的流行病學(xué)研究顯示，北京基因型與耐藥結(jié)核病、特別是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的傳播密切相關(guān)[3]。我國是北京基因型MTB的高流行區(qū)，特別是在北方地區(qū)，大約90%臨床分離的MTB菌株屬于北京基因型，是全球已報道北京基因型MTB流行最高的地區(qū)[4]。

對基因組分析證實，北京基因型MTB在進化過程會發(fā)生插入序列6110(IS6110)的轉(zhuǎn)位和特異性的差異區(qū)域(region of difference，RD)缺失。根據(jù)該基因型菌株基因組NTF(noise transfer function)區(qū)域中IS6110是否存在，北京基因型被分為古代與現(xiàn)代兩個亞型[5]。北京基因型古代株的NTF區(qū)中沒有IS6110，而北京基因型現(xiàn)代株NTF區(qū)中至少含有1個IS6110。此外，不同的北京基因型菌株在進化過程中還會出現(xiàn)不同的RD片段缺失，由此產(chǎn)生菌株大片段多態(tài)性。依據(jù)不同MTB菌株基因組中RD181、RD150以及RD142的缺失情況，北京基因型被分為5個進化分支[6]。筆者對天津地區(qū)臨床實驗室分離培養(yǎng)獲得的北京基因型MTB菌株基因組中RD片段的多態(tài)性與NTF區(qū)中IS6110進行分析，以期揭示在天津地區(qū)流行的北京基因型菌株所形成的各個分支及其流行的狀況。

材料和方法

1.菌株來源：選取天津市結(jié)核病參比實驗室收集的2014年1月至2016年6月從天津地區(qū)結(jié)核病患者痰標本中分離培養(yǎng)的北京基因型MTB，共567株。其中，308株分離培養(yǎng)自天津市區(qū)(和平區(qū)、河?xùn)|區(qū)、河西區(qū)、南開區(qū)、河北區(qū)和紅橋區(qū))結(jié)核病患者，221株分離培養(yǎng)自濱海新區(qū)(包括塘沽、漢沽、大港)、環(huán)城區(qū)(包括東麗、西青、津南、北辰)及其他區(qū)縣(包括武清、寶坻、寧河、薊州)，38株分離培養(yǎng)自監(jiān)獄局系統(tǒng)結(jié)核病患者。所有菌株經(jīng)對硝基苯甲酸試驗和噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基生長試驗，排除非結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。H37Rv標準株購自中國藥品生物制品檢定所。

2. MTB基因組提?。号R床分離培養(yǎng)的MTB菌落轉(zhuǎn)移至裝有450 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的1.5 ml Eppendorf管中，細菌經(jīng)80 ℃、60 min滅活與溶菌酶消化后，采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取菌株的基因組DNA[7]。提取后的基因組DNA溶于1×TE緩沖液中，基因組提取所需試劑均購自美國Sigma公司。

3. 北京基因型MTB鑒定：根據(jù)北京基因型MTB的基因組中RD207缺失這一特征，通過多重PCR試驗分析菌株基因組在Rv2616至Rv2819區(qū)域的缺失情況。在PCR反應(yīng)體系中同時加入2對引物，分別針對北京基因型基因組中的Rv2820區(qū)域和北京基因型菌株基因組中缺失的Rv2819區(qū)域。25 μl PCR反應(yīng)體系中包括2×Taq Master-Mix 12.5 μl(購自北京天根生化科技有限公司)、終濃度為0.4 μmol/L的引物及10～50 ng的菌株基因組DNA。若MTB為北京基因型，則PCR產(chǎn)物擴增片段長度為393 bp；而非北京基因型PCR擴增產(chǎn)物片段長度為570 bp[7]。

4.基因組NTF區(qū)域IS6110分析：北京基因型菌株基因組NTF 區(qū)IS6110 插入序列的分析采用Wada等[8]報道的方法。使用上游引物MDR-6與下游引物MDR-6r分析NTF 區(qū)是否存在IS6110，如果含有IS6110，則為現(xiàn)代株，其擴增產(chǎn)物為1.5 kb；反之則為古代株，其擴增產(chǎn)物為302 bp。

5.RD多態(tài)性分析：采用多重PCR分別分析北京基因型菌株基因組中RD105、RD181、RD150與RD142差異區(qū)域的缺失情況，根據(jù)PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物的長度確定RD序列的缺失或完整，引物序列參考Reed等[9]的報道。在50 μl PCR反應(yīng)體系中含有25 μl的Q5 Hight-Fidelity 2×Master-Mix Taq酶(購自北京NEB有限公司)，2.4 μl 10 μmol/L的引物，以及10～50 ng的基因組DNA。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)10 min。

結(jié) 果

1.基本情況：567株MTB臨床分離株中，517株為北京基因型，占91.2%，是絕對的優(yōu)勢菌株。對517株北京基因型菌株NTF區(qū)IS6110分析，70株(13.5%)為古代株，即菌株的NTF區(qū)不含有IS6110；447株(86.5%)為現(xiàn)代株，其基因組NTF區(qū)中存在IS6110。

2.基于大片段多態(tài)性的進化分支：517株北京基因型菌株根據(jù)基因組中NTF區(qū)IS6110的存在情況和RD的多態(tài)性被分為5個進化分支(表1)。本研究中所有的北京基因型菌株基因組中均發(fā)生RD105缺失?；蚪M中存在RD181片段的RD181(+)菌株被認為是北京基因型早期進化分支，在所有的北京基因型菌株中RD181(+)菌株為22株(4.3%)，RD181(-)的北京型菌株為495株(95.7%)。RD181(-)菌株中，基因組NTF區(qū)無IS6110的北京基因型古代株為41株，占全部北京基因型菌株的7.9%。22株RD181(+)的菌株中，其基因組NTF區(qū)均無IS6110序列，即均為北京基因型古代株。在447株北京基因型現(xiàn)代菌株中，404株基因組中存在完整的RD150序列，占全部北京基因型菌株的78.1%；43株為RD150缺失的北京基因型現(xiàn)代株，占全部北京基因型菌株的8.3%，占全部北京基因型現(xiàn)代株的9.6%(43/447)。70株北京基因型MTB古代株中，同樣發(fā)現(xiàn)有7株基因組發(fā)生RD150缺失，占全部北京基因型古代株的10.0%(7/70)。由此可見，根據(jù)大片段多態(tài)性分析天津地區(qū)流行的北京基因型MTB被分為5個分支，其中RD181(-)/RD150(+)的北京基因型現(xiàn)代株所占的比率最高，是北京基因型的主要流行分支(圖1)。RD142差異序列存在于所有分析的北京基因型菌株基因組中。

討 論

MTB在長期進化過程中其基因組會發(fā)生大片段的轉(zhuǎn)位插入或缺失，而這一變化可能會影響菌株的毒力和宿主對MTB的免疫，使某些菌株更容易在人群中傳播流行，在這一地區(qū)形成優(yōu)勢菌株，造成全球不同區(qū)域流行的MTB主要基因型也各不相同。全球范圍內(nèi)，不同地區(qū)進化出至少6個基因型，每個基因型的MTB基因組中都存在特異性的RD缺失序列。因此，通過分析菌株基因組中這些特異性的RD缺失序列，可以鑒定MTB所屬的基因型[10-11]。對從99個國家和地區(qū)流行的北京基因型MTB的分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該基因型大約在6600年前起源于包括我國東北在內(nèi)的東亞地區(qū)，隨著近代大規(guī)模人口遷徙的路徑逐漸擴散至全球各地[12]。北京基因型MTB的重要特征為RD207和RD105片段的缺失。雖然Rindi等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，極少數(shù)北京基因型MTB基因組中含有RD105差異序列，但在我國流行的北京基因型菌株基因組中還未發(fā)現(xiàn)含有RD105的報道，因此檢測RD207和RD105缺失情況可用于鑒定北京基因型MTB。

表1 517株5個分支北京基因型結(jié)核分枝桿菌菌株大片段多態(tài)性分析結(jié)果

注“+”：表示完整；“-”：表示缺失

矩形框中表示在菌株進化過程中RD序列的缺失和IS6110在NTF區(qū)的插入圖1 北京基因型結(jié)核分枝桿菌進化途徑和所形成的進化分支

根據(jù) RD片段多態(tài)性研究提出的北京基因型進化途徑中，MTB菌株首先發(fā)生RD207缺失進化成為北京基因型，隨后幾乎所有的北京基因型菌株發(fā)生RD105缺失。在以后的持續(xù)進化過程中不同的菌株按順序可能出現(xiàn)RD181、RD150和RD142的缺失[13]。本次研究顯示，RD181缺失的北京基因型菌株為495株，占95.7%，高于我國東部地區(qū)。對東部地區(qū)不同省市結(jié)核病患者臨床分離北京基因型菌株的兩項流行病學(xué)研究中，RD181(-)菌株僅占全部北京基因型菌株的67.8%和87.0%，提示北京基因型各個進化分支的菌株在我國不同地區(qū)的流行情況存在差異[14-15]。根據(jù)基因組NTF區(qū)中IS6110的存在與否，將北京基因型菌株分為古代株(IS6110缺失)和現(xiàn)代株(IS6110存在)。本研究的菌株中北京基因型的現(xiàn)代株為447株(86.5%)，與文獻報道我國東部地區(qū)現(xiàn)代株所占全部北京基因型菌株的87.1%相近[15]。

基于RD片段的多態(tài)性和IS6110在NTF區(qū)的插入情況，本次研究中的517株北京基因型MTB被分為5個分支，其中RD181(-)/RD150(+)的北京基因型現(xiàn)代株這一分支所占的比率最高(78.1%)。22株RD181(+)的菌株全部為北京基因型古代株，提示北京基因型菌株在進化過程中首先發(fā)生RD181的缺失，然后才出現(xiàn)IS6110在NTF的插入，進化順序與其他研究報道的結(jié)果一致[13,16]。本次研究發(fā)現(xiàn)7株RD150(-)的北京基因型古代株，這是基于大片段多態(tài)性分析北京基因型MTB進化研究中首次發(fā)現(xiàn)的進化分支，同時研究數(shù)據(jù)顯示RD150(-)的菌株在北京基因型MTB古代株和現(xiàn)代株的比例非常接近，分別占10.0%(7/70)和9.6% (43/447)，提示RD150大片段的缺失并不僅出現(xiàn)在北京基因型現(xiàn)代株中，而是在菌株進化成為現(xiàn)代株與古代株2個分支后，這2個分支的MTB在傳播過程中均有少量的菌株(大約10%)進一步發(fā)生RD150的缺失。筆者對基因組中大片段多態(tài)性分析表明，北京基因型菌株的進化路徑為MTB首先發(fā)生RD207和RD105缺失進化成為北京基因型，隨后出現(xiàn)RD181片段的缺失，然后發(fā)生IS6110序列在NTF區(qū)的插入形成現(xiàn)代北京基因型菌株；少量(大約10%)的古代北京基因型和現(xiàn)代北京基因型菌株在隨后的進化過程中出現(xiàn)RD150的缺失。Tsolaki等[6]的研究發(fā)現(xiàn)部分北京基因型菌株可能會出現(xiàn)RD142缺失。筆者的研究結(jié)果顯示北京基因型菌株基因組均含有完整的RD142序列，其他一些國內(nèi)外關(guān)于北京基因型進化的研究中，同樣也未發(fā)現(xiàn)RD142缺失的MTB[13-14]，提示RD142差異片段在北京基因型菌株中的多態(tài)性較低。

雖然在少數(shù)國家流行的北京基因型MTB以古代株為主，但在我國和全球的大部分地區(qū)北京基因型現(xiàn)代株的流行更為廣泛[12]。分子流行病學(xué)調(diào)查證實，北京基因型現(xiàn)代株容易在人群發(fā)生近期傳播和暴發(fā)流行。這一北京基因型分支更容易流行的機制還未完全闡明，與北京基因型古代株相比，RD150(+)的北京基因型現(xiàn)代菌株在誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答時，巨噬細胞釋放各類細胞因子水平明顯降低[17]。小鼠感染實驗證實RD150(+)北京基因型現(xiàn)代株較北京基因型古代株會對肺組織造成更大的病理損傷，提示這一進化分支具有更強的毒性[18]。此外，大規(guī)模的人群流行病學(xué)研究提示，北京基因型現(xiàn)代株較該基因型的古代株更容易逃避卡介苗接種所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，因此卡介苗的接種可能會促進北京基因型現(xiàn)代株在人群中的傳播[19]。上述的研究提示，鑒于天津地區(qū)流行的北京基因型分支為RD150(+)的現(xiàn)代株，而這一流行特點會為天津地區(qū)結(jié)核病的預(yù)防和治療工作提出更大的挑戰(zhàn)。同時本研究結(jié)果也說明，非常有必要在我國的其他地區(qū)開展對北京基因型各個亞型菌株流行的監(jiān)測工作。

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