• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    入境旅客攜帶蘋果中粉紅聚端孢菌的檢測(cè)與鑒定

    2018-03-06 00:30許萍萍粟寒王振華
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:孢菌分生孢子病菌

    許萍萍+粟寒+王振華

    摘要:首次建立了粉紅聚端孢菌(Trichothecium roseum)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,該檢測(cè)方法擴(kuò)增效率高、特異性好,靈敏度可達(dá)0.1 pg菌絲體DNA量;結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及致病性測(cè)定,對(duì)從機(jī)場(chǎng)入境旅客攜帶的蘋果中分離到的1株疑似菌株Tr-1685進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。Tr-1685實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快,菌落平展,邊緣不規(guī)則,表面形成淡粉紅色的霉層,產(chǎn)孢量豐富。分生孢子梗直立,長(zhǎng)短不一,頂端著生分生孢子。分生孢子雙細(xì)胞、光滑、棍棒狀,平均大小為17.5 μm×8.7 μm,基部細(xì)胞彎曲狀。該病原菌接種蘋果4 d后,出現(xiàn)褐色腐爛,8 d后出現(xiàn)淡粉色霉層及分生孢子。分離獲得的菌株Tr-1685鑒定為粉紅聚端孢菌,與實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果一致。

    關(guān)鍵詞:粉紅聚端孢菌(Trichothecium roseum); 入境旅客; 蘋果; 鑒定; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

    中圖分類號(hào):S41-32;S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2018)02-0067-06

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.017

    Abstract: The real-time PCR method of Trichothecium roseum was developed for the first time, and the method of T. roseum appeared high amplification efficiency and good specificity. Sensitivity of the method reached to 0.1 pg mycelium DNA amount. The isolate Tr-1685 similar to T. roseum which was obtained from imported apple carried by airport incoming passenger had been detected and identified using real-time PCR along with morphology obersevation and pathogenicity test. The real-time PCR result of the isolate Tr-1685 showed positive. The isolate bacterial strain grew fast on PDA media. The colony was flat and irregular in appearance,covered by light pink mould which produced lots of conidia. Conidiophores of the isolate were erect and different in length,which bore conidia at the tip. Conidia of the isolate was 17.5 μm×8.7 μm on average,which was smooth and clavate. Each conidium was two celled with curved basal cell. The isolate caused brown rot on apple 4 d after inoculation. Pinkish mould and conidia appeared 8 d after inoculation. The isolate Tr-1685 was identified as T. roseum,consistent with the result of the real-time PCR.

    Key words: Trichothecium roseum; incoming passengers; apple; identification; real-time PCR

    粉紅聚端孢菌(Trichothecium roseum)在分類上屬于子囊菌亞門、肉座菌目(Hypocreales)。該病菌的同物異名包括Trichothecium roseum、Hyphelia rosea、Puccinia rosea、Cephalothecium roseum和Dactylium roseum[1]。該菌在全世界多國(guó)廣泛分布,可以在不同的環(huán)境中生長(zhǎng),從落葉到水果上均可以發(fā)生,引起粉紅色腐爛癥狀,給農(nóng)業(yè)造成經(jīng)濟(jì)影響。同時(shí),粉紅聚端孢菌可以產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括真菌毒素,比如粉紅霉素B(Roseotoxins)和單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes),可以侵染并毀壞多種水果,并會(huì)對(duì)人類健康帶來(lái)重要影響[2]。該病原菌在蘋果、葡萄、番茄、西瓜和桃上都有危害的報(bào)道[2-7]。引起的病害曾在中國(guó)蘋果園引起巨大損失。該病菌既能在果園中引起危害,又能為害儲(chǔ)藏期果實(shí),并可在果實(shí)中潛伏侵染,隨病果遠(yuǎn)距離傳播。

    最近,徐州觀音國(guó)際機(jī)場(chǎng)口岸從入境旅客攜帶的蘋果中截獲一批病果,對(duì)病果進(jìn)行分離培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)為疑似單端孢屬病原菌。繼續(xù)對(duì)該病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,首次建立了T. roseum實(shí)時(shí)熒光PCR分子檢測(cè)方法,并根據(jù)柯赫氏法則(Kochs postulates)進(jìn)行了致病性測(cè)定,對(duì)該批病蘋果攜帶的病菌進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)材料 病原菌分離材料為徐州觀音國(guó)際機(jī)場(chǎng)入境旅客攜帶物中截獲的可疑蘋果病果,將疑似粉紅聚端孢菌的菌株編號(hào)為Tr-1685。致病性測(cè)定接種材料為健康蘋果。endprint

    1.1.2 參試菌株 選擇從蘋果上分離到的不同地理來(lái)源的粉紅聚端孢菌12份菌株,以及其他經(jīng)常在蘋果上發(fā)生的、不同已知地理來(lái)源的35種重要蘋果病原菌(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)。

    1.1.3 主要試劑 HR qPCR Master Mix購(gòu)自上海輝睿生物科技有限公司;EASY Dilution購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)方法的建立

    1.2.1 TaqMan引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)GenBank網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載所有粉紅聚端孢菌ITS基因序列,根據(jù)該物種ITS基因的保守序列區(qū)域及其中一個(gè)粉紅聚端孢菌菌株(登錄號(hào):EU552162.1),設(shè)計(jì)如下一對(duì)寡核苷酸引物和TaqMan探針,并對(duì)設(shè)計(jì)的引物和探針在GenBank網(wǎng)站上進(jìn)行同源性分析。TR-ITS-FP:5′-GACCACACGAACCCTGTTTAA-3′(194-214);TR-ITS-RP:5′-ATTTCGCTGCGTTCTTCATC-3′(298-317);TR-ITS-P:5′FAM-TGAGCGAGCCGAAAGGCAACAAA-BHQ1 3′(232-254)。其預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為124 bp。引物與探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

    1.2.2 DNA提取 直接采用經(jīng)典的CTAB法大量提取病菌基因組DNA,測(cè)定DNA濃度及純度,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?duì)已經(jīng)培養(yǎng)好的其他參試菌株少量提取菌絲DNA,可以采用Tooley等[8]的堿裂解法快速提取。取少量菌絲塊放入2 mL的離心管中,加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直徑3 mm的鋼珠,在球磨儀(Retsch MM400德國(guó))上以30次/s的頻率振蕩5 min。12 000 r/min離心10 min,取上清液以100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)稀釋10倍。DNA提取后直接進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

    1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 20 μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中含以下組分:HR qPCR Master Mix(2×)10 μL、上游引物TR-ITS-FP(10 μmol/L)及下游引物TR-ITS-RP各0.8 μL,TaqMan探針TR-ITS-P(10 μmol/L) 0.2 μL,DNA模板(1~10 ng)1 μL,補(bǔ)ddH2O至20 μL。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:50 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在ABI PRISM 7500 FAST實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需設(shè)置ROX校正。

    1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn) 選擇從蘋果上分離到的不同地理來(lái)源的粉紅聚端孢菌12份菌株及疑似菌株Tr-1685,以及其他經(jīng)常在蘋果上發(fā)生的、不同地理來(lái)源的35種重要蘋果病原菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性驗(yàn)證。

    1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn) 選取粉紅聚端孢菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC?誖13412TM,采用經(jīng)典的CTAB法提取菌絲體總DNA,并在超微量分光光度計(jì)(OneDrop OD-2000+)測(cè)定DNA濃度及純度。對(duì)提取的DNA定量為1 μg/μL,采用EASY Dilution對(duì)DNA溶液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度逐級(jí)稀釋,各取1 μL進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)。此時(shí)20 μL PCR反應(yīng)液中的DNA添加量分別相當(dāng)于100、10、1 ng和100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 pg的菌絲體DNA量。陰性對(duì)照為ddH2O。1.3 病原菌的組織分離與培養(yǎng)

    先用75%乙醇對(duì)果實(shí)進(jìn)行表面消毒,待乙醇揮發(fā)后,從病健交界處切取或用鑷子撕取邊長(zhǎng)約為5 mm的樣品,放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上,25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。觀察病菌菌落的生長(zhǎng)情況,將長(zhǎng)出的菌落及時(shí)置于新的PDA平板上進(jìn)行純化。

    1.4 病原菌形態(tài)學(xué)觀察與生物學(xué)測(cè)定

    對(duì)純化的疑似菌株繼續(xù)在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),對(duì)菌落的形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、分生孢子梗和分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行觀察和生物學(xué)性狀測(cè)定。培養(yǎng)3 d后開(kāi)始測(cè)量菌落直徑。在顯微鏡(ZEISS Imager M1)下觀察并拍攝分生孢子形態(tài),測(cè)量其大小,根據(jù)病菌的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

    1.5 病原菌PCR擴(kuò)增及序列分析

    采用真菌通用引物ITS4/ITS5(ITS4:5′-TCCTCC

    GCTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAAGT

    CGTAACAAGG-3′)對(duì)菌株Tr-1685基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:10×Buffer 5 μL(含Mg2+)、dNTP 1.0 μL(10 mmol/L)、引物各2.0 μL(10 μmol/L)、rTaq 0.4 μL(5 U/μL)模板DNA 2 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增;72 ℃延伸7 min后,保存于4 ℃。將PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,并進(jìn)行序列分析。

    1.6 致病性測(cè)定

    采用菌絲塊接種法。用4 mm孔徑的打孔器在菌株Tr-1685的菌落邊緣打孔取樣,作為接種菌絲塊。選用新鮮健康的蘋果果實(shí),先用75%乙醇對(duì)要接種的果實(shí)表面進(jìn)行消毒,再用相同的打孔器在接種部位打孔,切取少量果肉留下果皮,將菌絲塊接入果肉孔中后,蓋上果皮。將接種的蘋果放入無(wú)菌塑料袋中,25 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置無(wú)菌水接種作為對(duì)照。觀察記錄發(fā)病情況,并對(duì)果實(shí)的發(fā)病部位重新進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng),與接種菌株Tr-1685比較形態(tài)特征。endprint

    2 結(jié)果與分析

    2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

    2.1.1 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明,11份不同地理來(lái)源的粉紅聚端孢菌均具有良好的擴(kuò)增曲線,標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13412TM Ct為17.36,其他參試菌株序號(hào)2~11的Ct分別為17.36、18.34、17.00、17.45、11.36、10.40、17.25、19.71、24.50、14.24和10.39(圖1),疑似菌株Tr-1685 Ct為12.10,均為陽(yáng)性擴(kuò)增;而其他經(jīng)常在蘋果上發(fā)生的、不同地理來(lái)源的35種重要蘋果病原菌和陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增曲線,Ct>35。表明所設(shè)計(jì)的引物、探針,實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均能滿足粉紅聚端孢菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢測(cè)需要。

    2.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度試驗(yàn)的結(jié)果表明,粉紅聚端孢菌菌絲體DNA量從1 μg到0.1 pg范圍內(nèi),可以得到較好的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果(Ct<35)(圖2),Ct從小到大依次為13.19、16.18、19.60、23.27、26.50、29.99、32.75和34.49,表明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度可達(dá)0.1 pg。

    根據(jù)圖2制作出的粉紅聚端孢菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3(R2=0.995)。

    2.2 病菌生物學(xué)特性及形態(tài)特征

    2.2.1 菌落特征 取病果病健交界處果皮進(jìn)行組織分離,對(duì)疑似菌落Tr-1685粉紅聚端孢菌進(jìn)行純化,取直徑4 mm菌絲塊在PDA上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),菌落生長(zhǎng)速度較快,10 d后菌落布滿直徑9 cm培養(yǎng)皿。菌落特征表現(xiàn)為平展、呈顆粒狀和粉狀。菌落邊緣的顏色剛開(kāi)始為白色,之后變?yōu)榈姆奂t色,至桃紅色。菌落邊緣生長(zhǎng)不規(guī)則,產(chǎn)孢量豐富,菌落表面形成粉紅色的分生孢子堆,粉紅色霉層呈不規(guī)則輪紋形(圖4)。

    2.2.2 病菌無(wú)性階段形態(tài)特征 經(jīng)顯微鏡觀察,疑似菌株Tr-1685菌絲無(wú)色,有分枝。分生孢子梗直立,長(zhǎng)短不一,在測(cè)量的30根分生孢子梗中,最短的為84.5 μm,最長(zhǎng)為188.5 μm,單生或簇生,可在頂端產(chǎn)生單生的或成簇的分生孢子。這些分生孢子梗早期與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的菌絲難以區(qū)分,直至產(chǎn)生無(wú)性孢子。分生孢子從分生孢子梗頂端上不同方向上逐一脫落。成熟的分生孢子平均大小為17.5 μm×8.7 μm,光滑,棍棒狀(圖5)。分生孢子雙細(xì)胞,頂部細(xì)胞比彎曲的基部細(xì)胞稍大。分生孢子堆呈淡粉紅色,而在顯微鏡下為半透明狀。在培養(yǎng)基或寄主表面大量生長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)為飽滿的粉紅色。

    2.3 ITS序列分析

    采用真菌通用引物ITS4/ITS5對(duì)菌株Tr-1685基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,雙向測(cè)序及拼接,并在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果表明,菌株Tr-1685的核苷酸序列與粉紅聚端孢菌菌株(基因登錄號(hào)EU552162和JQ434579)的同源性最高,達(dá)到100%。

    2.4 致病性測(cè)定

    采用菌絲塊對(duì)新鮮健康的蘋果果實(shí)進(jìn)行接種,經(jīng)保濕培養(yǎng),蘋果果實(shí)3~4 d在接種部位出現(xiàn)褐色病斑,病斑擴(kuò)展較慢,8 d時(shí)在接種部位表面及周圍出現(xiàn)大量粉紅色霉層(圖6A),其上產(chǎn)生淡粉色分生孢子。剖開(kāi)發(fā)病的病果,可見(jiàn)果肉部分出現(xiàn)褐色病斑,向果核方向擴(kuò)展(圖6B)。對(duì)照無(wú)上述癥狀出現(xiàn),亦無(wú)粉紅色霉層產(chǎn)生。從接種發(fā)病的蘋果果實(shí)上可重新分離到性狀相同的菌株。致病性測(cè)定結(jié)果表明,該菌株可以侵染蘋果果實(shí)。

    3 小結(jié)與討論

    通過(guò)對(duì)蘋果病果上分離到的菌株Tr-1685進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)和致病性測(cè)定及形態(tài)學(xué)觀察,確定從徐州觀音國(guó)際機(jī)場(chǎng)入境旅客攜帶的蘋果中分離的病原菌Tr-1685為粉紅聚端孢菌。

    單端孢屬(Trichothecium)于1809年首次報(bào)道[2],目前包含73個(gè)記錄種,缺乏有性階段[2]。該屬的主要成員包括T. polybrochum、T. cystosporium、T. pravicovi和T. roseum[2]。粉紅聚端孢菌的分生孢子梗和分生孢子在形態(tài)上與其他3個(gè)主要種有所差異[2],因此,近年來(lái)對(duì)該屬的鑒定重點(diǎn)集中在對(duì)這些形態(tài)特征的研究上。另外,在分子檢測(cè)方面,目前還是采用常規(guī)PCR檢測(cè)方法,針對(duì)真菌基因組ITS區(qū)域和β-tubulin(TUB)基因5′端進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7],然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,再進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析,最終確定其種類。

    本研究首次建立了粉紅聚端孢菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)方法。在對(duì)引物和探針設(shè)計(jì)時(shí),對(duì)設(shè)計(jì)的探針TR-ITS-P在GeneBank網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì),要求與所有粉紅聚端孢菌不同地理的菌株同源性達(dá)到100%;并且盡量增大種間差異,如單端孢屬的3個(gè)主要成員T. polybrochum、T. cystosporium、T. pravicovi與TR-ITS-P序列的同源性在80%以下,保證設(shè)計(jì)的引物和探針具有很好的特異性。同時(shí),在建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系過(guò)程中,不斷優(yōu)化反應(yīng)體系,降低探針終濃度,調(diào)整引物和探針濃度最佳比例;摸索反應(yīng)條件,提高退火溫度從56 ℃到60 ℃。在進(jìn)行特異性驗(yàn)證時(shí),盡量多選取不同地理來(lái)源的粉紅聚端孢菌陽(yáng)性菌株和其他不同地理來(lái)源的重要蘋果病原菌35種進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明,所建立粉紅聚端孢菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分子檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高等特點(diǎn),適合對(duì)該病原菌開(kāi)展快速鑒定,尤其是早期診斷。

    粉紅聚端孢菌全世界發(fā)現(xiàn)大約有220種不同的植物寄主,在很多水果和蔬菜上引起紅腐癥狀[3]。該病害早期會(huì)出現(xiàn)白色粉狀霉層,最后發(fā)展為粉紅色。雖然有報(bào)道該病菌通常是次要致病菌[2],具有一定的腐生性,但是越來(lái)越多的證據(jù)表明,該病菌具有較強(qiáng)的致病性。在中國(guó)該病菌可引起蘋果心腐病,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4];在韓國(guó),該病菌可以引起葡萄發(fā)病,菌絲布滿果實(shí)表面,嚴(yán)重降低葡萄的品質(zhì)[5];在韓國(guó)和巴基斯坦,有報(bào)道該病菌可以侵染番茄[6,7];在日本、美國(guó)、南美洲、印度和英國(guó)有報(bào)道該病菌可以侵染厚皮甜瓜和西瓜,引起紅腐病[3];在香蕉和桃上也有發(fā)生危害的報(bào)道[3]。endprint

    研究表明粉紅聚端孢菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物粉紅霉素B[9],可以穿透蘋果果皮,形成病斑。同時(shí),該病菌會(huì)產(chǎn)生較高水平的真菌毒素,如T-2毒素是單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的一種[4],由于其致癌性,具有神經(jīng)毒性和免疫毒性,對(duì)食用感染該病蘋果的人群會(huì)造成潛在的威脅。同時(shí),該病菌引起葡萄病害,其產(chǎn)生的單端孢菌素(Trichothecin)和玫瑰菌素(Rosenonolactone)還會(huì)出現(xiàn)在葡萄酒中[10],造成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。

    粉紅聚端孢菌既能在果園和蔬菜基地引起危害,又能為害儲(chǔ)藏期的水果和蔬菜,并可在果實(shí)中潛伏侵染,隨病果遠(yuǎn)距離傳播。加強(qiáng)對(duì)水果和蔬菜上粉紅聚端孢菌的檢測(cè)和檢疫,重視該病菌的發(fā)生、傳播和防治,對(duì)保障中國(guó)水果安全生產(chǎn)和人類健康都具有重要意義。

    參考文獻(xiàn):

    [1] WIKIPEDIA. Trichothecium roseum[EB/OL].https://en.wikipedia.org/wiki/Trichothecium_roseum.

    [2] ONIONS A H S,ALLSOPP D,EGGINS H O W. Smith's Introduction to Industrial Mycology[M].7th ed.UK:Cambridge University Press,1981.

    [3] BATT C A,TORTORELLO M L. Encyclopedia of Food Microbiology[M].2nd ed.London:Elsevier Ltd,2014.

    [4] TANG Y,XUE H,BI Y,et al. A method of analysis for T-2 toxin and neosolaniol by UPLC-MS/MS in apple fruit inoculated with Trichothecium roseum[J].Food Additives & Contaminants:Part A,2014,32(4):480-487.

    [5] OH S Y,NAM K W,YOON D H. Identification of Aremonium acutatum and Trichothecium roseum isolated from grape with white stain symptom in Korea[J].Mycobiology,2014,42(3):269-273.

    [6] HAN K S,LEE S C,LEE J S,et al. First report of pink mold rot on tomato fruit caused by Trichothecium roseum in Korea[J].Research in Plant Disease,2012,18(4):396-398.

    [7] HAMID M I,HUSSAIN M,GHAZANFAR M U,et al. Trichothecium roseum causes fruit rot of tomato,orange,and apple in Pakistan[J].Plant Disease,2014,98(9):1271.

    [8] TOOLEY P W,BUNYARD B A,CARRAS M M,et al. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes[J].Applied Environment Microbiology,1997,63(4):1467-1475.

    [9] ABKA M,DRASTICHOV?魣 K,JEGOROV A,et al. Direct evidence of plant-pathogenic activity of fungal metabolites of Trichothecium roseum on apple[J].Mycopathologia,2006,162(1):65-68.

    [10] SERRA R,BRAGA A,VEN?魦NCIO A. Mycotoxin-producing and other fungi isolated from grapes for wine production, with particular emphasis on ochratoxin A[J].Research in Microbiology,2005,156(4):515-521.endprint

    猜你喜歡
    孢菌分生孢子病菌
    油松枯梢病菌孢子萌發(fā)率測(cè)定方法探索
    鐮孢菌與大豆根腐病研究進(jìn)展
    湖北省蔬菜根際土壤中的鐮孢菌分布特征
    四川省套作玉米莖腐病致病鐮孢菌的分離與鑒定
    油松枯梢病菌分生孢子器誘導(dǎo)方法探索
    小病菌影響鴉片戰(zhàn)爭(zhēng)
    頭狀莖點(diǎn)霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定(內(nèi)文第98~101頁(yè))圖版
    油茶炭疽病菌拮抗木霉菌的分離與篩選
    病菌來(lái)了 快穿好防菌衣
    尖鐮孢菌細(xì)胞色素P45055A1與NO相互作用的熒光光譜法研究
    午夜视频国产福利| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产91av在线免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 国精品久久久久久国模美| 精品久久国产蜜桃| 精品国产三级普通话版| 国产精品福利在线免费观看| 国内精品美女久久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 成人美女网站在线观看视频| 国产v大片淫在线免费观看| 国产 精品1| 久久精品久久精品一区二区三区| 中国三级夫妇交换| 日韩欧美精品v在线| 1000部很黄的大片| 女人久久www免费人成看片| 久久久精品免费免费高清| videos熟女内射| 亚洲人成网站在线播| 狂野欧美激情性bbbbbb| 在线观看免费高清a一片| 一边亲一边摸免费视频| 日本午夜av视频| 国产精品成人在线| 亚洲欧美精品专区久久| 国产老妇女一区| 伊人久久精品亚洲午夜| 尾随美女入室| 联通29元200g的流量卡| av黄色大香蕉| 极品教师在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 麻豆乱淫一区二区| 午夜福利视频精品| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品福利在线免费观看| av网站免费在线观看视频| 欧美区成人在线视频| 欧美人与善性xxx| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av二区三区四区| 亚洲在久久综合| 色视频www国产| 一区二区三区免费毛片| 欧美性感艳星| 亚洲精品色激情综合| 国产成人91sexporn| 五月伊人婷婷丁香| 一区二区三区精品91| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品一区二区在线观看99| 搞女人的毛片| 搞女人的毛片| 欧美高清成人免费视频www| 免费黄频网站在线观看国产| 日本三级黄在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 韩国av在线不卡| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成年人午夜在线观看视频| 一边亲一边摸免费视频| 国产成人精品婷婷| 黄片wwwwww| 亚洲精品日韩av片在线观看| 街头女战士在线观看网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费观看在线日韩| 99精国产麻豆久久婷婷| 天天一区二区日本电影三级| 熟女av电影| 中文资源天堂在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美成人午夜免费资源| 国产美女午夜福利| 熟女人妻精品中文字幕| 大香蕉97超碰在线| 五月天丁香电影| 毛片女人毛片| 大香蕉97超碰在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产成人a区在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久精品国产亚洲网站| 少妇人妻精品综合一区二区| 秋霞在线观看毛片| 韩国av在线不卡| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲国产成人一精品久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲不卡免费看| 亚洲av在线观看美女高潮| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 免费在线观看成人毛片| 一级av片app| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线观看美女被高潮喷水网站| 嫩草影院精品99| 深爱激情五月婷婷| 最近中文字幕高清免费大全6| 69av精品久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 一区二区三区免费毛片| 最后的刺客免费高清国语| 97热精品久久久久久| 国产在视频线精品| 禁无遮挡网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久精品久久久久久久性| 欧美3d第一页| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 内地一区二区视频在线| 直男gayav资源| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产高清三级在线| 国产日韩欧美在线精品| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产毛片在线视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品酒店卫生间| 成人亚洲精品一区在线观看 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 99久久人妻综合| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久精品国产亚洲网站| 婷婷色av中文字幕| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品一区蜜桃| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲三级黄色毛片| 久久久精品免费免费高清| 91狼人影院| 精品酒店卫生间| 人体艺术视频欧美日本| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 午夜福利在线在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av福利一区| 搡老乐熟女国产| 视频中文字幕在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美激情国产日韩精品一区| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧洲日产国产| 少妇丰满av| 亚洲伊人久久精品综合| 色哟哟·www| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲精品国产av成人精品| 人妻少妇偷人精品九色| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品久久久久久精品古装| 中文字幕免费在线视频6| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 男女无遮挡免费网站观看| 少妇的逼水好多| 岛国毛片在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 2022亚洲国产成人精品| 精品久久久久久久久亚洲| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产欧美人成| 色视频在线一区二区三区| 嫩草影院入口| 国产精品一区www在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 午夜视频国产福利| 欧美激情久久久久久爽电影| 永久网站在线| 中文字幕av成人在线电影| 久久精品国产自在天天线| xxx大片免费视频| 天天躁日日操中文字幕| av女优亚洲男人天堂| 中文字幕免费在线视频6| 日韩视频在线欧美| 搞女人的毛片| 22中文网久久字幕| 国产黄频视频在线观看| 99热网站在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丰满乱子伦码专区| 好男人视频免费观看在线| 国产中年淑女户外野战色| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲美女搞黄在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 网址你懂的国产日韩在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 免费观看a级毛片全部| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美性感艳星| 亚洲欧美清纯卡通| 女人被狂操c到高潮| 一级爰片在线观看| 亚洲在久久综合| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 麻豆国产97在线/欧美| 天天躁日日操中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| .国产精品久久| 亚洲自拍偷在线| 日本午夜av视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美区成人在线视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 国产高清国产精品国产三级 | 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 97热精品久久久久久| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产欧美亚洲国产| 日韩av不卡免费在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 天美传媒精品一区二区| 亚洲人与动物交配视频| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久99热这里只有精品18| 亚洲精品久久午夜乱码| 人妻少妇偷人精品九色| 国产综合懂色| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲自拍偷在线| 午夜激情久久久久久久| 一区二区三区免费毛片| 成年av动漫网址| 九草在线视频观看| 欧美日韩在线观看h| 色吧在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩av免费高清视频| 一区二区三区免费毛片| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲第一区二区三区不卡| 少妇人妻久久综合中文| 青青草视频在线视频观看| 国产中年淑女户外野战色| 青春草视频在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 婷婷色综合大香蕉| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久午夜福利片| 如何舔出高潮| 久久亚洲国产成人精品v| 永久免费av网站大全| 97超视频在线观看视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 97精品久久久久久久久久精品| 国产日韩欧美在线精品| 熟女电影av网| 日韩制服骚丝袜av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲丝袜综合中文字幕| av.在线天堂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 97热精品久久久久久| av线在线观看网站| 三级经典国产精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩一区二区三区影片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 我的老师免费观看完整版| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 晚上一个人看的免费电影| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩人妻高清精品专区| 大码成人一级视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美成人午夜免费资源| 九草在线视频观看| av国产免费在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲成人久久爱视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 我的老师免费观看完整版| 一级片'在线观看视频| 亚洲综合精品二区| 新久久久久国产一级毛片| 国产老妇女一区| 色吧在线观看| 免费观看的影片在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成人精品久久久久久| 精品午夜福利在线看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品视频人人做人人爽| 日韩av不卡免费在线播放| 精品久久国产蜜桃| 国产片特级美女逼逼视频| 一级爰片在线观看| 国内精品美女久久久久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久国内精品自在自线图片| tube8黄色片| 亚洲欧美精品自产自拍| 在线观看三级黄色| 简卡轻食公司| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级a做视频免费观看| 麻豆乱淫一区二区| 黄色一级大片看看| 久久99精品国语久久久| 亚洲国产欧美人成| 亚洲精品第二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 成人漫画全彩无遮挡| 一级av片app| 少妇高潮的动态图| 亚洲怡红院男人天堂| 国产免费视频播放在线视频| 国产在线一区二区三区精| 亚洲电影在线观看av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 最后的刺客免费高清国语| 黄色欧美视频在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久99热6这里只有精品| 亚洲,欧美,日韩| av国产免费在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 日日啪夜夜爽| 精品熟女少妇av免费看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文资源天堂在线| 亚洲天堂av无毛| 美女内射精品一级片tv| 97在线人人人人妻| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美精品国产亚洲| 99热6这里只有精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品国产乱码久久久久久小说| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久这里有精品视频免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲最大成人手机在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产色片| 欧美高清成人免费视频www| 中文欧美无线码| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久热精品热| 看十八女毛片水多多多| 亚洲天堂av无毛| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲av国产av综合av卡| 久久影院123| 免费黄网站久久成人精品| 精品熟女少妇av免费看| 欧美另类一区| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品久久久久久久电影| 欧美另类一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线天堂最新版资源| 精品久久国产蜜桃| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧洲日产国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲av免费在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲经典国产精华液单| 少妇的逼好多水| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美区成人在线视频| 一级a做视频免费观看| 一级av片app| 99视频精品全部免费 在线| 一级a做视频免费观看| 极品教师在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 我要看日韩黄色一级片| 国产在线一区二区三区精| 男的添女的下面高潮视频| 天美传媒精品一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 2022亚洲国产成人精品| 男男h啪啪无遮挡| 成人一区二区视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 老司机影院成人| 内射极品少妇av片p| 激情五月婷婷亚洲| 日本三级黄在线观看| 男人舔奶头视频| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 3wmmmm亚洲av在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲人成网站高清观看| 国产爱豆传媒在线观看| 免费观看性生交大片5| 观看免费一级毛片| av在线观看视频网站免费| 亚洲国产最新在线播放| 另类亚洲欧美激情| 99久久精品热视频| 免费黄色在线免费观看| av天堂中文字幕网| 久久影院123| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产极品天堂在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 少妇的逼水好多| 草草在线视频免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲av二区三区四区| 综合色av麻豆| 新久久久久国产一级毛片| 一区二区三区精品91| 毛片女人毛片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国内精品美女久久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久午夜欧美精品| 一级毛片我不卡| 搞女人的毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲精品国产av蜜桃| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91狼人影院| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲av欧美aⅴ国产| av卡一久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 最近最新中文字幕免费大全7| 成人二区视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 色播亚洲综合网| 99久国产av精品国产电影| 成年女人在线观看亚洲视频 | 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品一区二区在线观看99| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产乱人偷精品视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产黄片美女视频| 一级二级三级毛片免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 少妇丰满av| 国产乱来视频区| 国产免费一级a男人的天堂| 久久韩国三级中文字幕| 赤兔流量卡办理| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 99久久人妻综合| 少妇人妻一区二区三区视频| 丝袜脚勾引网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区国产| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av在线亚洲专区| 一边亲一边摸免费视频| 国产高清三级在线| 国产一区二区在线观看日韩| 天堂俺去俺来也www色官网| 交换朋友夫妻互换小说| 一区二区三区免费毛片| 麻豆成人av视频| 日韩强制内射视频| 欧美97在线视频| 欧美精品国产亚洲| 亚洲久久久久久中文字幕| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品日本国产第一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美激情在线99| 高清视频免费观看一区二区| 久久ye,这里只有精品| 日韩电影二区| 亚洲av免费在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 少妇丰满av| 成人二区视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产 精品1| 国内精品美女久久久久久| 一级毛片我不卡| 欧美最新免费一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 国产毛片在线视频| 久久影院123| 亚洲国产精品999| 搡老乐熟女国产| 久久久欧美国产精品| 有码 亚洲区| 国产探花在线观看一区二区| 各种免费的搞黄视频| 在线观看人妻少妇| www.色视频.com| 欧美成人午夜免费资源| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美成人精品欧美一级黄| 91aial.com中文字幕在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜日本视频在线| 国产精品一区www在线观看| 身体一侧抽搐| 日本欧美国产在线视频| 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品一二三区在线看| 日日啪夜夜撸| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩av在线免费看完整版不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 22中文网久久字幕| 国产 精品1| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲成人久久爱视频| 国产爱豆传媒在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 超碰av人人做人人爽久久| 尾随美女入室| 免费大片18禁| 国产精品99久久久久久久久| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产精品国产av在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产午夜精品一二区理论片| 97在线视频观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| av一本久久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美一区二区亚洲| 亚洲在久久综合| 国产高清有码在线观看视频| 精品酒店卫生间| 大片免费播放器 马上看| 成人亚洲欧美一区二区av| 最后的刺客免费高清国语| av.在线天堂| 五月天丁香电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 91狼人影院| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费大片黄手机在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 最近中文字幕2019免费版| 99久久精品国产国产毛片| 在线看a的网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品偷伦视频观看了|