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    與眾不同的核酸酶Cas13a:編輯RNA的新CRISPR平臺及其進展

    2018-03-06 18:22劉貴生MekxnaySupamit吳俊靜
    湖北農(nóng)業(yè)科學 2018年2期

    劉貴生+MekxnaySupamit+吳俊靜

    摘要:CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,規(guī)律成簇的間隔短回文重復)平臺是出色的基因組編輯工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可編輯DNA,也可編輯RNA,這一新平臺可實現(xiàn)DNA或RNA的摩爾靈敏度以及單堿基錯配的特異性檢測,同時拓展用于病毒與細菌的精細檢測(甚至是寨卡與登革熱的近親病毒株)、癌癥早期監(jiān)測和遺傳性疾病等治療;其需要設計少,技術操作簡單,具有廣泛的應用潛力,是基因組編輯的又一項卓越成果。綜述了Cas13a系統(tǒng)的最新進展。

    關鍵詞:基因組編輯;CRISPR;Cas13a;RNA;基因網(wǎng)絡調(diào)控

    中圖分類號:S188 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2018)02-0005-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.001

    Abstract: The CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) platform is an excellent genome editing platform, in which, the novel nuclease Cas13a (CRISPR-associated protein 13a) can edit DNA and RNA. This new platform could fulfill DNA or RNA detection with molar sensitivity and single-base mismatch specificity, and meanwhile be extended to fine detect of viruses(even Close relatives of Zika and Dengue strains) and bacteria, monitor early cancer, with the simple technical manipulation and a wide range of application potentials, which could be another excellent tool of genomic editing. Here the current progress about Cas13a system was overviewed.

    Key words: Genomic Editing; CRISPR; CRISPR-associated protein 13a; RNA; gene network regulation

    CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,規(guī)律成簇的間隔短回文重復)平臺是出色的基因組編輯工具,其層出不窮的科研進展及其應用更新給生物學界帶來巨大革命。其中,比較熟知的是編輯DNA的Cas9(CRISPR-associated protein 9),而現(xiàn)在另一種新型核酸酶Cas13a正逐漸走進人們的視野?;蚪M編輯技術新平臺Cas13a主要由該領域的兩個先驅團隊開發(fā),分別是哈佛大學張鋒教授[1,2]和加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna教授[3]。2015年發(fā)現(xiàn)時稱為C2c2,現(xiàn)在稱為Cas13a,由于文獻原因,本文同時使用這2個名稱。

    幾乎所有的古菌和約50%的現(xiàn)代細菌都具有CRISPR-Cas[(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein],是細菌抵抗病毒和質(zhì)粒侵染的獲得性免疫防御系統(tǒng),且是人類開發(fā)基因工程革新性工具的基礎[4,5]。CRISPR-Cas系統(tǒng)劃分為兩大類,第一大類是由多亞基組成的效應復合物才能發(fā)揮功能;第二大類是由單個效應蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)發(fā)揮功能。其中Cas9和Cpf1是廣為人知的DNA編輯工具,而最近挖掘出蛋白C2c2則是又一驚喜成果,具有RNA編輯功能。《Nature Methods》2017年第一期評出了2016年度革新技術,其中之一即是C2c2靶向RNA的基因組編輯技術[6]。

    1 結構

    最近兩篇文獻揭示了C2c2加工pre-crRNA和切割靶標 RNA的分子結構,對認識細菌抵抗RNA病毒入侵的分子基礎具有十分重要的意義,有助于加速對病毒感染引發(fā)的疾病的理解、治療和預防。同時也為改造CRISPR-C2c2系統(tǒng),為其在基因編輯領域的運用提供了強有力的結構生物學基礎。

    中科院生物物理研究所王艷麗課題組通過結構和生化解析了Leptotrichia shahii(Lsh)細菌中C2c2與crRNA(CRISPR-RNA)的二元復合物3.2?魡的電鏡結構、C2c2與crRNA(CRISPR-RNA)及其target RNA三元復合物3.08?魡的晶體結構,以及C2c2在自由狀態(tài)下的晶體結構,揭示了LshC2c2通過兩個獨立的活性結構域來發(fā)揮其兩種不同的RNA酶切活性(圖1)[7]。crRNA的結合會引起C2c2蛋白的構象變化,這種變化很可能使其更穩(wěn)定地與crRNA的結合,進而對識別靶標RNA起著重要作用。Knott等[8]報道了毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)crRNA結合Cas13a(LbaCas13a)的2.0?魡晶體結構。研究人員通過結構分析和生化試驗,定義了直接負責crRNA突變的Cas13a催化殘基,而且這種蛋白上外源靶向RNA特異性序列的發(fā)現(xiàn)也解釋了Cas13a核酸酶活化的構象門控(圖2)。endprint

    2 Cas13a與Cas9功能機制特點比較

    與Cas9一樣,Cas13a也能容忍crRNA與目標序列之間的單個錯配,不過若存在2個錯配,切割效率就大大降低。它的PFS序列(相當于PAM序列)位于間隔區(qū)的3端,由A、U或C堿基組成(圖3)。

    綜合Cas13a特點見表1,二者的區(qū)別在于Cas13a切割對象是RNA,而Cas9靶向切割DNA;Cas13a是一種雙組件系統(tǒng),只需要一條crRNA介導,而Cas9需要crRNA和tracrRNA;Cas13a對crRNA的加工并非必須,尤其是Cas13a靶標單鏈RNA時[9];從結構上來看,Cas13a含有兩個HEPN結構域,而Cas9用HNH和RuvC結構域來切割DNA目標。HEPN結構域對Cas13a切割RNA目標是必需的;Cas13a遺傳上可編碼,這意味著可將必要元件合成為DNA傳遞到組織和細胞中。Cas13a還有一個特別之處,那就是Cas13a一旦識別并切割由crRNA序列指定的靶標RNA,它就轉入了一種酶促“激活”狀態(tài),這時它將結合并切割其他的非靶標RNA,而不管它們是否與crRNA同源,或是否存在PFS,與Cas9截然不同。Cas13a蛋白實質(zhì)上是細菌自我武裝的哨兵,在檢測到其靶標后攻擊所有RNA。對于細菌而言,這種特性是有意義的。若細菌被噬菌體感染,它能夠激活程序性細胞死亡或休眠狀態(tài),以限制感染在整個群體中的傳播。作者將這稱為附屬活性,這種特性可被用作一個自動放大檢測器,開發(fā)成為一種低成本的診斷法[10]。

    3 應用

    3.1 用于檢測濃度極低的單RNA分子和單DNA分子

    利用附屬活性,Gootenberg等[10]在這套系統(tǒng)里塞入了一種帶有RNA的熒光標志物,平時它不會發(fā)出熒光,一旦Cas13a到處剪切,被熒光標記的RNA就會被切開,讓它發(fā)出明亮的光芒。也就是說,只要設計好合適的向導RNA,并提供Cas13a與熒光標志物,那么一旦這套系統(tǒng)識別到匹配的RNA序列,就會發(fā)出熒光,告訴研究人員找到靶標了。這套系統(tǒng)的靈敏度達到了50 fM(1 fM=10-15 mol/L)。盡管這樣,研究人員依然沒有滿足,想要把靈敏度進一步提高到阿摩爾級(aM,10-18 mol/L)。為了達到這一目標,引入James Collins教授的技術“等溫擴增”,進一步降低了對初始核酸濃度的需求,增加放大步驟有助于檢測靈敏度提高到百萬分之一。將這兩種技術結合起來的新系統(tǒng)能夠檢測極低濃度的單RNA分子和單DNA分子,并能進一步引入冷凍干燥等應用程序,從而真正構建出一種強大的工具。利用這一技術,可在短短1 h內(nèi)對樣品進行檢測,還可將其凍存并重構,成本也很低。

    3.2 用于區(qū)分細微差異的病原

    多個結果都佐證了Cas13a工具能夠識別人血清、尿液和唾液中的寨卡病毒RNA,并且還可將寨卡病毒與登革熱這兩種關系相近的病毒區(qū)分開,甚至能分辨具有不同耐藥突變的肺炎菌株,這些對于準確診斷病情、有效預防疫情暴發(fā)而言,有著現(xiàn)實的應用價值[10]。

    3.3 用于癌癥早期監(jiān)測

    在癌癥的早期診斷領域,科學家們希望從血液中分離出專屬于癌細胞的突變,從而得知癌癥是否開始發(fā)作。然而,由于血液中有著大量的非癌細胞DNA,這一檢測過程困難無比。Gootenberg等[10]試驗表明,該平臺同樣能以阿摩爾級的靈敏度,識別出腫瘤特有的突變。研究人員應用這套系統(tǒng),成功地鑒定出了人類基因組中的多個單核苷酸多態(tài)性(SNP),并能分析出每一個人的特定SNP是純合還是雜合。這項工具能在患者的血液中尋找到極少量的腫瘤DNA,幫助研究人員理解腫瘤的突變?nèi)绾坞S著時間推移發(fā)生改變。由于達到如此非同尋常的靈敏度,研究人員想到了福爾摩斯(Sherlock Holmes),于是把這套系統(tǒng)稱為SHERLOCK(Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)。

    3.4 用于治療遺傳性疾病

    雖然人體很多疾病是來自于DNA,但是由于基因承載著生命最根源的信息,直接對DNA進行編輯會出現(xiàn)安全和倫理上的問題。而RNA編輯卻不同,通過編輯RNA能暫時性地糾正DNA翻譯的信息,讓蛋白質(zhì)接收到正確的信息,達到治療的效果,這可能是更加有效的一種臨床應用方式,尤其對于需要基因表達短期變化的疾病來說,無需修改基因組就能修復突變,而且RNA會自動降解,因此RNA編輯可能更有效[11]。

    3.5 潛在應用

    與Cas9類似,Cas13a分子中關鍵殘基的突變可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a(dCas13a),它能夠結合RNA目標但無法切割。人們可利用dCas13a來分離群體中的特定RNA序列,或利用熒光標記的dCas13a來研究活細胞中的RNA加工。Cas13a有望繼續(xù)擴大CRISPR的應用范圍有:添加一些模塊到特定RNA序列中改變它們的功能(翻譯成蛋白質(zhì)的方式),這將使得它們成為用于大規(guī)模篩查及構建合成調(diào)控網(wǎng)絡的有價值工具;利用C2c2熒光標記RNAs來研究RNA的運輸和亞細胞定位。

    此外,Cas13a并不是惟一的一種RNA靶向CRISPR系統(tǒng),張鋒研究組還發(fā)現(xiàn)了Cas13b[11]。像Cas13a一樣,Cas13b僅需要單個向導RNA就能找到靶標,并且從遺傳學的角度是可編碼的。此外,Cas13b能夠同時靶向多個RNA轉錄本。這些特性使得Cas13b更適用于微調(diào)基因功能研究[12]。

    4 Cas13a 與RNAi比較

    在CRISPR出現(xiàn)之前,RNAi是調(diào)節(jié)基因表達的理想方法。但Cas13a一大優(yōu)勢就在于其具有更強的特異性,而且這種本身來自細菌的系統(tǒng)對哺乳動物細胞來說并不是內(nèi)源性的,因此不太可能干擾細胞中天然的轉錄。相反,RNAi利用內(nèi)源性機制進行基因敲除,對本身的影響較大。Abudayyeh等[13]分離得到了Cas13a酶,構建出了一種雙質(zhì)粒RNA靶向CRISPR系統(tǒng),這一系統(tǒng)能在不同的質(zhì)粒上表達導向RNA(gRNA)和Cas13a基因,其中Cas13a基因含有一種經(jīng)過改造的核定位序列,證實了切割RNA的Cas13a酶能夠特異性地降低哺乳動物細胞中的內(nèi)源性RNA和報告RNA水平。并指出這種方法比RNA干擾(RNAi)的效率更高,能被用于抑制細胞RNA靶標,結合和富集感興趣的RNA,以及通過序列特異結合對細胞內(nèi)的RNA進行成像。endprint

    5 結論

    與編輯DNA的Cas9相比較,Cas13a既可編輯DNA,也可編輯RNA,這一平臺實現(xiàn)了單分子檢測靈敏度和單堿基對特異性檢測,同時拓展于病毒與細菌的精細檢測、癌癥早期監(jiān)測和遺傳性疾病治療等,且技術操作簡單,具有可靠應用潛力,是基因組編輯的又一項卓越成果。之后還需要進行大規(guī)模臨床研究,并對現(xiàn)有檢測方法進行基準測試。

    參考文獻:

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