聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析1只死亡野生川金絲猴胃腸道菌群多樣性

曾 燕 牛李麗 鄧家波 王 強 余建秋 李 楊 周夢佳 徐 帥 林奕岑 曾 東** 倪學(xué)勤**

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，成都 611130；2.成都動物園，成都 610081；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066)

川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)別名仰鼻猴，屬哺乳綱、靈長目、仰鼻猴屬[1]，是我國特有的國家一級保護動物，主要分布于四川、甘肅、陜西和湖北等地[2]，其外形優(yōu)美且種群稀少，是典型的森林樹棲動物，群棲于高山密林中，其食性復(fù)雜，但均以植物性食物為主[3]。隨著人類活動的增多，川金絲猴的棲息地受到嚴重破壞，加上環(huán)境因素以及少量天敵的影響，其數(shù)量不斷減少。而四川南坪白河、陜西周至和湖北神農(nóng)3個國家級金絲猴自然保護區(qū)的建立[4]及人工飼養(yǎng)繁育使川金絲猴的繁殖和種群逐漸得以恢復(fù)。并且，胃腸道微生物的研究和利用也是目前野生動物繁殖及種群保護的重要措施[5]。腸道微生物組成及功能與宿主的消化、免疫應(yīng)答和生理功能密切相關(guān)[6-7]。近年來，已有研究初步報道了川金絲猴部分腸段及糞便菌群結(jié)構(gòu)及組成等信息[3,8-9]，但其整個胃腸道菌群的信息仍處于未知狀態(tài)。因此，研究整個胃腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成對川金絲猴的飼養(yǎng)繁殖及種群保護具有重要的指導(dǎo)意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是近年來在菌群多樣性方面應(yīng)用最為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)，它為菌群結(jié)構(gòu)及組成的研究提供了強有力的保障[10]。因此，本試驗擬運用PCR-DGGE技術(shù)研究1只死亡野生川金絲猴胃腸道(胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸和糞便)菌群的多樣性，并對主要條帶進行克隆測序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以期豐富川金絲猴胃腸道菌群信息，為其飼養(yǎng)、健康生長及種群保護提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年3月，四川省綿陽市平武縣救護站在野外發(fā)現(xiàn)1只消瘦、瀕臨死亡的野生老齡雌性川金絲猴(18歲)，并送至成都動物園救治，對其補充營養(yǎng)及補液(5%葡萄糖、生理鹽水和碳酸氫鈉)，期間其未進食任何食物，收集其糞便樣品，救治無效死亡，解剖后臟器病理觀察僅見心臟有陳舊性梗死灶并伴有心肌纖維化和鈣化，判斷可能死于心臟病。同時收集胃腸道內(nèi)容物樣品(胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸)至滅菌2 mL離心管中，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA提取

1.3 細菌總DNA的16S rDNA V3區(qū)PCR擴增

以樣品細菌總DNA為模板，使用大腸桿菌通用擴增細菌16S rDNA V3區(qū)序列[10]。上游引物為5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(帶下劃線部分為“GC”夾子)；下游引物為5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。PCR擴增體系(50 μL)：模板DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，補雙蒸水(ddH2O)至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4 PCR產(chǎn)物的PCR-DGGE指紋圖譜分析及條帶克隆測序

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013對DGGE指紋圖譜的多樣性進行統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0軟件進行主成分分析(PCA)，用NTSYS 2.1軟件進行聚類分析，用MEGA軟件對克隆測序結(jié)果進行系統(tǒng)進化樹分析。其中，多樣性指標(biāo)的計算公式如下：

H=-Σ(pi)(lnpi)；E=H/Hmax；R=s。

式中：H為香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)，用于表示多樣性指數(shù)(diversity index)；pi為物種i的相對豐度比例；E為均勻度(evenness)；R為豐富度(richness)；s為樣品在DGGE的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生川金絲猴胃腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜的聚類分析

野生川金絲猴胃腸道樣品16S rDNA PCR產(chǎn)物的DGGE檢測結(jié)果如圖1所示。DGGE圖譜的非加權(quán)分組平均(UPGMA)法分析顯示，來自胃、十二指腸和空腸的樣品聚為一大簇，其相似性系數(shù)為0.97；來自回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸的樣品同樣聚為一簇，其相似性系數(shù)為0.60；而來自糞便的樣品則單獨聚為一簇，與其他胃腸道樣品的相似性系數(shù)僅為0.45。DGGE圖譜條帶結(jié)果顯示，野生川金絲猴胃腸道棲息著大量細菌，且棲息在各部位的細菌種類和數(shù)量存在一定差異。所有胃腸道樣品共分離出52個條帶。其中，糞便樣品中的細菌種類最豐富，條帶數(shù)為32；其次是胃和小腸(十二指腸和空腸)樣品，條帶數(shù)分別為27、27和28；而大腸(回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸)樣品中的細菌種類相對較少，條帶數(shù)分別為13、13、16和15。這些部位菌群組成差異的產(chǎn)生可能與宿主健康狀態(tài)或其胃腸道各部位的消化功能及細菌定植差異相關(guān)。

Sto、Duo、Jej、Ile、Cec、Col、Rec和Fae分別為野生川金絲猴的胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸和糞便樣品，帶箭頭的數(shù)字(1～18)為條帶編號。下圖同。

Sto, Duo, Jej, Ile, Cec, Col, Rec and Fae mean bacteria from stomach, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, rectum, and faeces of wildRhinopithecusroxellanae, respectively. Numbers (1 to 18)with arrow are the bands No. The same as below.

圖1胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜及聚類分析

Fig.1 PCR-DGGE profiles and cluster analysis of

bacteria in gastrointestinal tract

2.2 野生川金絲猴胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜的多樣性分析

野生川金絲猴胃腸道菌群的多樣性分析結(jié)果如圖2所示。由圖可知，胃腸道各樣品菌群的多樣性存在差異。糞便菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度最高，分別為3.47、0.88和32.00；胃、十二指腸和空腸菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度較高，分別為3.30、0.83、27.00和3.30、0.83、27.00及3.33、0.84、28.00；而大腸菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度較低，其中，回腸菌群的多樣性指標(biāo)最低，分別為2.56、0.65和13.00。隨著胃腸道部位按照由前往后順序推移，菌群多樣性呈現(xiàn)出高—低—高的趨勢，這與前面DGGE圖譜聚類分析結(jié)果一致。

圖2 胃腸道菌群的多樣性指數(shù)、均勻度及豐富度

2.3 胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜的主成分分析

對野生川金絲猴胃腸道DGGE圖譜進行主成分分析后發(fā)現(xiàn)，菌群結(jié)構(gòu)及組成不同的樣品在主成分分析中的分布與DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果一致，見圖3。結(jié)果表明，主成分因子1和2的貢獻率分別為42.90%和29.79%，共同將野生川金絲猴的胃腸道菌群區(qū)分為3個聚類。其中，胃、十二指腸和空腸的菌群聚類在一起，回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸的菌群聚類在一起，而糞便菌群單獨分離開來。這表明野生川金絲猴胃腸道相鄰腸段的菌群結(jié)構(gòu)及組成相似性高，而作為腸段末端的糞便樣品與其他樣品間存在一定差異。

圖3 胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜的主成分分析

2.4 胃腸道菌群PCR-DGGE圖譜主要條帶的序列檢測

在野生川金絲猴胃腸道菌群的PCR-DGGE圖譜上共回收了18個條帶(圖1箭頭所指1～18)，測序結(jié)果在NCBI上進行親緣關(guān)系比對，結(jié)果如表1所示。經(jīng)鑒定，野生川金絲猴胃腸道細菌主要來自5個菌門，分別是變形菌門(Proteobacteria，38.89%)、厚壁菌門(Firmicutes，22.22%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，5.56%)、放線菌門(Actinobacteria，5.56%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，5.56%)和不可培養(yǎng)菌(uncultured bacterium，22.22%)。其中，變形菌門和厚壁菌門分布于整個胃腸道，擬桿菌門和疣微菌門主要分布于胃、小腸和糞便，放線菌門則主要分布在胃和小腸。野生川金絲猴胃腸道中的變形菌門主要來自假單胞菌屬(Pseudomonas)的4個菌種[Pseudomonasproteolytica、Pseudomonascerasi、無花果假單胞菌(Pseudomonasficuserectae)和韋龍氏假單胞菌(Pseudomonasveronii)]、埃希菌屬(Escherichia)的2個菌種[費格森埃希菌(Escherichiafergusonii)和大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)]和志賀菌屬(Shigella)的宋內(nèi)志賀菌(Shigellasonnei)；厚壁菌門主要是來自梭菌屬(Clostridium)的煎盤梭菌(Clostridiumsartagoforme)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的扭鏈瘤胃球菌(Ruminococcustorques)、梭桿菌屬(Fusobacterium)的普氏梭桿菌(Flavonifractorplautii)和腸球菌屬(Enterococcus)的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。并且，與維持消化道黏膜屏障功能和防止肥胖相關(guān)代謝的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)在胃、小腸、回腸和糞便中均有檢測到。更重要的是，條帶測序結(jié)果分析表明，在野生川金絲猴整個胃腸道中均檢測到不可培養(yǎng)菌，說明其胃腸道中存在大量未被檢測和鑒定的細菌種類。野生川金絲猴胃腸道菌群的系統(tǒng)進化樹(圖4)表明，在4個不可培養(yǎng)菌中，僅條帶4與已鑒定的糞腸球菌進化分類相似，說明條帶4所代表的細菌可能是來自厚壁菌門的1株腸球菌；而其他不可培養(yǎng)菌與已知的菌種進化分支差異較大，這些菌種還需要進行深入的鑒定分析，同樣說明在野生川金絲猴的胃腸道中有大量的菌群信息未被鑒定。

表1 DGGE圖譜條帶克隆測序和BLAST分析結(jié)果

續(xù)表1條帶編號BandNo．GenBank數(shù)據(jù)庫中最相近的菌種ClosestrelativesfoundintheGenBankdatabase登錄號AccessionNo．相似性Similarity/%腸道部位Location菌門Phylum7PseudomonascerasiNR＿146827．199胃、十二指腸、空腸Stomach，duodenumandjejunum變形菌門Proteobacteria8煎盤梭菌ClostridiumsartagoformeNR＿026490．199大腸Largeintestine厚壁菌門Firmicutes9扭鏈瘤胃球菌RuminococcustorquesNR＿036777．199糞便Faeces厚壁菌門Firmicutes10無花果假單胞菌PseudomonasficuserectaeNR＿040798．1100胃、十二指腸、空腸、糞便Stomach，duodenum，jejunumandfaeces變形菌門Proteobacteria11嗜黏蛋白阿克曼氏菌AkkermansiamuciniphilaNR＿074436．199胃、小腸、糞便Stomach，smallintestineandFaeces疣微菌門Verrucomicrobia12普氏梭桿菌FlavonifractorplautiiNR＿043142．198胃、小腸、糞便Stomach，smallintestineandFaeces厚壁菌門Firmicutes13韋龍氏假單胞菌PseudomonasveroniiNR＿028706．1100糞便Faeces變形菌門Proteobacteria14不可培養(yǎng)菌UnculturedbacteriumFJ036720．1100胃、小腸Stomachandsmallintestine15費格森埃希菌EscherichiafergusoniiNR＿114079．1100胃腸道Gastrointestinaltract變形菌門Proteobacteria16宋內(nèi)志賀菌ShigellasonneiNR＿104826．199胃、小腸Stomachandsmallintestine變形菌門Proteobacteria17大腸埃希桿菌EscherichiacoliNR＿112558．199胃、十二指腸、空腸、糞便Stomach，duodenum，jejunumandfaeces變形菌門Proteobacteria18糞腸球菌EnterococcusfaecalisNR＿040789．199胃、十二指腸、空腸、大腸、糞便Stomach，duodenum，jejunum，largeintestineandfaeces厚壁菌門Firmicutes

3 討 論

野生動物是地球生物圈中寶貴的生物資源，近40年全球野生動物數(shù)量減少了1/2[11]，其種群數(shù)量的下降不僅會加速物種的滅絕，并且會導(dǎo)致人畜共患疾病發(fā)生趨勢的上升[12]。研究表明，微生物的穩(wěn)態(tài)平衡及多樣性促進宿主健康生長[13]。健康狀態(tài)、環(huán)境、宿主基因型、飲食和性別不僅影響動物機體的生理功能，而且影響動物胃腸道菌群的結(jié)構(gòu)及組成。盡管野生動物因保護特性而難以獲得其胃腸道樣品，但隨著人們對野生動物種群保護的重視，死亡野生動物胃腸道菌群信息已被陸續(xù)報道[3,8]，這為其生存和保護提供了重要的基礎(chǔ)資料。同樣，本研究運用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)首次分析了1只死亡野生川金絲猴胃、小腸、大腸和糞便菌群的多樣性，并對圖譜中主要條帶進行克隆測序及系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其胃腸道中棲息著大量菌群，不同腸段的菌群多樣性有差異，且DGGE條帶克隆測序鑒定出的菌群主要來自變形菌門，這些結(jié)果豐富了野生川金絲猴胃腸道菌群信息。

圖4 野生川金絲猴胃腸道菌群系統(tǒng)進化樹

本研究中，PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)在分子水平上快速和直觀地反映了野生川金絲猴胃腸道菌群的結(jié)構(gòu)特點及多樣性。圖1表明野生川金絲猴胃腸道中棲息著大量的菌群，且克隆測序鑒定出的菌群主要來自變形菌門(38.89%)、厚壁菌門(22.22%)、擬桿菌門(5.56%)、放線菌門(5.56%)和疣微菌門(5.56%)。其中，變形菌門和厚壁菌門分布于整個胃腸道，但變形菌門是優(yōu)勢菌群。而在劉燕等[8]的研究中，其采用16S rRNA的Illumina MiSeq測序技術(shù)檢測了1只湖北神農(nóng)架死于肺炎的半野生川金絲猴(雄性，20歲)部分腸段(十二指腸段、小腸段、盲腸段及大腸段)樣品，其菌群種類與本研究相同，但其豐度與本研究差異較大，其主要菌群來自厚壁菌門。同樣，有研究者對北京動物園1只死亡健康雌性川金絲猴胃內(nèi)容物的宏基因測序分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群來自厚壁菌門[3]。產(chǎn)生這樣的差異可能是因為研究的動物健康狀態(tài)、環(huán)境、動物個體、性別、飲食及研究的方法均不同而導(dǎo)致。本研究是運用PCR-DGGE技術(shù)分析1只雌性可能死于心臟病的四川平武野生川金絲猴胃腸道菌群多樣性。研究表明，變形菌門豐度的變化與動物健康狀態(tài)密切相關(guān)，是導(dǎo)致動物個體間菌群結(jié)構(gòu)及組成差異的主要菌群[14]。且已有研究表明心臟衰竭的人糞便中來自變形菌門的埃希菌屬的數(shù)量顯著增加[15]。同樣，McKnney等[16]研究表明，健康恒河猴糞便菌群主要來自厚壁菌門，而患結(jié)腸炎恒河猴糞便中的優(yōu)勢菌群是彎曲菌屬(來自變形菌門)。王劍等[17]的研究同樣表明，健康川金絲猴糞便中有更多的雙歧桿菌(Bifidobacteriumspp.)和乳酸菌(Lactobacillusspp.)等有益菌群，而腹瀉川金絲猴的糞便中則出現(xiàn)較多的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和梭菌類群Ⅰ(Clostridium Ⅰ)等病原菌。Aivelo等[18]研究了來自71只赤色倭蜂猴的160份樣品，結(jié)果提示性別影響動物腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成。盡管本研究中的野生川金絲猴與Zhou等[3]研究的川金絲猴性別均為雌性，但菌群信息仍然有差異，可能與研究的動物個體、胃腸道部位及研究方法均不同有關(guān)。與Zhou等[3]研究中使用的能一次并行對成千上萬條DNA分子進行序列測定的高通量測序技術(shù)相比[19]，本研究中的PCR-DGGE技術(shù)主要用于簡單、快速和直觀地體現(xiàn)菌群的豐度及多樣性[10]。Zhou等[3]研究的是1只北京動物園圈養(yǎng)的川金絲猴，本試驗研究的是1只野生川金絲猴，因此動物的生活環(huán)境和飲食均不同，而且有研究表明，圈養(yǎng)后的動物腸道菌群丟失嚴重[20]。盡管如此，本研究與劉燕等[8]和Zhou等[3]的研究用不同的微生物研究方法檢測腸道菌群共同豐富了川金絲猴胃腸道菌群的信息。與本研究不同的是，在Yildirim等[21]的研究中，厚壁菌門是黑白疣猴、紅疣猴和紅尾猴糞便的主要菌群。同樣，厚壁菌門也是獼猴[22]和葉猴[23]糞便菌群的優(yōu)勢菌群，這些結(jié)果與本研究結(jié)果不同，可能是因為動物品種和動物健康狀態(tài)不同而引起的。

野生川金絲猴胃腸道DGGE圖譜條帶的聚類分析(圖1)和主成分分析(圖3)結(jié)果表明，來自胃、小腸的樣品聚為一簇，來自大腸的樣品聚為一簇，而來自糞便的樣品單獨聚為一簇。動物胃腸道各部位除了共有的特征菌群，也存在因其不同的微環(huán)境及與生理功能相適應(yīng)的特異性菌群[24]，因此糞便菌群的研究結(jié)果不能完全反映動物胃腸道中菌群結(jié)構(gòu)及組成。胃是動物初次處理和消化食物的部位，也是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官。盡管川金絲猴的胃因囊腔膨大且胃壁菲薄而不利于食物的機械磨碎，但其分泌胃酸的幽門部處于低位而使得胃酸不會影響處于高位的胃體和胃底的共棲微生物，而最終有利于對纖維素的分解和利用[25]。川金絲猴是植食性靈長類動物，在其進化過程中有69.7%快速進化嗅覺基因可能與水果和植物等氣味相關(guān)，且其胃中的厚壁菌門與碳水化合物代謝密切相關(guān)[3]。同樣，在本研究中，厚壁菌門也是胃中的主要菌群，表明川金絲猴胃中菌群代謝與碳水化合物代謝有關(guān)。動物的小腸主要負責(zé)單糖代謝和氨基酸代謝，有利于變形菌門和乳桿菌目(Lactobacillales)細菌的生長[26]。而大腸主要代謝復(fù)雜多糖，主要菌群來自擬桿菌門和梭菌目(Clostridiales)[27]。川金絲猴的小腸長達255 cm，大腸長度約為182 cm。同樣，本研究中DGGE圖譜主要條帶克隆測序結(jié)果表明，野生川金絲猴小腸菌群主要來自假單胞菌屬的Pseudomonasproteolytica、Pseudomonascerasi和無花果假單胞菌，埃希氏桿菌屬的費格森埃希菌和大腸埃希菌，以及志賀菌屬的宋內(nèi)志賀菌，而這些菌屬被報道是動物腸道或糞便中常見病原菌[28-29]；而大腸中的主要菌群煎盤梭菌和糞腸球菌是動物消化道常見菌，盡管大多數(shù)糞腸球菌是有益菌，但含有基因Cassette(毒力島的一部分)的糞腸球菌是致病性菌種，危害動物健康[30]。野生川金絲猴胃腸道中有病原菌的檢出可能與動物的健康狀態(tài)相關(guān)，本試驗中的樣品來自1只死于心臟病的野生老年川金絲猴，王劍等[17]和簡平等[31]的研究均表明年齡和健康狀態(tài)影響動物腸道菌群結(jié)構(gòu)。

野生川金絲猴腸道菌群PCR-DGGE條帶克隆測序結(jié)果顯示其胃腸道中存在大量不可培養(yǎng)菌(表1)，且主要來自胃和小腸，說明其胃腸道中有大量菌群信息未被挖掘，這可能與川金絲猴動物本身的珍稀特性而使得對其胃腸道菌群的研究大多集中在易于采集的糞便樣品有關(guān)。目前更新的菌群系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，有大量不可培養(yǎng)菌與厚壁菌門聚類在一起[32]。同樣，在本研究中，野生川金絲猴胃腸道DGGE條帶的系統(tǒng)進化樹也表明(圖4)不可培養(yǎng)菌大多來自厚壁菌門，主要是扭鏈瘤胃球菌、煎盤梭菌和糞腸球菌。趙晗旭等[33]研究表明，厚壁菌門是6種野生動物的腸道優(yōu)勢菌群，瘤胃球菌屬是單胃草食動物(袋鼠和大象)和反芻動物(長頸鹿和羊駝)腸道的差異菌群，該菌屬在前者數(shù)量高于后者。同樣，本研究結(jié)果顯示厚壁菌門分布于野生川金絲猴整個胃腸道。因此，對厚壁菌門，特別是對瘤胃球菌屬和糞腸球菌的研究可作為今后川金絲猴胃腸道菌群研究的重點關(guān)注方向。本試驗運用PCR-DGGE技術(shù)首次分析了1只死于心臟病的老齡野生川金絲猴胃腸道菌群的多樣性，其胃腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成代表了老齡死亡野生川金絲猴胃腸道的菌群特點，極大豐富了野生川金絲猴胃腸道菌群的信息。今后可借助宏基因組學(xué)技術(shù)對其菌群組成和功能進行深入分析，為野生川金絲猴的健康生長及種群保護提供指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

本試驗運用PCR-DGGE技術(shù)分析了1只老齡死亡野生川金絲猴胃腸道菌群多樣性，獲得了與其健康狀態(tài)、性別、年齡和研究方法相適應(yīng)的菌群特點，其菌群多樣性隨著胃腸道由前至后的順序呈現(xiàn)高—低—高的趨勢，且胃腸道菌群以變形菌門(38.89%)和厚壁菌門(22.22%)為主，但胃腸道中仍有大量不可培養(yǎng)菌(22.22%)有待深入研究。

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