苜蓿素對脂多糖刺激下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性和炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

占今舜 谷德平 胡利珍 鐘小軍 霍俊宏

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分，當(dāng)細(xì)菌感染乳腺組織時(shí)，釋放出來LPS能夠?qū)е氯橄俳M織損傷，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥[1-2]。據(jù)報(bào)道，LPS能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等炎癥因子的表達(dá)，降低抗氧化酶類活性，升高丙二醛(MDA)濃度和細(xì)胞膜的滲透性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3-4]。苜蓿素(Tricin)又稱4′，5，7-三羥基-3′，5′-二甲氧基黃酮，是在感染銹病的小麥葉子中首次發(fā)現(xiàn)的一種黃酮類化合物，隨后在苜蓿草、水稻、高粱和大麥等植物中亦發(fā)現(xiàn)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠抑制細(xì)菌、真菌和流感病毒的增殖，發(fā)揮抗菌和抗病毒作用[6-7]；具有輕微的類雌激素活性，發(fā)揮抗氧化作用[8]；苜蓿素能夠抑制人直腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用[9]；苜蓿素能夠抑制小鼠T和B淋巴細(xì)胞的增殖，具有一定的免疫抑制作用[10]。在LPS刺激下，黃芪苷、桑色素和葛根素均能夠抑制乳腺上皮細(xì)胞的TNF-α、白細(xì)胞介素6(IL-6)的表達(dá)，降低核因子κB(NF-κB)活性和磷酸化核因子κB抑制蛋白(IκBα)、p38、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p65的合成[11-13]。結(jié)果說明，在LPS刺激下，黃酮類物質(zhì)能夠通過抑制NF-κB信號通路的活化來降低其下游炎性因子TNF-α等的表達(dá)，起到抗炎作用。目前，苜蓿素對LPS刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究苜蓿素對LPS刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響，以此來探索苜蓿素是否能夠發(fā)揮抗炎作用，為苜蓿素在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苜蓿素(經(jīng)高效液相色譜分析得出純度≥98%)來自于燕麥，由上海源葉生物科技有限公司提供；LPS(血清型O55∶B5)來自于美國Sigma公司；試驗(yàn)所用奶牛乳腺上皮細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室通過組織塊培養(yǎng)法獲得，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法和鑒定見詹康等[14]的報(bào)道。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞毒性檢測

苜蓿素對細(xì)胞毒性的檢測采用CCK-8法。將奶牛乳腺上皮細(xì)胞分成8組，分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0(對照)、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、25.0和40.0 μg/mL的苜蓿素，每組5個(gè)重復(fù)，其中苜蓿素用二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司)完全溶解，培養(yǎng)基中的DMSO含量低于2‰。將乳腺上皮細(xì)胞接種在96孔板中，每孔數(shù)量為1×105個(gè)/mL，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入不同處理的培養(yǎng)基。在96孔板中，每孔接種乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)/mL，然后在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗后加入配制好的各組的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值，然后計(jì)算細(xì)胞相對增殖率，以此評斷苜蓿素的細(xì)胞毒性。相對增殖率計(jì)算公式如下：

相對增殖率(%)=(試驗(yàn)組OD450 nm/對照組OD450 nm)×100。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測

細(xì)胞活性也采用CCK-8法進(jìn)行檢測。將奶牛乳腺上皮細(xì)胞成分為6組，對照組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1 μg/mL LPS(L組)、1 μg/mL LPS和2.5 μg/mL苜蓿素(L+2.5組)、1 μg/mL LPS和5.0 μg/mL苜蓿素(L+5組)、1 μg/mL LPS和10.0 μg/mL苜蓿素(L+10組)以及1 μg/mL LPS和15.0 μg/mL苜蓿素(L+15組)，其他步驟同1.2.1。最終以細(xì)胞相對增殖率的高低判定細(xì)胞活性高低。

1.2.3 抗氧化性能的測定

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞成分為6組，分組方法同1.2.2，將細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種到6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞來檢測一氧化氮(NO)和MDA濃度、乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。檢測方法參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)中的說明書。

1.2.4 炎癥相關(guān)基因的相對表達(dá)量

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞成分為6組，分組方法同1.2.2，將細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種到6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL的Trizol，混勻靜置10 min，然后參照天根生化科技有限公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。提取出來的總RNA采用One Drop儀器進(jìn)行濃度和純度的檢測，然后采用瑞士Roche公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，操作方法、反應(yīng)體系和反應(yīng)液配制參照占今舜等[15]的報(bào)道。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒由瑞士Roche公司提供，PCR反應(yīng)液配制和反應(yīng)條件參照占今舜等[16]的報(bào)道。

根據(jù)GenBank中的基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物合成則由美國Invitrogen公司完成。甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因。引物序列見表1?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2007進(jìn)行整理，并在SPSS 21.0軟件上進(jìn)行ANOVA分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿素的細(xì)胞毒性

從表2中可知，苜蓿素濃度為2.5～15.0 μg/mL時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率隨著苜蓿素濃度的升高呈升高趨勢；苜蓿素濃度為15.0～40.0 μg/mL時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率隨著苜蓿素濃度的升高而呈下降趨勢。結(jié)果表明，在濃度一定范圍內(nèi)，苜蓿素提高細(xì)胞活性，而濃度過高則產(chǎn)生毒性。

表1 引物序列及參數(shù)

表2 苜蓿素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的毒性

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 苜蓿素對LPS刺激下細(xì)胞活性的影響

從表3中可知，L組奶牛乳腺上皮細(xì)胞相對增殖率極顯著低于其他各組(P<0.01)，L+2.5組和L+10組上皮細(xì)胞活性極顯著高于對照組和L+15組(P<0.01)。結(jié)果表明，在LPS刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性降低，而添加苜蓿素可以提高細(xì)胞活性。

2.3 苜蓿素對LPS刺激下細(xì)胞抗氧化性能的影響

從表4中可知，與L+2.5組、L+5組、L+10組和L+15組細(xì)胞SOD活性顯著高于其他各組(P<0.05)，L組的活性最低；L+10組細(xì)胞的MDA和NO濃度均顯著低于L組(P<0.05)；L組細(xì)胞LDH活性最高，而L+2.5組、L+5組、L+10組、L+15組與之相比顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，在LPS刺激下添加苜蓿素可以提高細(xì)胞的抗氧化性能。

表3 苜蓿素對脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性的影響

表4 苜蓿素對脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性能的影響

2.4 苜蓿素對LPS刺激下細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

從表5中可知，與對照組相比，其他各組細(xì)胞的白細(xì)胞介素8(IL-8)、IL-1β、IL-6和TNF-α的相對表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，而與L組相比，L+5組和L+10組細(xì)胞的IL-8、IL-1β和TNF-α的相對表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)。L組細(xì)胞Toll樣受體2(TLR2)和Toll樣受體4(TLR4)的相對表達(dá)量極顯著高于其他各組(P<0.01)。L組細(xì)胞髓樣分化因子88(MyD88)的相對表達(dá)量顯著或極顯著高于對照組和L+5組(P<0.05或P<0.01)。各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子1β(TGF-1β)和核苷酸結(jié)合寡聚域1(NOD1)相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，LPS能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，而添加苜蓿素能夠抑制它們的表達(dá)。

3 討 論

3.1 苜蓿素對LPS刺激下細(xì)胞活性的影響

通過體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，添加100 ng/mL的大豆黃酮和染料木黃酮、10～1 000 mg/L大豆異黃酮以及50～100 μg/mL苜蓿黃酮均可顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖[17-19]。在本試驗(yàn)中，添加2.5～15.0 μg/mL苜蓿素提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率，結(jié)果與上述研究一致。然而，當(dāng)苜蓿素濃度超過15.0 μg/mL時(shí)，相對增殖率有所下降，說明可能高濃度苜蓿素會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，為了避免苜蓿素對細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響試驗(yàn)，后續(xù)試驗(yàn)苜蓿素濃度就定在15.0 μg/mL以內(nèi)。

在LPS的刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率隨LPS濃度增加而下降[20]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，LPS刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率顯著下降，說明LPS具有抑制細(xì)胞增殖的作用。劉立新等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后，細(xì)胞相對增殖率顯著降低，而在LPS刺激下，添加不同濃度的紫花苜?？傸S酮能顯著提高細(xì)胞的活性，并且濃度越大效果越明顯。本試驗(yàn)所得結(jié)果與其一致。這說明在LPS刺激下，添加適宜濃度的苜蓿素能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。

3.2 苜蓿素對LPS刺激下細(xì)胞抗氧化性能的影響

一般體內(nèi)產(chǎn)生的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基過多，會導(dǎo)致細(xì)胞中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA，而MDA能夠促使細(xì)胞解體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。在LPS刺激下，豬空腸上皮細(xì)胞和奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的SOD和過氧化氫酶(CAT)活性降低，而MDA濃度升高[3,22]。LDH是糖酵解過程中的一種氧化還原類酶，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，LDH釋放出來。LPS能夠增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放率，且細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性隨著LPS濃度的增加而增加[19]。NO是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的重要信號分子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。在LPS誘導(dǎo)下，導(dǎo)致細(xì)胞NO濃度會升高，進(jìn)而激活環(huán)氧化酶2(COX-2)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。以上結(jié)果說明，LPS能夠降低抗氧化酶類的活性，增加細(xì)胞內(nèi)自由基濃度，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在LPS刺激下，柚苷能夠提高小鼠心臟SOD活性和降低MDA濃度[24]；茶多酚能夠提高人支氣管上皮細(xì)胞SOD活性，降低LDH活性和MDA濃度[25]。另外，苜蓿素、異甘草素、甘草素和柚皮素可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放[26-27]。本試驗(yàn)結(jié)果與這些研究相似，說明添加適量的苜蓿素可以通過提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化性能來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，提高細(xì)胞活性。

表5 苜蓿素對脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.3 苜蓿素對LPS刺激下細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)在調(diào)節(jié)組織炎癥和修復(fù)方面具有重要作用，LPS能夠明顯增加大鼠腹膜間皮細(xì)胞分泌TGF-β1[28]。NOD1在全身各種組織細(xì)胞中均有分布，在天然免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在LPS刺激下，仔豬的肝臟和下丘腦垂體腎上腺中NOD1的表達(dá)量顯著升高[29-30]。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，LPS刺激下，奶牛乳腺上皮中TGF-β1和NOD1的相對表達(dá)量升高，添加苜蓿素對其無顯著影響。這說明苜蓿素不能通過調(diào)節(jié)TGF-β和核苷酸結(jié)合寡聚域(NOD)信號通路來發(fā)揮抗炎癥作用。LPS是一種重要的炎癥因子，能夠誘導(dǎo)TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠顯著下調(diào)LPS刺激下人外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-6的生成，抑制TLR4、MyD88和TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)的活性；通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路，抑制NF-κB信號，降低COX-2和TNF-α濃度，提高人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎癥作用[31-33]。另外，苜蓿素能夠顯著降低哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α和IL-1β濃度以及肺泡巨噬細(xì)胞的TLR4、MyD88和NF-κBp65相對表達(dá)量和蛋白質(zhì)濃度[34]。本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下，苜蓿素能夠抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β、TLR4、TLR2和MyD88的表達(dá)。這說明苜蓿素提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗炎癥作用可能與其調(diào)控TLR/MyD88/NF-κB通路有關(guān)。

4 結(jié) 論

① 苜蓿素能夠提高LPS刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化性能，提高細(xì)胞相對增殖率。

② 苜蓿素可能通過調(diào)控TRL/MyD88/NF-κB通路，降低炎癥因子的表達(dá)和NO的生成，進(jìn)而發(fā)揮抗炎癥作用。

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