短期試驗(yàn)條件下不同硒源對泌乳奶牛血漿和乳中硒含量及血清抗氧化能力的影響

孫玲玲 王 坤 高勝濤 劉士杰 卜登攀,3,4*

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2．中國飼料工業(yè)協(xié)會，北京 100125；3．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與世界農(nóng)用林業(yè)中心農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；4．湖南畜產(chǎn)品質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128)

硒是維持動物及人類健康的重要微量元素，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮許多重要的生物學(xué)功能，如增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、促進(jìn)維生素A和維生素K的吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝等[1]。硒缺乏將影響機(jī)體正常生理代謝，危害畜禽的生長和繁殖，且有很多研究表明，人類20余種疾病都與機(jī)體內(nèi)硒營養(yǎng)狀況相關(guān)[2]。為滿足機(jī)體的正常生理代謝，成年人每天應(yīng)保證一定的硒攝入量。飲食是人類獲取硒的直接途徑，在動物飼糧中增補(bǔ)硒在滿足營養(yǎng)需要的同時，其生產(chǎn)的富硒動物性產(chǎn)品對人類膳食硒的補(bǔ)充具有重要意義，而富硒牛奶是人類補(bǔ)硒的一種重要動物性產(chǎn)品。

研究表明，奶牛飼糧中添加硒可增加牛奶中硒含量[3-6]。硒有2種常用形式，一種是價格低廉，但毒性較強(qiáng)且生物學(xué)利用率較低的無機(jī)硒，如硒酸鹽和亞硒酸鹽；另一種是價格昂貴但低毒高效的有機(jī)硒，如酵母硒等[7]。硒的吸收主要發(fā)生在小腸，有機(jī)硒中的硒代蛋氨酸在小腸中通過蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被吸收，吸收率約為80%，而無機(jī)硒主要以被動擴(kuò)散的形式在小腸中吸收，吸收率約為50%[8]。薈萃分析的結(jié)果表明，奶牛飼糧中添加酵母硒與添加無機(jī)形式的硒相比可顯著提高乳中硒含量[9]。蛋氨酸硒羥基類似物(2-hydroxy-4-methylselenobutanoic acid,HMSeBA)是一種新型有機(jī)硒資源，不同于蛋氨酸硒之處在于其2號碳原子上的氨基被羥基取代。歐盟于2013年允許HMSeBA作為飼料添加劑應(yīng)用于動物生產(chǎn)中，在豬[10]、雞[11]等單胃動物上的研究已經(jīng)證明了HMSeBA作為一種新型有機(jī)硒添加劑的有效性。本課題組前期的研究表明，在長期試驗(yàn)條件下，相比于無機(jī)硒，HMSeBA有助于提高奶牛的抗氧化能力及營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率[12]。然而，一方面，有機(jī)硒高昂的價格極大地限制了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的長期應(yīng)用；另一方面，HMSeBA作為一種新型有機(jī)硒添加劑，其在提高牛奶中硒含量的潛力未有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過在短期試驗(yàn)條件下比較HMSeBA和亞硒酸鈉(sodium selenite,SS)對泌乳奶牛血漿和乳中硒含量及抗氧化能力的影響，為其在生產(chǎn)富硒奶方面的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HMSeBA，含硒量為2%，由安迪蘇生命科學(xué)制品(上海)有限公司提供；SS為分析純化學(xué)試劑，純度≥99.5%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取8頭胎次[(2.01±1.23)胎]、泌乳天數(shù)[(158±27) d]、產(chǎn)奶量[(25.3±2.8) kg/d]相近的健康中國荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為2組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.3 mg/kg DM的HMSeBA和SS，每組4頭。預(yù)試期2周，正試期4周。

試驗(yàn)在動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室昌平基地環(huán)控艙中進(jìn)行。奶牛每天飼喂2次(07:00和19:00)，HMSeBA和SS分別與粉碎的玉米混合，在晨飼時撒在飼糧表面，保證奶牛進(jìn)食完全。自由采食、飲水，每天擠奶2次(07:00和19:00)?；A(chǔ)飼糧每天配制，所用預(yù)混料為無硒預(yù)混料(三元種業(yè)科技股份有限公司)，測得基礎(chǔ)飼糧中的硒含量為0.05 mg/kg DM?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 采食量

正試期第4周連續(xù)7 d記錄所有牛的加料量，晨飼前收集每頭牛的剩料并稱重，從而計(jì)算每頭牛每天的采食量，并在此期間每天收集有代表性的飼料樣和剩料樣，測定干物質(zhì)含量用以計(jì)算每頭牛每天的干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)購自德國百事美公司。Brought from Berg+Schmidt Co., Germany.

2)購自美國達(dá)能威公司。Brought from Diamond V Co., USA.

3)購自百奧明飼料添加劑(上海)有限公司。Brought from Biomin feed additive (Shanghai) Co., Ltd.

4)每千克預(yù)混料含 One kilogram of premix contained the following：Cu 1 230 mg,Zn 4 950 mg, Mn 1 760 mg, I 50 mg,Co 37 mg, VA 504 800 IU, VD388 800 IU, VE 2 100 IU, VB3700 mg。

5)泌乳凈能為計(jì)算值，由CPM-Dairy 3.8.0.1V計(jì)算得出，其他營養(yǎng)水平為實(shí)測值。NELwas a calculated value, and was calculated by CPM-Dairy 3.8.0.1V, while the other nutrient levels were measured values.

1.3.2 產(chǎn)奶量及乳成分

正試期的第4周連續(xù)7 d每天記錄每頭牛的產(chǎn)奶量，按以下公式計(jì)算4%乳脂校正乳產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化率：

4%乳脂校正乳產(chǎn)量(kg/d)=0.4×產(chǎn)奶量(kg/d)+15×乳脂產(chǎn)量(kg/d)；飼料轉(zhuǎn)化率=4%乳脂校正乳產(chǎn)量(kg/d)/DMI(kg/d)。

并于每天早、晚收集奶樣，按1∶1混勻。50 mL奶樣加入含有重鉻酸鉀防腐劑的上機(jī)管中，4 ℃保存過夜，第2天送往農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量檢測監(jiān)督中心(北京)，采用乳成分分析儀(MilkoScanTMFT 6000，丹麥FOSS)測定乳成分，采用細(xì)胞分析儀(Fossmatic 5000，丹麥FOSS)測定乳中體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count,SCC)，根據(jù)以下公式計(jì)算乳中體細(xì)胞評分

乳中體細(xì)胞評分=log2[SCC(個/mL)/

100 000]+3。

另取50 mL分裝到10 mL離心管中，-20 ℃保存，參照Heard等[13]描述的方法測定乳中硒含量，1.0 g的奶樣經(jīng)10 mL硝酸和高氯酸混合液消化后加入2 mL鹽酸，然后采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS/MS)(Agilent 8800,美國Agilent公司)測定乳中硒含量。

1.3.3 血清抗氧化指標(biāo)和血漿硒含量

正試期第4周的最后2天于晨飼后3 h尾靜脈采集血液于10 mL真空采血管中，分為2份。一份用于分離血漿，血液立即3 000×g、4 ℃離心15 min，得到血漿，-20 ℃冰箱冷凍保存，用于血漿硒含量的測定。血漿硒含量的測定同乳中硒含量的測定方法，但血漿的使用量為0.5 g。根據(jù)以下公式計(jì)算硒遷移率：

硒遷移率(%)={1 000×[產(chǎn)奶量(kg/d)×乳中硒含量(μg/kg)]/[DMI(kg/d)×飼糧中硒含量(mg/kg)]}×100。

另一份用于分離血清，血液在室溫靜止30 min后于4 ℃冷藏過夜，3 000×g、4 ℃離心15 min，得到血清，-20 ℃冰箱冷凍保存，用于抗氧化能力的測定。使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定血清中總抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.4軟件中的MIXED模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)模型中，試驗(yàn)牛為隨機(jī)因素，試驗(yàn)處理為固定因素。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有差異顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMI、產(chǎn)奶量及乳成分

由表2可知，飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛DMI、產(chǎn)奶量、4%乳脂校正乳產(chǎn)量、飼料轉(zhuǎn)化率、乳蛋白率、乳蛋白產(chǎn)量、乳糖率、乳糖產(chǎn)量、乳中固形物含量、乳中非脂固形物含量以及乳中體細(xì)胞評分沒有顯著影響(P>0.05)；與SS組相比，HMSeBA組的乳脂率(P=0.060 3)及乳脂產(chǎn)量(P=0.055 2)有下降的趨勢。

表2 飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛DMI、產(chǎn)奶量及乳成分的影響

續(xù)表2項(xiàng)目Items組別GroupsSSHMSeBA標(biāo)準(zhǔn)誤SEMP值P?value乳糖率Lactosepercentage/%4．834．940．0280．5691乳糖產(chǎn)量Lactoseyield/(g/d)1132．691230．6620．5540．3798乳中固形物含量Milksolidcontent/%12．4412．200．1030．4880乳中非脂固形物含量Milknon?fatsolidcontent/%9．379．320．0500．8902乳中體細(xì)胞評分Milksomatocytescore3．473．270．0640．3156

2.2 血漿和乳中硒含量

由表3可知，與SS組相比，HMSeBA組奶牛血漿中硒含量及乳中硒含量顯著升高(P<0.05)，分別較SS組提高了39.63%和77.96%；HMSeBA組硒遷移率為15.7%，高于SS組的9.0%。

表3 飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛血漿和乳中硒含量的影響

2.3 血清抗氧化能力

由表4可知，飼糧中添加不同硒源對奶牛血清中GSH-Px的活性沒有顯著影響(P>0.05)；與SS組相比，HMSeBA組奶牛血清中T-AOC及SOD活性顯著升高(P<0.05)，而MDA含量顯著降低(P<0.05)。

表4 飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛抗氧化能力的影響

3 討 論

從實(shí)際生產(chǎn)的角度出發(fā)，不添加硒會使奶牛處于亞健康狀態(tài)，實(shí)際生產(chǎn)中添加的硒一般為無機(jī)形式的硒，但與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒有更大的吸收率[14]、更高的生物學(xué)活力[15]、更多的組織存留率[11]及更低的毒性。因本試驗(yàn)旨在比較一種新型的有機(jī)硒資源HMSeBA與SS在短期試驗(yàn)條件下對乳中硒存留率的影響，故只設(shè)了有機(jī)硒和無機(jī)硒2組。美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)推薦硒(包括有機(jī)硒和無機(jī)硒)的添加量為0.3 mg/kg DM，飼糧中此劑量的硒即可滿足奶牛的營養(yǎng)需要，故本試驗(yàn)設(shè)定硒的添加水平為0.3 mg/kg DM。

3.1 飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛DMI、產(chǎn)奶量及乳成分的影響

硒是維持動物正常生長不可或缺的微量元素。當(dāng)飼糧中的硒濃度表現(xiàn)為極度缺乏或中毒劑量時，會對動物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生一定的影響[16]。當(dāng)動物體內(nèi)硒的儲存量不足時，在飼糧中添加適宜劑量的硒可促進(jìn)動物生長，且有研究表明有機(jī)硒的應(yīng)用效果要優(yōu)于無機(jī)硒[17-19]。本試驗(yàn)選用FDA推薦的硒添加量在飼糧中分別添加HMSeBA和SS這2種硒源，且在此添加劑量下，HMSeBA和SS組的奶牛平均每天分別攝入硒5.7和5.6 mg，血漿中的硒含量分別為84.4和60.4 μg/kg，均在Villar等[20]推薦血漿適宜硒含量范圍(51～85 μg/kg)內(nèi)，奶牛的生產(chǎn)性能上未表現(xiàn)出顯著的差異。這與Calamari等[21]和王建等[12]進(jìn)行的長期試驗(yàn)結(jié)果相一致，即不同硒源并未影響奶牛的生產(chǎn)性能。然而，不同于以上研究之處在于本試驗(yàn)中HMSeBA組的奶牛乳脂率及乳脂產(chǎn)量與SS組的奶牛相比有降低的趨勢，F(xiàn)raser等[22]曾報(bào)道在增補(bǔ)硒后的第1個季節(jié)里乳脂產(chǎn)量與血液中硒含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，Pehrson等[23]報(bào)道這種負(fù)相關(guān)關(guān)系是由于硒參與了三羧酸循環(huán)中的氧化過程以及脂肪酸的代謝過程。

3.2 飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛血漿和乳中硒含量的影響

吸收入血液的硒與α球蛋白、β球蛋白、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)以及白蛋白相結(jié)合，血漿中的硒主要與白蛋白相結(jié)合[24]。Villar等[20]報(bào)道，血漿中適宜的硒含量為51～85 μg/kg，為達(dá)到這一含量需在飼糧中添加一定劑量的硒。研究表明，同等劑量的有機(jī)硒提高奶牛血液中硒含量的效果要優(yōu)于無機(jī)硒[3-5]。Weiss等[25]認(rèn)為有機(jī)硒和無機(jī)硒飼喂奶牛，其血液中硒含量可相差約20%。本試驗(yàn)中，血漿硒含量均在正常范圍內(nèi)，且HMSeBA組的奶牛血漿硒含量較SS組高39.6%，高于Weiss等[25]提出的參考值，證明HMSeBA作為一種新型有機(jī)硒資源在提高奶牛血漿中硒含量方面效果更明顯。

Rowntree等[26]報(bào)道，血漿中的硒含量是乳中硒含量的3～5倍，血漿中硒含量的升高將導(dǎo)致乳中硒含量的升高。乳腺可優(yōu)先吸收并整合有機(jī)硒中的硒代蛋氨酸合成乳蛋白[23]，因此很多研究表明，在提高乳中硒含量上，有機(jī)硒的應(yīng)用效果要優(yōu)于無機(jī)硒[6]。Juniper等[3]向奶牛飼糧中添加一定劑量的酵母硒與同等劑量的SS相比，可提高34%的乳中硒含量。朱松波等[27]發(fā)現(xiàn)，奶牛每天攝入15 g納米硒，在第30天時，乳中硒含量達(dá)到34 μg/kg。本試驗(yàn)中，HMSeBA組奶牛的乳中硒含量為39.88 μg/kg，比SS組奶牛高78.0%，高于以上研究中使用酵母硒和納米硒得到的結(jié)果。這表明HMSeBA可能是一種更加有效的提高乳中硒含量的有機(jī)硒添加劑。Givens等[28]報(bào)道，在英國，乳中硒含量平均值為10 μg/kg，奶牛飼糧中添加酵母硒來取代SS可以通過提高乳中硒含量來緩解人類膳食硒的缺乏。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，HMSeBA提高乳中硒含量的效果可能優(yōu)于酵母硒，因此HMSeBA可被用來生產(chǎn)富硒牛奶，且短期條件下的效果就很明顯。HMSeBA組奶牛飼糧中的硒轉(zhuǎn)化成乳中硒的效率(即硒遷移率)為15.7%，高于SS組的9.0%，與Calamari等[21]的研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步說明奶牛利用HMSeBA生產(chǎn)富硒牛奶的潛力高于SS。

3.3 飼糧中添加不同硒源對泌乳奶牛血清抗氧化能力的影響

硒蛋白GSH-Px是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。硒是GSH-Px的活性成分，因此在奶牛飼糧中增補(bǔ)一定劑量的硒可以提高血液GSH-Px的活性，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力[29]。然而關(guān)于硒源對血液GSH-Px活性影響的報(bào)道存在諸多爭議。曹雪瑾[30]、田金可[31]及許宗運(yùn)等[32]分別在斷奶仔豬、肉雞及奶牛上的研究表明，添加適宜劑量的硒可以提高血液中GSH-Px的活性，且與同等劑量的無機(jī)硒相比，酵母硒的應(yīng)用效果更好。然而Juniper等[3]探究不同來源硒對泌乳奶牛影響的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在第5周時血液中的GSH-Px活性未受到硒源的影響，這與Weiss[6]總結(jié)的9篇關(guān)于硒源對血液GSH-Px活性影響的報(bào)道結(jié)果相一致。Ortman等[15]在第6周時也觀察到了類似的結(jié)果，但當(dāng)試驗(yàn)從第6周進(jìn)行到12周時發(fā)現(xiàn)，添加酵母硒組奶牛血液中GSH-Px活性顯著高于無機(jī)硒組。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在第4周時2組奶牛血清中GSH-Px活性沒有顯著差異，這與王建等[12]進(jìn)行的12周試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是4周的試驗(yàn)時間未能對血清GSH-Px活性產(chǎn)生顯著影響。血液T-AOC和SOD活性也是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，其中T-AOC可以反映機(jī)體對外來刺激的代償能力，血液SOD活性可以反映機(jī)體清除自由基的能力[33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，HMSeBA組奶牛血清T-AOC及SOD活性均高于SS組，分別提高了43.46%和23.32%，這與許宗運(yùn)等[32]和黃志堅(jiān)等[34]比較酵母硒和SS對奶?？寡趸芰τ绊懙慕Y(jié)果相一致，且許宗運(yùn)等[32]的結(jié)果表明，酵母硒組較SS組血液T-AOC及SOD活性分別提高了37.7%和15.4%，均低于本試驗(yàn)的結(jié)果，表明HMSeBA在短期內(nèi)具有更好的提高奶?？寡趸芰Φ淖饔眯Ч?。MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，由自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成，可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，還能加劇膜的損傷，且具有細(xì)胞毒性[35]。本試驗(yàn)中，HMSeBA組較SS組顯著地抑制了MDA的生成，與Gong等[36]及黃志堅(jiān)等[34]的研究結(jié)果相一致，表明HMSeBA降低脂質(zhì)過氧化的效果要優(yōu)于SS。

4 結(jié) 論

在短期試驗(yàn)條件下，飼喂新型有機(jī)硒添加劑HMSeBA的奶牛將飼糧中的硒轉(zhuǎn)化成乳中硒的效率高于SS，顯著提高了乳中硒含量，且其生產(chǎn)富硒牛奶的潛力在短期條件下就很明顯，并未對奶牛產(chǎn)奶量和乳成分等造成不利影響，且顯著提高了奶牛的血清抗氧化能力。

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