哺乳動物雷帕霉素靶蛋白生物學(xué)作用及機制

袁登越 吳源冰 林方軍 覃川杰 李志瓊*

(1.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室，內(nèi)江 641100；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是雷帕霉素在動物體內(nèi)的一種靶蛋白，而雷帕霉素是一種吸水鏈霉菌產(chǎn)出的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。20世紀(jì)70年代，Vézina等[1]在智利的復(fù)活節(jié)島的土壤中分離出這種細菌并報道了雷帕霉素。1991年Heitman等篩選出抗雷帕霉素的啤酒酵母突變株，對比發(fā)現(xiàn)了3個與此抗性有關(guān)的基因，其中2個基因以其發(fā)現(xiàn)地建筑Spalentor命名為雷帕霉素靶蛋白1(TOR1)和雷帕霉素靶蛋白2(TOR2)[2-3]。1994年，Sabatini首次在哺乳動物——大鼠中發(fā)現(xiàn)了與雷帕霉素結(jié)合的蛋白質(zhì)，而編碼該蛋白質(zhì)的基因與酵母TOR1和TOR2同源，該作者就將其正式命名為“mammalian target of rapamycin(mTOR)”，即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白[4]。除哺乳動物外，mTOR在其他物種中也廣泛分布，如擬南芥、果蠅和鯉魚等[5-7]。后來研究證實，mTOR是一種結(jié)構(gòu)與功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過整合來自上游的信號因子進而發(fā)揮生物學(xué)功能。由于廣泛參與機體的生物學(xué)功能，mTOR現(xiàn)已成為生物科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。為此，本文著重闡述了mTOR的主要生物學(xué)作用及其機制，以期為各同行在研究過程中提供一定的參考。

1 mTOR結(jié)構(gòu)

1.1 mTOR的基因結(jié)構(gòu)

目前，已在315種真核生物中鑒定出mTOR基因。一些代表種，如酵母mTOR基因長7 413 bp，編碼2 470個氨基酸殘基長度的蛋白質(zhì)；其旁系同源基因mTOR2長7 425 bp，編碼2 474個氨基酸殘基長度的蛋白質(zhì)。人類mTOR基因位于1號染色體短臂(1p36.2)，其開放閱讀框為7 650 bp，編碼2 549個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為288.95 ku。大鼠mTOR基因位于5號染色體長臂(5q36)，開放閱讀框為8 554 bp，編碼2 549個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為288.85 ku。由此可見，mTOR基因結(jié)構(gòu)十分保守，各物種的mTOR基因片段大小以及編碼mTOR的氨基酸片段大小近似。

1.2 mTOR的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK)家族。mTOR由多個結(jié)構(gòu)域組成，從N端到C端依次是20個HEAT重復(fù)域、FAT域、FRB域、激酶域(kinase domain，KD)和C末端FAT域。HEAT域是在一些細胞質(zhì)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的α螺旋結(jié)構(gòu)串聯(lián)的模體，是4種細胞質(zhì)蛋白質(zhì)[亨廷頓蛋白(huntingtin)、延長因子3(elongation factor 3)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)亞單元和雷帕霉素靶蛋白(TOR)]的簡寫，該區(qū)域與蛋白質(zhì)間相互作用及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運相關(guān)[8]。FAT域是一段PIKK家族共有的激酶域，由PIKK家族的3個蛋白質(zhì)(FRAP、ATM和TRRAP)簡寫構(gòu)成，與mTOR的活性有關(guān)。FRB域為FK506結(jié)合蛋白雷帕霉素結(jié)合域(FKBP12-rapamycin binding domain)的簡寫，它為mTOR與雷帕霉素提供結(jié)合的位點(圖1)[9]。

圖1 mTOR的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

mTOR上還有4個磷酸化位點，分別是絲氨酸1261、蘇氨酸2446、絲氨酸2448和絲氨酸2481位點，這些磷酸化位點與mTOR的功能密切相關(guān)。HEAT域的絲氨酸1261位點受到胰島素信號作用而磷酸化，絲氨酸1261位點的磷酸化能進一步促進mTOR下游核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，S6K)和真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1)發(fā)生磷酸化；蘇氨酸2446位點受營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控，通過腺苷酸激酶(adenosine monophosphate kinase，AMPK)途徑完成磷酸化作用；絲氨酸2448位點受S6K磷酸化作用；絲氨酸2481是一個對雷帕霉素敏感且具有自發(fā)磷酸化的位點[10-11]。

2 mTOR的組織分布

mTOR廣泛分布于動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織。Cota等[12]利用免疫組織化學(xué)的方法研究報道了mTOR在大鼠腦中的分布情況，結(jié)果顯示mTOR廣泛分布在大鼠各腦區(qū)，在下丘腦區(qū)域內(nèi)的室旁核以及弓狀核還發(fā)現(xiàn)了大量磷酸化(絲氨酸2448位點)的mTOR，而下丘腦外側(cè)區(qū)域磷酸化的mTOR較少。檢測山羊各組織中mTORmRNA水平時發(fā)現(xiàn)，mTORmRNA在腦、睪丸、脾臟、腎臟和心臟中含量較高，而在肝臟和肺臟中含量較少[13]。Makky等[14]用原位雜交技術(shù)研究對比了斑馬魚mTOR的時空分布情況，結(jié)果顯示斑馬魚的腦中最先表達mTORmRNA，隨后在腸道中檢測到mTORmRNA的表達。Jiang等[7]對比了鯉魚mTOR的時空分布情況，結(jié)果顯示鯉魚的心臟、肌肉、頭腎、脾臟、鰓和腸道均有mTORmRNA表達，但表達量存在著時空差異。

3 mTOR的生物學(xué)功能

3.1 調(diào)節(jié)攝食

mTOR不具有直接調(diào)控攝食的作用，而是受機體能量水平等因素作用，調(diào)控處于其下游的食欲調(diào)節(jié)因子的表達，進而參與攝食調(diào)控。已有研究表明，mTOR與中樞食欲調(diào)節(jié)因子神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related protein，AgRP)、黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)和可卡因-安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)以及外周食欲調(diào)節(jié)因子瘦素(leptin)、胃饑餓素(ghrelin)和nesfatin-1(一種飽食分子蛋白)相互關(guān)聯(lián)，在食欲調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。NPY[15]、AgRP[16]、POMC[17]、CART[18]神經(jīng)核團均存在于下丘腦這一攝食調(diào)節(jié)中樞，發(fā)揮著增食欲或抑制食欲的作用。leptin[19]、ghrelin[20]和nesfatin-1[21]是存在于外周組織調(diào)節(jié)食欲的因子，也具有調(diào)節(jié)食欲的作用。

Cota等[12]的研究首次證實mTOR對動物攝食具有調(diào)節(jié)作用。中樞系統(tǒng)mTOR信號通路可過感應(yīng)細胞外營養(yǎng)物質(zhì)和激素水平調(diào)控大鼠攝食。大鼠進食后弓狀核mTOR及下游靶點S6K1磷酸化水平增加；當(dāng)禁食48 h后，mTOR和S6K1的磷酸化水平降低，而大鼠禁食后再喂食，使其磷酸化水平再次增加，從而進一步明確了下丘腦mTOR在機體能量感知方面的重要作用。食物中的蛋白質(zhì)含量也能影響mTOR信號通路的表達，投喂高蛋白質(zhì)的飼糧能促使長白豬mTOR的磷酸化[22]。此外，mTOR還可以調(diào)節(jié)其他食欲肽的表達量。研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠腦室注射leptin后，下丘腦mTOR的磷酸化水平增加，而注射mTOR的抑制劑雷帕霉素后，leptin的生理效應(yīng)明顯減弱。此后的研究表明，mTOR對諸多食欲因子都具有相似的調(diào)節(jié)方式。mTOR信號通路介導(dǎo)了外周的ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的增食欲作用。Martins等發(fā)現(xiàn)，腦室注射ghrelin 2 h后的大鼠攝食量顯著增加，同時mTOR和S6K1磷酸化水平也顯著增加[23]。下丘腦中的mTOR在轉(zhuǎn)導(dǎo)甲狀腺激素信號的攝食調(diào)控功能方面也具有相似的作用機制[24]，即受機體能量水平等因素作用，調(diào)控其下游的食欲調(diào)節(jié)因子的表達繼而參與攝食調(diào)控。甲狀腺激素是響應(yīng)并調(diào)節(jié)機體能量狀態(tài)重要因子，大鼠下丘腦弓狀核注射甲狀腺激素后增食欲因子NPY和AgRP基因的表達量顯著增加，厭食因子POMC基因的表達量顯著減少，大鼠攝食量增加。與此同時，下丘腦mTOR及其下游因子的磷酸化水平顯著增加，而肝臟中mTOR及其下游因子的磷酸化水平顯著降低。相應(yīng)地，腦室注射雷帕霉素阻斷mTOR信號后，增食欲因子的基因表達量不再因甲狀腺激素增加而升高，大鼠體重也隨之下降。mTOR在攝食調(diào)控過程中的這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用還見于其他食欲因子的研究[25-27]。

3.2 調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成

mTOR參與了脂質(zhì)合成、脂質(zhì)β氧化和脂質(zhì)分解等脂質(zhì)代謝過程。在脂質(zhì)合成中，脂肪酸及甘油三酯的合成是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其間主要包括脂質(zhì)合成酶以及脂質(zhì)合成酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD)、lipin 1、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)等。此外，脂肪氧化分解相關(guān)酶的活性與脂質(zhì)的合成效率緊密相關(guān)，如三酰甘油脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)、激素敏感酯酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)和單酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MGL)等。受上游營養(yǎng)因子或胰島素等信號激發(fā)，mTOR能增加脂質(zhì)合成最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子——SREBP-1c基因的表達[28]，繼而使機體脂質(zhì)合成作用加快。2008年首次報道了mTOR具有調(diào)節(jié)SREBP-1c表達，影響脂質(zhì)合成的作用。用4-羥基他莫昔芬激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)處理人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞4 h后，細胞核內(nèi)的SREBP-1c水平顯著升高。由于核內(nèi)SREBP-1c能增加脂質(zhì)合成相關(guān)酶基因表達，脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN)mRNA水平也在4 h后顯著增加；當(dāng)用雷帕霉素阻斷mTOR的信號傳遞后，核內(nèi)SREBP-1c不再因AKT的激活而增加，F(xiàn)ASN和ATP-檸檬酸裂合酶(ATP citrate lyase，ACLY)的mRNA水平也因此受阻[29]。

mTOR對SREBP-1c的調(diào)節(jié)是多方面的，主要是mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)加工。在SREBP-1c的脂質(zhì)合成作用研究中，進食或胰島素刺激均能增加動物肝臟細胞SREBP-1c基因的表達量[30-31]。Owen等[32]發(fā)現(xiàn)大鼠肝細胞在100 nmol/L胰島素浸潤15 min后，細胞核內(nèi)SREBP-1c水平達到峰值并持續(xù)至6 h；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、mTOR和S6K的拮抗劑：渥曼青霉素、雷帕霉素和LYS6K2均可阻斷胰島素對細胞核內(nèi)SREBP-1c的作用，表明胰島素-PI3K-mTOR-S6K通路調(diào)節(jié)SREBP-1c的蛋白質(zhì)加工；然而雷帕霉素預(yù)處理30 min抑制胰島素浸潤對SREBP-1c有升高作用，LYS6K2未能降低SREBP-1cmRNA表達量。這些研究結(jié)果表明，mTOR對SREBP-1c的mRNA轉(zhuǎn)錄與SREBP-1c的蛋白質(zhì)加工的調(diào)節(jié)通路不盡相同，轉(zhuǎn)錄和加工的具體調(diào)控途徑仍不清楚。近來有研究表明，mTOR調(diào)控了SREBP-1c由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運過程。Han等[33]研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR會導(dǎo)致SREBP-1c向高爾基體的轉(zhuǎn)運受阻。環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)響應(yīng)元件結(jié)合蛋白的共激活因子——轉(zhuǎn)錄激活因子2(CREB regulated transcription coactivator 2，CRTC2)基因突變會引發(fā)小鼠肝細胞中甘油三酯增多，甘油三酯合成相關(guān)基因mRNA表達量升高，高脂飼喂能進一步增強這種作用；與此同時，細胞核外未成熟的SREBP-1c沒有變化，SREBP-1cmRNA表達量未出現(xiàn)顯著差異，而細胞核內(nèi)SREBP-1c增多，深入研究表明，mTOR在這一過程中發(fā)揮重要作用；mTOR受機體能量水平升高而激活，使得CRTC2的136位氨基酸殘基發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致CRTC2與運輸?shù)鞍踪|(zhì)COPⅡ的亞基Sec31分離，分離的Sec31得以與Sec23結(jié)合，從而將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上未成熟的SREBP-1c運輸至高爾基體。

3.3 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成

mTOR通過磷酸化下游的4E-BP1和S6K，從而刺激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平提高，mTOR促進蛋白質(zhì)合成的作用對于細胞的生長和增殖有重要作用[34]。4E-BP1是與真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)結(jié)合的蛋白，而eIF4E是真核翻譯起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F,eIF4F)翻譯起始復(fù)合物的帽子結(jié)合亞單位。真核細胞mRNA的5＇端7-甲基鳥苷“帽子”是調(diào)控其轉(zhuǎn)錄效率、剪切形式和核外運輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)，幾乎所有真核細胞都需要eIF4F將核糖體導(dǎo)向mRNA的這種帽子結(jié)構(gòu)，從而開啟mRNA的翻譯過程，而4E-BP1通過與eIF4E結(jié)合抑制翻譯的起始。當(dāng)mTOR信號因上游一些刺激而激活以后，4E-BP1作為其下游因子發(fā)生磷酸化，致使4E-BP1構(gòu)象改變并與eIF4E脫離，mRNA翻譯效率提升[33,35]。已知一些支鏈氨基酸能激活mTOR信號[36]。在奶牛上的研究還發(fā)現(xiàn)，L-亮氨酸和L-異亮氨酸都能夠增強mTOR和S6K1的磷酸化水平及促進乳腺細胞中的蛋白質(zhì)合成[37]。新生仔豬禁食24 h后，分別灌喂低蛋白質(zhì)(LP組)、低蛋白質(zhì)+亮氨酸(LP+L組)和高蛋白質(zhì)(HP組)的飼糧后，LP+L和HP組的mTOR/S6K/4E-BP1磷酸化水平及蛋白質(zhì)合成水平顯著高于LP組[38]。Columbus等[39]在研究亮氨酸對仔豬蛋白質(zhì)合成的作用時做了類似的處理，LP+L或HP組仔豬血漿中的亮氨酸、異亮氨酸和頡氨酸含量顯著增加，LP+L組的mTOR信號通路中的4E-BP1和eIF4G·eIF4E的磷酸化水平均顯著高于LP組；與此同時，HP組仔豬的體重和瘦肉量均顯著增加。此外，Yao等[40]發(fā)現(xiàn)精氨酸也可以激活mTOR信號通路，并促進仔豬肌肉蛋白質(zhì)的合成和體重的增加。同樣的結(jié)果在原雞上也得到了證實，在含有精氨酸的培養(yǎng)液中，mTOR、4E-BP1和S6K1 mRNA表達量得到了顯著的增加，且雞腸上皮細胞的蛋白質(zhì)合成增強，蛋白質(zhì)分解減弱[41]。以上研究結(jié)果表明，亮氨酸等氨基酸激活了mTOR的信號通路，4E-BP1的磷酸化水平也隨著增加，使得蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因表達量增加，最終使得機體的蛋白質(zhì)合成增多。

3.4 調(diào)節(jié)細胞自噬

自噬是細胞內(nèi)的物質(zhì)成分利用溶酶體被降解過程的統(tǒng)稱。細胞在外界因素(營養(yǎng)成分、缺血和缺氧、生長因子濃度等)及內(nèi)在因素(代謝壓力、破壞的細胞器等)的誘發(fā)下，通過對受損細胞器等大分子物質(zhì)進行降解，細胞自噬為合成新的蛋白質(zhì)提供所需的原料，有利于維持蛋白質(zhì)代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

mTOR調(diào)節(jié)自噬已有廣泛的研究，其調(diào)節(jié)機制是調(diào)控ULK1-Atg13-RB1CC1-Atg101復(fù)合體的磷酸化狀態(tài)。在營養(yǎng)豐富的條件下，mTOR磷酸化Atg13，后者在高磷酸化狀態(tài)下，與Atg1的親和力下降，使Atg1激酶活性降低，細胞自噬水平下降。相反，在饑餓條件下，mTOR活性被抑制，Atg13去磷酸化并與Atg1激酶緊密結(jié)合，導(dǎo)致Atg1激酶激活從而啟動自噬，雷帕霉素可抑制mTOR的活性，有助于Atg13去磷酸化和Atg1活化，誘導(dǎo)自噬[42-43]。有研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATM的C端序列與PI3K催化區(qū)同源,能夠刺激LBK/AMPK/TSC2通路下游信號,從而抑制mTOR。mTOR被抑制后可激活ULK1，ULK1通過與UVRAG結(jié)合再使beclin 1(絲氨酸14位點)磷酸化,從而增強beclin 1-Vps34-Atg14L復(fù)合體的活性，啟動自噬[44-45]。

3.5 mTOR調(diào)節(jié)衰老

衰老是隨著時間的推進在機體內(nèi)出現(xiàn)的細胞以及組織器官的生理功能的衰退現(xiàn)象。一直以來，衰老都是研究的焦點，mTOR也因其參與衰老進程的調(diào)控作用而得到大量的研究。其中，2009年，首次在《Nature》上報道了mTOR信號與衰老有密切的關(guān)系。該研究發(fā)現(xiàn)，600日齡的雌雄小鼠飼糧中添加mTOR的抑制劑雷帕霉素，分別提高了雌雄小鼠13%和9%的壽命[46]。隨后，有學(xué)者關(guān)注了mTOR下游信號與衰老之間的關(guān)系。在mTOR-S6K1信號通路中，限制能量攝入的小鼠或敲除S6K1基因的小鼠同樣表現(xiàn)出了壽命延長，衰老相關(guān)疾病減輕[47]。以上研究表明了mTOR信號通路參與了機體衰老，但具體機制現(xiàn)仍未明確。

4 小 結(jié)

mTOR是一種結(jié)構(gòu)與功能高度保守的蛋白質(zhì)，是能量代謝調(diào)控的中樞傳感器，在攝食調(diào)控、脂類代謝、蛋白質(zhì)合成等方面都起到了重要的作用。mTOR信號通路可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)許多基因的表達，若其調(diào)控機制失調(diào)將會引起機體紊亂。已有的研究報道發(fā)現(xiàn)，mTOR與代謝綜合征、癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，對mTOR生理功能的深入研究，將有助于疾病的治療和新藥的開發(fā)。目前，有關(guān)mTOR的研究主要集中在人類、小鼠上，而在其他哺乳動物上的研究還相對較少。鑒于mTOR強大的生理功能，如何通過mTOR信號通路來調(diào)節(jié)動物生產(chǎn)性能將是我們今后的一個研究重點。如mTOR在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成上發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，那么是否可通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路來提高動物飼料的蛋白質(zhì)利用率及減少動物體內(nèi)脂肪沉積。這些都是未來值得我們?nèi)パ芯康姆较?，可以預(yù)期mTOR在動物生產(chǎn)中將有廣泛的應(yīng)用前景。

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