牛奶微生物群落與奶牛乳腺健康和犢牛胃腸道發(fā)育的關(guān)系

汪 悅 王 炳 童津津 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛奶中的復(fù)雜微生物菌群近年來越來越受到人們的關(guān)注，而先進(jìn)的組學(xué)技術(shù)的發(fā)展能夠讓人類對牛奶微生物群有更加詳細(xì)的了解，進(jìn)而引發(fā)了大量的研究熱潮。從現(xiàn)有的研究中，我們已經(jīng)意識到，由于奶牛機(jī)體內(nèi)微生物的復(fù)雜性和互動性，使其擁有多種多樣的微生物群落，并且這些微生物群落在奶牛生物學(xué)中占有重要地位，對奶牛健康狀態(tài)有重要影響[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，奶牛胃腸道微生物群有著復(fù)雜而緊密的關(guān)聯(lián)[2]。而近年來，牛奶中的微生物群落也已逐漸從奶牛機(jī)體的各個(gè)解剖部位得以分離鑒定，從最明顯的部位，如皮膚和泌尿生殖道，到較為不明顯的部位，如呼吸道。并且還包括先前認(rèn)為絕對沒有微生物的區(qū)域，如胎盤[3]。早期研究認(rèn)為，乳腺和其中所含的乳汁也被認(rèn)為是無菌的，在牛奶中發(fā)現(xiàn)的微生物一直被認(rèn)為是外部污染的結(jié)果。然而最近，這一觀點(diǎn)受到了基于免疫培養(yǎng)技術(shù)與更為高精度的分子方法的質(zhì)疑——有研究提出了牛奶微生物的內(nèi)生途徑假說[4]。因此，本文旨在對牛奶微生物的來源、組成、研究手段以及牛奶微生物群對犢牛生長發(fā)育的重要影響等進(jìn)行綜述，為牛奶微生物的研究與奶牛乳腺健康和犢牛生長發(fā)育的關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 牛奶微生物群落來源

牛奶中的微生物一直被認(rèn)為是外部感染的結(jié)果，主要是奶牛所處環(huán)境中的微生物通過乳腺皮膚或口腔帶入機(jī)體內(nèi)[5]。而近來有研究證實(shí)了牛奶中微生物的內(nèi)生途徑，即奶牛機(jī)體內(nèi)的微生物具有互動性，一些生理部位的微生物完全有可能通過某些途徑進(jìn)入到乳腺進(jìn)而產(chǎn)生于牛奶中[6]。

1.1 外源致病菌入侵

外源致病菌入侵是奶牛乳腺炎癥誘發(fā)的主要因素之一。Mor等[7]研究發(fā)現(xiàn),牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)以及凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococcus)是造成隱性乳房炎的主要外源致病菌。引起乳房炎的致病菌，根據(jù)其傳播特點(diǎn)，大體可分為2類：一類是接觸傳染性病原微生物，它定植于乳腺并通過擠奶傳播，包括無乳鏈球菌、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和支原體(Mycoplasma)；另一類為環(huán)境性病原體，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、沙雷氏菌(Serratia)、變形桿菌(Proteus)、假單胞菌(Pseudomonas)等[8]。然而，細(xì)菌素以及牛奶中特定成分所釋放的抗微生物分子可能在抑制潛在病原體的爆發(fā)中起到一定的作用，從而防止乳房內(nèi)感染[9]。Quigley等[10]研究表明，奶牛微生物群體具有宿主依賴性，并指出其組成可能在確定它們是否會患有乳腺炎時(shí)起作用。

從對奶牛乳腺感染及微生物誘發(fā)乳腺炎的作用研究中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群可能是誘發(fā)乳腺炎的潛在微生物群[11]。有研究表明，人乳寡糖(HMO)具有調(diào)節(jié)腸道微生物群的能力，而牛奶中也存在與人乳中結(jié)構(gòu)類似的寡糖——牛乳寡糖(BMO)。因此，可以推測，BMO也可能影響奶牛乳腺的微生物群落[12]。有趣的是，BMO屬于牛奶中的特定分子成分，它能夠反映奶牛的血型特征，并受到遺傳因素的控制[13]。研究證實(shí)，葡萄球菌(Staphylococcus)是誘發(fā)奶牛乳腺炎的主要致病菌，并且它僅與BMO的特定類型結(jié)合。這將表明，乳腺炎的易感性不僅可以通過牛奶的微生物組成或暴露的特定病原體來判定，而且還可以通過奶牛的遺傳構(gòu)成和牛奶中存在的相應(yīng)BMO類型來判定[14]。

1.2 內(nèi)源性途徑假說

一直以來，人們都認(rèn)為在牛奶中發(fā)現(xiàn)的微生物是由外部環(huán)境，如乳腺皮膚或后代的口腔污染造成的。然而，最近的一些研究并不支持這樣的觀點(diǎn)，即牛奶中微生物的存在不僅僅是外部定植的結(jié)果。已有研究證明，牛奶中的微生物除了在細(xì)菌組成上不同之外，存在于同一宿主乳腺中的細(xì)菌與在皮膚中發(fā)現(xiàn)的同種細(xì)菌在基因型上有較大的差異。這說明，乳房皮膚和乳頭管不能被認(rèn)為是牛奶微生物群的唯一制造者[15]。除此之外，細(xì)菌如雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧的，這使得皮膚不太可能成為這類細(xì)菌傳播者。這些觀察結(jié)果提供了微生物內(nèi)生途徑的可能性[16]。

事實(shí)上，宿主微生物群落并不構(gòu)成獨(dú)立的環(huán)境，而是相互關(guān)聯(lián)且不斷互動交流的。因此，其他解剖學(xué)部位的微生物完全可能以某種方式進(jìn)入乳腺[17]。有研究基于一些微生物離開腸腔，穿過腸系膜淋巴結(jié)并到達(dá)乳腺的能力，描述了“腸道—乳腺通路”的存在(圖1)[18]。牛奶微生物群的內(nèi)生起源假說已經(jīng)通過在小鼠中進(jìn)行的不同研究得到證實(shí)[19]。雖然微生物跨越腸系膜屏障并到達(dá)其他身體部位的機(jī)制尚未完全清楚，但研究表明這些可能與免疫細(xì)胞，特別是樹突狀細(xì)胞(DC)的結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)[20]。事實(shí)上，DC能夠通過打開腸細(xì)胞之間的緊密連接來對腸內(nèi)容物進(jìn)行采集，并通過其樹突到達(dá)內(nèi)腔，而不損害上皮屏障完整性?；谶@種采集能力，這些細(xì)胞可以攜帶活的共生細(xì)菌，并將其攜帶到腸系膜淋巴結(jié)。一旦細(xì)菌保持存活多達(dá)數(shù)天，并能通過黏膜相關(guān)淋巴系統(tǒng)，就有機(jī)會擴(kuò)散到其他遠(yuǎn)處的黏膜表面，包括乳腺。事實(shí)上，在泌乳期間，腸道相關(guān)淋巴組織的細(xì)胞能夠通過淋巴管和外周血循環(huán)傳遞到乳房[21]。Yozwiak等[22]表明，在哺乳期間，人類外周血單核細(xì)胞和母乳細(xì)胞含有細(xì)菌及其遺傳物質(zhì)。此外，已有報(bào)道在人類受試者的血液中存在活的乳酸菌，這進(jìn)一步表明了一些腸道微生物群的成員可能具有相當(dāng)強(qiáng)的能力以可行形式前往其宿主的遠(yuǎn)端腸外部位[23]。研究還發(fā)現(xiàn)，在妊娠期和哺乳期的小鼠腸中細(xì)菌易位頻率增加，并且當(dāng)細(xì)菌存在于哺乳期乳腺組織中時(shí)DC成為其載體[23]。

除了運(yùn)輸腸道微生物群落的可行性之外，這種機(jī)制還具有引導(dǎo)后代免疫系統(tǒng)識別與啟動共生微生物相關(guān)分子模式的作用，以便對它們產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)[24]。這種遷移可以選擇性地發(fā)生，也就是說，某些細(xì)菌可被免疫細(xì)胞識別并被轉(zhuǎn)運(yùn)到牛奶中，而其他可能不會被識別，或者免疫細(xì)胞可能會攝取所有的微生物，但是只有那些能夠逃脫死亡的細(xì)胞才能被運(yùn)送到乳腺[24-25]。Garcia-Garcerà等[26]報(bào)道了有關(guān)奶牛腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)移到乳腺中的研究結(jié)果，支持了反芻動物內(nèi)源性“腸道—乳腺通路”的存在。該研究通過焦磷酸測序條碼標(biāo)記的16S rDNA擴(kuò)增子研究了健康泌乳牛的糞便、牛奶和血液白細(xì)胞的微生物組成和多樣性，結(jié)果表明，在來自同一頭奶牛的3種樣品中都共同存在紅球菌屬(Rhodococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)；為了避免外部污染并防止乳頭管的拉伸或損壞，該試驗(yàn)使用導(dǎo)管通過重力將牛奶收集到無菌容器中。這些細(xì)菌在3種環(huán)境中共同存在的這一事實(shí)，有力地支持了乳腺與腸道之間微生物成分通過白細(xì)胞循環(huán)相互遷移的這一機(jī)制[27]。然而，負(fù)責(zé)將微生物群從腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)到牛奶中的細(xì)胞類型仍有待確定。需要進(jìn)一步研究來剖析反芻動物腸道微生物運(yùn)輸?shù)饺橄偌捌溲h(huán)的機(jī)制，這可能對反芻動物及其后代乃至人類消費(fèi)者的健康產(chǎn)生重要影響。

圖1 反芻動物中腸道-乳腺通路的假說

2 牛奶微生物群落組成

牛奶中含有復(fù)雜多樣的微生物群落。研究表明，每毫升牛奶中就能達(dá)到幾個(gè)菌落單位的豐度[28]。在健康的奶牛和乳腺所分泌的乳汁中也存在大量微生物群落[29]。近年來，牛奶微生物群已經(jīng)成為獨(dú)立的研究課題，一方面旨在了解其在奶牛及其后代的生理與健康中的作用；另一方面，大多數(shù)關(guān)于奶牛微生物群的研究已經(jīng)開始重點(diǎn)關(guān)注當(dāng)牛奶直接消費(fèi)或加工為乳制品時(shí)，微生物菌群如何變化(表1)[30]。

Masoud等[31]研究了健康奶牛的牛奶微生物組成成分，發(fā)現(xiàn)牛奶中最豐富的屬是鏈球菌屬(Streptococcus)和葡萄球菌屬。而其他研究顯示乳酸菌數(shù)量較多，其次是鏈球菌和葡萄球菌[32]。Montel等[33]在牛奶的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了更高水平的細(xì)菌序列，分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。同一研究表明，健康牛奶的核心微生物組成包括葡萄球菌和鏈球菌，而它們在健康母牛之間觀察到高度的個(gè)體間變異性。另一項(xiàng)牛奶微生物突變體研究顯示，易發(fā)生菌種突變的主要為變形菌門(65%)、厚壁菌門(34%)、假單胞菌屬(61.1%)和葡萄球菌屬(33.4%)[34]。而所有這些差異都會與地理、遺傳或飲食等因素相關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步研究。Valles-Colomer等[35]使用細(xì)菌16S rDNA基因的焦磷酸測序?qū)碜?0頭不同奶牛的牛奶樣進(jìn)行細(xì)菌DNA多樣性檢測。在試驗(yàn)中，也對從同一頭奶牛的健康乳房獲得的牛奶樣品的微生物群體進(jìn)行了比較。研究結(jié)果顯示，不同健康牛奶樣品的微生物種類之間存在顯著差異，較豐富的種屬是：羅氏假單胞菌(Pseudomonassyringa)、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonasmaltophilia)、根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、棒狀桿菌屬、嗜糖假單胞菌屬(Pelomona)和葡萄球菌。而在單一奶牛健康乳房中獲取的牛奶樣品中發(fā)現(xiàn)，假單胞菌和叢毛單胞菌(Pseudomonassp.)的豐度顯著高于乳酸桿菌[35]。在最近發(fā)表的一項(xiàng)研究中，Tveit等[36]詳細(xì)描述了來自一系列體細(xì)胞數(shù)(SCC)較低且乳房未受感染的牛奶樣品的微生物多樣性。從健康乳區(qū)獲得的所有樣品中都存在非分類的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和丙酸桿菌，這些菌可被認(rèn)為是健康牛奶的核心微生物群。在大多數(shù)具有極低SCC的牛奶樣品中，其他微生物種屬也同樣被普遍發(fā)現(xiàn)，包括擬桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、厭氧球菌屬(Anaerobicbacteria)、乳桿菌屬、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、科莫他屬(Komogenus)、福氏桿菌屬(Freundellaspp.)和腸球菌屬。某些細(xì)菌屬，如乳桿菌屬和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，與奶牛乳房健康有關(guān)。

表1 健康牛奶微生物群落組成

3 牛奶微生物群落檢測方法

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類與鑒定中，主要依據(jù)的是形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)、生態(tài)學(xué)特征以及血清學(xué)反應(yīng)等，如平板菌落計(jì)數(shù)法以及革蘭氏染色法等。但這些傳統(tǒng)方法都存在檢測周期長、操作繁瑣等缺點(diǎn)，并且對十分相似的細(xì)菌難以進(jìn)一步區(qū)分[37]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，整個(gè)微生物基因組和宏基因組的表征可能是基于16S rDNA的靶序列或由宏基因組的廣泛測序來完成的。前一種方法依賴于16S rDNA基因片段(16S基因組學(xué))的PCR擴(kuò)增與測序的組合，因此，它可以表征微生物群落中的細(xì)菌組分[38]。

在16S rDNA測序研究中，設(shè)計(jì)了1對所謂的“通用”引物以結(jié)合保守區(qū)域并擴(kuò)增捕獲分類信息的可變區(qū)域[39]。對擴(kuò)增的16S rDNA片段庫進(jìn)行測序，可以將每個(gè)讀數(shù)最準(zhǔn)確地分配給其特定的分類單元。然后，可以估計(jì)每個(gè)分類群的相對數(shù)量[40]。Hettich等[41]利用16S rDNA測序方法研究20個(gè)來自低SCC的健康牛奶樣品，發(fā)現(xiàn)無性系細(xì)菌序列幾乎不存在，雖然檢測到卟啉單胞菌屬序列，但與其在乳腺炎牛奶樣品中的檢測率相比，出現(xiàn)率較低。因此，推測某些厭氧菌可能只作為機(jī)會性病原體。然而，基于擴(kuò)增子的宏基因組學(xué)受到幾個(gè)限制，包括由于PCR偏差導(dǎo)致的多樣性喪失和多樣性估計(jì)的變異性等[42]。

鳥槍法宏基因組學(xué)通過擴(kuò)增特異性靶位點(diǎn)，提取整個(gè)宏基因組DNA，將其還原成片段并進(jìn)行測序。這使得在整個(gè)菌落的所有DNA基因組中產(chǎn)生了能夠與基因組位置相對齊的大量基因組序列[43]。Muth等[44]通過鳥槍法宏基因組學(xué)技術(shù)對雜交奶牛的牛奶微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。分析產(chǎn)生了63個(gè)基因，11個(gè)基因座和78萬個(gè)堿基對(Mb)，并存在于在798 56 114個(gè)序列中，其研究結(jié)果揭示了腸桿菌成員在牛奶微生物中所占的主導(dǎo)地位，其次是假單胞菌屬(Pseudomonadales)、芽孢桿菌(Bacillales)和乳桿菌(Lactobacillales)。同時(shí)，代謝分析表明氟喹諾酮類、甲氧西林、銅、鈷、鋅、鎘等作為抗生素進(jìn)入奶牛機(jī)體后，其體內(nèi)表現(xiàn)出多種具有抗藥性潛力的微生物體的序列，如金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌以及表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。

4 牛奶微生物數(shù)量和組成與奶牛乳腺健康

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19301—2010，當(dāng)鮮乳中的細(xì)菌總數(shù)達(dá)到2×106CFU/g(或CFU/mL)時(shí)，鮮乳的質(zhì)量安全就會受到影響，超過這個(gè)限值的鮮奶樣品是不允許用作原料乳應(yīng)用在乳制品的生產(chǎn)加工中的。同時(shí)，生鮮乳中超高的細(xì)菌總量也標(biāo)志著奶牛乳腺內(nèi)部定植著大量微生物，這其中就有可能存在著威脅乳腺健康的病原微生物[45]。除數(shù)量因素外，牛奶中微生物群的組成也是影響奶牛乳腺健康的重要因素。外源致病菌(如金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌等)入侵奶牛乳腺后，擾亂奶牛正常微生物群發(fā)育環(huán)境，引發(fā)乳腺炎癥，容易導(dǎo)致牛奶SCC升高，產(chǎn)奶量下降等一系列不利影響；相反，一些益生菌(如乳酸菌、雙歧桿菌等)在奶牛機(jī)體內(nèi)的大量定植能夠?qū)δ膛５娜橄俳】怠⑴Ｄ藤|(zhì)量等帶來有益影響。

劉艷艷[46]利用熒光定量PCR方法對100份鮮牛奶樣品微生物總數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，有37份生鮮牛奶樣品的熒光定量PCR循環(huán)閾值(CT)小于29.81，結(jié)果提示為危險(xiǎn)樣品，即樣品中的細(xì)菌總量已超過2×106CFU/mL，隨后對生產(chǎn)這37份生鮮牛奶樣品的奶牛進(jìn)行乳房健康檢測，發(fā)現(xiàn)其中16頭奶?；加信R床乳腺炎癥，而其余的21頭奶牛，通過CMT(加州乳房炎檢測法)檢測，觀察到不同乳區(qū)有隱形乳房炎的癥狀表現(xiàn)。Hettich等[47]在研究不同微生物對奶牛乳腺健康的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，將從牛奶中分離出的乳酸乳桿菌亞種接種到奶牛機(jī)體內(nèi)能促使其血液和乳中的免疫球蛋白同種型水平和記憶細(xì)胞增殖。Tanca等[48]研究表明，使用乳酸菌與雙歧桿菌刺激奶牛乳腺后淋巴細(xì)胞在體外不與金黃色葡萄球菌表面抗原反應(yīng)。這說明，益生菌可以成為在干奶期防止奶牛乳腺炎的天然有效的抗生素替代物，并且作為免疫調(diào)節(jié)劑刺激局部和系統(tǒng)的防線。Winter等[49]利用宏基因組學(xué)技術(shù)在患有亞臨床乳腺炎的奶牛牛奶中檢測到大約56種具有不同豐度的不同物種，并發(fā)現(xiàn)大腸桿菌是其中最主要的，其次是銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、門氏假單胞菌(Pseudomonaspseudomonas)以及蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)；有趣的是，該試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了所研究的牛奶樣品中還存在葡萄球菌的噬菌體。Tang[50]研究了飼糧添加富硒益生菌(selenium-enriched probiotics,Se-Pro)對奶牛乳房炎和乳汁SCC的影響。對照組喂基礎(chǔ)飼糧，Se-Pro組添加108.2 g/(頭·d)Se-Pro，結(jié)果表明，與對照組相比，Se-Pro組的奶牛其血液硒含量顯著升高，并且乳房炎乳區(qū)陽性率下降了35%。奶牛血液中硒含量增加，有助于減少奶牛SCC、降低乳房炎的發(fā)病率,增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞的功能。綜上，牛奶中微生物數(shù)量與組成不僅是反映奶牛乳腺健康的關(guān)鍵指標(biāo)，一些益生菌還有助于維持奶牛的乳腺健康。

5 牛奶微生物對犢牛胃腸道微生物群落定植的影響

牛奶中含有免疫細(xì)胞和各種各樣的活性分子，包括糖、核苷酸、脂質(zhì)、免疫球蛋白、抗微生物蛋白、細(xì)胞因子和其他免疫調(diào)節(jié)因子[51]，而母乳對其后代的生長發(fā)育會產(chǎn)生較大的影響，其中之一是將微生物傳播給后代的正處于發(fā)育過程中的胃腸道[52]。

5.1 母牛分娩

Morrow等[53]研究發(fā)現(xiàn)奶牛的分娩方式對牛奶中微生物也會有很重要的影響，試驗(yàn)分別選取陰道分娩和剖宮分娩的奶牛牛奶，并運(yùn)用16S rDNA基因擴(kuò)增子的焦磷酸測序的方法對2種牛奶樣品中微生物多樣性進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與剖宮分娩的牛奶樣相比，采用陰道分娩方式的奶牛其牛奶樣品中微生物多樣性更高；而與陰道分娩方式的牛奶樣品相比，采用剖宮分娩方式的奶牛其牛奶樣中葡萄球菌、雙歧桿菌相對豐度較高，鏈球菌含量較低。此外，分娩方式還會影響新生犢牛腸道微生物群的組成[54]。與陰道分娩的新生犢牛相比，由剖宮分娩的新生犢牛其腸道微生物群與其母代的相似性顯著降低，并且微生物多樣性也同樣較低[54-55]。

分娩哺乳動物的微生物群落定植為其初分娩后代提供引導(dǎo)免疫成熟的重要刺激物，后代微生物群落的形成受到出生前和出生后因素的影響，包括遺傳和環(huán)境變量(孕齡、分娩方式、護(hù)理和營養(yǎng))[56]。根據(jù)以上的研究數(shù)據(jù)及觀察結(jié)果，我們假設(shè)圍產(chǎn)期因素能夠通過母乳的微生物轉(zhuǎn)移影響新生犢牛健康，那么在圍產(chǎn)期期間對奶牛進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)移可以為奶牛調(diào)節(jié)微生物的飼糧策略提供新的目標(biāo)，以減少非傳染性疾病的發(fā)生[57]。此外，這些研究數(shù)據(jù)可能有助于提示牛場適當(dāng)改善繁殖方式，這對奶牛健康有重大影響。

牛奶中微生物對其他健康因素的影響，包括乳桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬，可影響?zhàn)さ鞍桩a(chǎn)生，增強(qiáng)黏膜通透性，維持T細(xì)胞平衡以及減輕黏膜炎癥[58]。對無菌小鼠進(jìn)行的研究表明，免疫系統(tǒng)功能的完全發(fā)展需要微生物的早期定植(各種細(xì)菌經(jīng)常從不同環(huán)境進(jìn)入到奶牛機(jī)體，并能在一定部位定居和不斷生長、繁殖后代，這種現(xiàn)象通常稱為“細(xì)菌定植”)[59]。牛奶中的微生物對奶牛免疫系統(tǒng)對抗病原體和共生細(xì)菌等功能至關(guān)重要。而后代的腸道微生物及其免疫力的演變，是由母代乳腺通道產(chǎn)生的乳汁微生物的運(yùn)動、定植造成，并通過母代的乳腺與哺乳犢牛的口腔微生物群的相互聯(lián)系，進(jìn)而在哺乳期間同步發(fā)育和進(jìn)化[60]。

Abreu等[61]研究表明，牛奶微生物群體會沿著哺乳期的進(jìn)行而發(fā)生一系列變化。這進(jìn)一步提示了牛奶微生物群在形成后代腸道微生物群中的作用。事實(shí)上，奶牛體內(nèi)藏有另外一個(gè)非常復(fù)雜的微生物群落，即瘤胃微生物群，它起到了消化植物并將其他不消化物轉(zhuǎn)化為有用的化合物的關(guān)鍵作用。瘤胃中的微生物定植幾乎隨時(shí)發(fā)生，近來有關(guān)于瘤胃微生物群落的研究已經(jīng)證明，犢牛體內(nèi)存在成熟的微生物功能。通過焦磷酸測序法，已經(jīng)證明纖維素分解菌早在新生犢牛出生后第1天就已經(jīng)存在于瘤胃中，并且在第3天有所增加。Vankerckhoven等[62]證明了瘤胃中某些關(guān)鍵細(xì)菌從犢牛降生的第1天開始就已經(jīng)存在，而當(dāng)時(shí)新生犢牛只被供給初乳，也就是在攝入飼料之前。據(jù)此推斷，新生犢牛胃腸道內(nèi)的這些初期微生物群落可能是由母親通過皮膚、產(chǎn)道、乳汁或唾液傳播的。

5.2 犢牛飼喂

目前的牛場管理方式對奶牛及其后代微生物群落之間的互動產(chǎn)生了一些障礙。Jost等[63]在調(diào)查試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，149只新生犢牛在出生后被灌服初乳、混合初乳或初乳替代品。因此，母親與后代間的微生物傳播被破壞，而這種微生物傳播在后代的腸道微生物群的演變中即將發(fā)揮的相關(guān)功能也可能喪失。牛場對新生犢牛的管理中，應(yīng)注意飼喂的初乳和牛奶的質(zhì)量，應(yīng)考慮到健康、營養(yǎng)均衡且具有微生物的母乳對后代免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。事實(shí)上，當(dāng)犢牛處于脅迫條件下時(shí)，例如在密集飼養(yǎng)系統(tǒng)中，很可能導(dǎo)致腸道微生物群失衡，例如乳桿菌和雙歧桿菌的減少以及病原微生物的增加[63]。Maldonado等[64]研究發(fā)現(xiàn)，將全脂牛奶喂給犢牛，在其腸道中發(fā)現(xiàn)了比例增加的乳酸菌與大腸桿菌，這進(jìn)一步證明了牛奶對犢牛腸道微生物群體的復(fù)雜作用。

在出生后6 h內(nèi)，應(yīng)為新生犢牛提供干凈、高質(zhì)量的初乳。然而，許多農(nóng)場使用不可食用的廢奶，用于出生后犢牛喂養(yǎng)。廢奶是不能出售供人食用的牛奶，通常來自具有高SCC的奶牛和用抗生素治療的奶牛[65]。廢奶喂養(yǎng)犢牛是一種普遍現(xiàn)象，Collado等[66]在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，2002年，美國有87.2%的奶牛場都有將廢奶飼喂給犢牛的現(xiàn)象。大多數(shù)牛場認(rèn)為廢奶的使用可以節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，并且也是安全的牛奶替代品，特別是在巴氏殺菌后。但事實(shí)上，廢牛奶中的抗生素殘留以及潛在的有害病原體污染物都會對犢牛健康的腸道微生物菌落造成很大程度上的破壞。Akyol等[67]評估了飼喂廢奶對犢牛糞便微生物菌群多樣性的影響，結(jié)果表明，隨著年齡增長，不同種類的微生物多樣性在犢牛糞便中逐漸增多，如沙門氏菌和梅毒螺旋體(Treponemapallidum)，而腸胃中重要的有益菌嗜酸桿菌(Eosinophil)含量減少。

然而，廢奶更危險(xiǎn)的因素是抗生素殘留物以及可用于轉(zhuǎn)移到病原體的抗生素抗性基因(ARG)池中的潛在富集物的存在[68]。此外，連續(xù)的抗生素壓力可能增加ARG轉(zhuǎn)移的機(jī)會。Liu等[69]采用抗生素殘留的奶樣飼喂新生小鼠，灌服24 h后通過口服給藥與靜脈給藥方式將氨芐青霉素和四環(huán)素注入小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口服給藥導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因拷貝數(shù)增加4倍，而靜脈內(nèi)給藥導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因拷貝數(shù)增加2倍。這也可能是由于靜脈內(nèi)給藥的氨芐青霉素通過尿液清除并且不與腸道微生物群相互作用。Baldassarre等[70]評估了抗生素殘留牛奶對犢牛的糞便微生物群的影響，使用Illumina MiSeq對6周齡犢牛的糞便進(jìn)行微生物16S rDNA基因的測序，結(jié)果表明，牛奶中藥物殘留的存在會影響糞便中微生物群落的組成，提示即使微量的抗生素也可能對微生物之間的競爭產(chǎn)生選擇性影響，即抗生素殘留物可以對不具有或含量非常低的ARG的未成熟微生物群發(fā)揮選擇性壓力，使得外源微生物進(jìn)入犢牛機(jī)體進(jìn)行定植導(dǎo)致突變，逐漸演變成犢牛常見微生物群的特征，進(jìn)而破壞犢牛胃腸道內(nèi)正常微生物群的發(fā)育及功能。

還有一種能干擾牛奶微生物群落平衡的行為是通過在干奶或哺乳期間對奶牛進(jìn)行乳房內(nèi)抗生素治療[71]。這種做法被認(rèn)為比在干奶期預(yù)防感染而進(jìn)行的選擇性治療更有效。乳腺內(nèi)抗生素治療是輕度和中度乳腺炎病例的最常見治療方法，通常是在不知道引起感染的細(xì)菌類型的情況下使用[72]。然而，由于擔(dān)心抗生素耐藥性的選擇，這個(gè)方法在北歐國家?guī)资陙硪恢睕]有實(shí)施，并且在荷蘭也越來越多地被放棄。這種做法對牛奶微生物群和對ARG的潛在選擇的影響值得進(jìn)一步研究。

6 小結(jié)與展望

分子生物學(xué)技術(shù)的巨大進(jìn)步使得人類在微生物群落的研究中取得了許多突破，進(jìn)而使我們意識到棲息于生物體內(nèi)的微生物多樣且復(fù)雜，同時(shí)這些微生物與其宿主之間還存在著相互的關(guān)聯(lián)作用。牛奶中的微生物群落與牛奶SCC、生物標(biāo)記物(表達(dá)蛋白、血液因子等)一樣是能夠反映奶牛及后代生理健康與乳品質(zhì)量的重要生物指標(biāo)。奶?！澳c道—乳腺通路”的存在，證明母體微生物群落影響犢牛胃腸道的發(fā)育及健康的重要性，而廢奶的使用又極大程度地破壞了犢牛胃腸道的微生物群落結(jié)構(gòu)以及功能。這些問題可能對奶牛健康以及乳業(yè)的發(fā)展造成的重大經(jīng)濟(jì)影響。因此，對牛奶微生物群的進(jìn)一步深入研究有助于對奶牛乳腺生理代謝以及乳品質(zhì)量安全產(chǎn)生有更全面的認(rèn)識，如亞臨床乳腺炎和隱性乳腺炎的發(fā)病機(jī)制、牛場管理對奶牛乳腺及后代健康的影響、腸道作為乳腺炎病原微生物儲庫的作用以及如何控制抗生素耐藥性等。

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