奶牛圍產(chǎn)期典型代謝特征及其營養(yǎng)調(diào)控的技術(shù)途徑

孫博非 余 超 曹陽春 蔡傳江 李生祥 姚軍虎*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊陵 712100；2.陜西省商洛市畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，商洛 726000)

奶牛圍產(chǎn)期包括產(chǎn)前3周和產(chǎn)后3周，此階段奶牛營養(yǎng)生理和代謝模式較為特殊，神經(jīng)內(nèi)分泌改變[1]，營養(yǎng)素攝入不足且利用率低，主要營養(yǎng)素(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、鈣、磷等)的體貯動員顯著增強(qiáng)[2-3]，各器官代謝和免疫功能下降，面臨的應(yīng)激因素增加(分娩、飼糧轉(zhuǎn)換、代謝應(yīng)激、氧化應(yīng)激和環(huán)境應(yīng)激等)[4]，奶牛防御有害微生物侵襲的屏障功能減弱[4-5]，極易遭受各種代謝性疾病(脂肪肝、酮病、乳熱病等)和微生物疾病(細(xì)菌性乳房炎、細(xì)菌性子宮炎等)的困擾，給奶業(yè)造成巨大損失[6-8]。因此，研究奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)過程的生理生化機(jī)理，制訂有效的營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)方案和飼養(yǎng)管理規(guī)程，對保障奶牛健康和泌乳性能的持續(xù)高效發(fā)揮，促進(jìn)奶業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 典型代謝：理論基礎(chǔ)

解析關(guān)鍵營養(yǎng)素攝入、消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、轉(zhuǎn)化、利用和排泄的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，闡明主要代謝應(yīng)激和疾病的發(fā)生機(jī)理，是調(diào)控奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)高效利用和健康的理論基礎(chǔ)。以脂肪肝和酮病為例，能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)導(dǎo)致體脂動員，大量未酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)進(jìn)入肝臟代謝供能，主要有3條代謝通路[9-11]：1)完全氧化，生成CO2和H2O，并釋放大量ATP，高效供能；2)不完全氧化生成酮體，主要是β-羥基丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)，供能效率低，且酮體積累極易誘發(fā)奶牛酮??；3)經(jīng)酯化反應(yīng)生成甘油三酯(triglyceride,TG)，若TG不能以極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)形式轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，則導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪浸潤或脂肪肝的發(fā)生[12-16]。因此，為降低脂肪肝和酮病發(fā)生的風(fēng)險，可通過下列途徑加以調(diào)控：1)促進(jìn)NEFA的完全氧化，可通過增加肝臟肉毒堿含量，促進(jìn)其限速酶肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)的表達(dá)來實現(xiàn)[10-11]；2)降低BHBA合成，可通過調(diào)控其關(guān)鍵酶β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A(β-hydroxy-β-methylglutaryl-CoA,HMG-CoA)和HMG-CoA還原酶基因的表達(dá)和分泌來實現(xiàn)[17]；3)促進(jìn)VLDL的合成，將過量TG轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟[18-22]。

添加一些營養(yǎng)調(diào)控劑(如膽堿、丙三醇和維生素E等)，可增強(qiáng)奶牛圍產(chǎn)期抗氧化和免疫功能，并降低代謝性疾病的發(fā)生，提高產(chǎn)后泌乳和繁殖性能[1,5,23-26]。Lean等[27]系統(tǒng)綜述了奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)需要及其調(diào)控的研究進(jìn)展和技術(shù)原理，并提出了奶牛圍產(chǎn)期代謝性疾病發(fā)病率的限值和調(diào)控目標(biāo)(表1)，可用于指導(dǎo)牧場奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)和技術(shù)管理。

表1 奶牛圍產(chǎn)期主要代謝性疾病發(fā)生率的限值和調(diào)控目標(biāo)1)

1)除特殊說明外，百分比是指產(chǎn)后14 d內(nèi)發(fā)病奶牛占總奶牛數(shù)的百分比。Except for special instructions, the percentage values are calculated as: (the number of cows with metabolic diseases and other unhealthy problems within 14 days after calving/the total number of cows)×100.

2)對于年齡較大(>8歲)的奶牛，其警戒水平不變，調(diào)控目標(biāo)為2%。For older cows (>8 years old), the alarm level is the same, while the regulatory target is 2%.

3)血液BHBA濃度采用酶法測定，亞臨床型酮病判定標(biāo)準(zhǔn)為血液BHBA濃度>1 mmol/L。Blood BHBA concentration is tested using the enzymatic assay, and subclinical ketosis is declared if blood BHBA concentration>1 mmol/L.

4)分娩后30 d內(nèi)每100頭奶牛中發(fā)病奶牛的數(shù)量。The number of cows with clinical mastitis within 30 days after calving in each 100 cows.

2 技術(shù)思路

奶牛從停乳到泌乳經(jīng)歷復(fù)雜的生理生化適應(yīng)和代謝調(diào)控機(jī)制，此過渡期是神經(jīng)內(nèi)分泌、機(jī)體代謝信號、消化道微生物及其代謝產(chǎn)物、動物內(nèi)部和外部應(yīng)激及各類病原共同調(diào)控的結(jié)果[6,28-30]。關(guān)于圍產(chǎn)期奶牛群體監(jiān)測、營養(yǎng)需要、代謝調(diào)控和健康干預(yù)等已有一些經(jīng)典綜述[23,27,31-34]。結(jié)合本課題組歷年研究基礎(chǔ)，以下將圍繞奶牛圍產(chǎn)期能量代謝，兼顧蛋白質(zhì)代謝，簡述奶牛圍產(chǎn)期能量和蛋白質(zhì)代謝調(diào)控的技術(shù)思路。

本課題組以提高飼糧能量的總體利用率為核心，以提高機(jī)體代謝葡萄糖(metabolizable glucose，MG)供應(yīng)為主要技術(shù)思路，主要研究內(nèi)容(圖1)包括：1)瘤胃健康與高效發(fā)酵的生理機(jī)制和綜合調(diào)控；2)小腸營養(yǎng)素(主要是淀粉)高效利用的科學(xué)基礎(chǔ)及調(diào)控技術(shù)；3)肝臟能量代謝和高效轉(zhuǎn)化的通路解析及營養(yǎng)調(diào)控；4)奶牛飼料數(shù)據(jù)庫建設(shè)、營養(yǎng)評估技術(shù)體系和相關(guān)軟件的研發(fā)。為平衡瘤胃和小腸碳水化合物的合理分配和能量的高效轉(zhuǎn)化，本課題組整合系列研究成果，提出反芻動物碳水化合物平衡指數(shù)(carbohydrate balance index,CBI)的概念，計算公式為：CBI=peNDF/RDS，其中peNDF表示物理有效中性洗滌纖維(physically effective neutral detergent fiber)，目前建議采用peNDF8.0，RDS表示瘤胃可降解淀粉(rumen degradable starch)。關(guān)于不同長度peNDF在CBI和奶牛生理中的貢獻(xiàn)度，仍需通過研究進(jìn)行量化[35-37]。

CBI：碳水化合物平衡指數(shù) carbohydrate balance index；NDF：中性洗滌纖維 neutral detergent fiber；NFC：非纖維性碳水化合物 non-fibrous carbohydrate；G：葡萄糖 glucose；MG：代謝葡萄糖 metabolizable glucose；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mammalian target of rapamycin；peNDF：物理有效中性洗滌纖維physically effective neutral detergent fiber；RDNFC：瘤胃可降解非纖維性碳水化合物 rumen degradable non-fibrous carbohydrate；RES：過瘤胃淀粉 rumen escape starch；RDS：瘤胃可降解淀粉 rumen degradable starch；AA：氨基酸 amino acids。

圖1反芻動物碳水化合物營養(yǎng)及能量代謝調(diào)控的研究網(wǎng)絡(luò)

Fig.1 A research network of carbohydrate nutrition and regulation of energy metabolism in ruminants[37]

2.1 調(diào)控瘤胃微生態(tài)，促進(jìn)瘤胃養(yǎng)分高效轉(zhuǎn)化和利用

瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)對奶牛機(jī)體能量、蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)素的供應(yīng)至關(guān)重要，乙酸是乳脂合成的重要底物和調(diào)控因子；丙酸是奶牛肝臟糖異生的主要底物，而葡萄糖不僅是奶牛生命活動的主要能量來源，還是乳糖合成的前體物質(zhì)；微生物蛋白(MCP)是小腸蛋白質(zhì)的重要組成部分，與過瘤胃蛋白質(zhì)(rumen undegraded protein，RUP)和內(nèi)源蛋白質(zhì)(endogenous crude protein,ECP)共同構(gòu)成奶牛機(jī)體代謝蛋白質(zhì)(metabolizable protein，MP)來源。奶牛圍產(chǎn)期瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生變化，瘤胃功能有所下降。Pitta等[38]比較研究了初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)奶牛圍產(chǎn)期瘤胃微生物組的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在所有菌群中，擬桿菌屬(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的豐度最高，奶牛分娩前后Bacteroidetes與Firmicutes的比例由6∶1增加到12∶1，這可能與奶牛機(jī)體代謝生理和飼糧轉(zhuǎn)換等有關(guān)。隨泌乳啟動，奶牛由干奶飼糧(高粗飼糧)轉(zhuǎn)入泌乳飼糧(高精飼糧)，瘤胃牛鏈球菌(Streptococcusbovis)和乳酸桿菌(Lactobacillus)等乳酸生成菌的數(shù)量顯著增加，而反芻獸新月形單胞菌(Selenomonasruminantium)和埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)的數(shù)量則顯著減少[39]，這可能導(dǎo)致：1)丙酸產(chǎn)量減少，肝臟糖異生底物不足，大量生糖氨基酸用于糖異生，造成氨基酸“浪費(fèi)”，加劇能量和蛋白質(zhì)的負(fù)平衡；2)乳酸生成量增加，降低瘤胃內(nèi)pH，誘發(fā)酸中毒，損傷瘤胃上皮，并降低MCP合成量；3)瘤胃能量和蛋白質(zhì)利用轉(zhuǎn)化和輸出效率下降，進(jìn)而刺激機(jī)體脂肪和蛋白質(zhì)動員，加劇肝臟代謝負(fù)擔(dān)，并增加酮病和脂肪肝等疾病的發(fā)生風(fēng)險；4)乳腺泌乳的能量和底物不足，降低奶牛產(chǎn)后泌乳性能。因此，保障奶牛圍產(chǎn)期(尤其是圍產(chǎn)后期)瘤胃健康和能量高效產(chǎn)出，對維持奶牛機(jī)體健康和產(chǎn)后泌乳性能具有重要意義。

實現(xiàn)瘤胃和小腸碳水化合物營養(yǎng)的最適分配，在保障瘤胃健康的前提下，提高瘤胃養(yǎng)分高效轉(zhuǎn)化和利用效率，是奶牛圍產(chǎn)期瘤胃代謝調(diào)控的重要技術(shù)思路，CBI體系為實現(xiàn)這一目標(biāo)提供了技術(shù)參考。關(guān)于CBI的研究進(jìn)展和實踐應(yīng)用，可參考本課題組的部分研究結(jié)果[36-37,40-46]。瘤胃內(nèi)環(huán)境和營養(yǎng)代謝的可調(diào)控性已毋庸置疑，且相關(guān)調(diào)控措施較多(圖1)。與其他生理階段相比，奶牛圍產(chǎn)期瘤胃代謝調(diào)控的研究明顯偏少。王曉旭[47]利用體外復(fù)合培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)+產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)+伯頓畢赤酵母(Burtonpichiapastoris)這一組合利用乳酸生成丙酸的能力最強(qiáng)，并可促進(jìn)Selenomonasruminantium和Megasphaeraelsdenii生成丙酸；采用復(fù)合微生態(tài)制劑分別飼喂圍產(chǎn)期健康和酮病奶牛后發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系，提高瘤胃短鏈脂肪酸(SCFA)和血液葡萄糖濃度，降低血液BHBA濃度，提高血液葡萄糖濃度，且對奶牛無負(fù)面影響。

2.2 增強(qiáng)小腸消化和吸收功能，提高外源葡萄糖和MP供應(yīng)量

進(jìn)入小腸的營養(yǎng)物質(zhì)，在一系列消化酶的作用下降解為小分子物質(zhì)，通過自由擴(kuò)散或相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的協(xié)助被吸收，經(jīng)血液循環(huán)和代謝轉(zhuǎn)化被機(jī)體各組織利用。胰腺可分泌多種消化酶，如α-淀粉酶、胰蛋白酶和胰脂肪酶，在小腸多種營養(yǎng)物質(zhì)的消化過程中發(fā)揮重要作用。奶牛飼糧淀粉在小腸消化吸收的供能效率顯著高于瘤胃，但過瘤胃淀粉(rumen escape starch,RES)的小腸消化率不超過70%，其限制性因素之一是胰腺α-淀粉酶分泌不足[48-51]。

圍繞此關(guān)鍵科學(xué)問題，本課題組以奶山羊和青年奶牛為試驗對象，結(jié)合胰腺組織孵育和原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，系統(tǒng)研究了亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等功能性氨基酸對反芻動物胰腺消化酶表達(dá)和分泌的影響及信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[35,37]。于紅霞[49]研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸灌注3或6 g Leu可提高奶山羊胰腺α-淀粉酶分泌量，且不依賴于胰島素；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Phe亦可調(diào)控奶山羊胰腺外分泌功能，增強(qiáng)小腸消化酶活性，進(jìn)而提高淀粉和其他營養(yǎng)素的消化率，Leu和Phe主要通過激素和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路調(diào)控奶山羊胰腺蛋白質(zhì)合成[51-53]。在此基礎(chǔ)上，我們聯(lián)用荷斯坦青年牛多插管灌注、胰腺組織孵育和胰腺腺泡細(xì)胞原代培養(yǎng)等技術(shù)，初步闡明Phe、Leu、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)調(diào)控胰腺酶表達(dá)和分泌的機(jī)制，并構(gòu)建了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[48,54-56]，目前正在探究奶牛胰腺對功能性氨基酸的特異性感知和響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。

集成CBI體系和奶畜胰腺外分泌功能的綜合調(diào)控技術(shù)，可保障瘤胃健康和高效發(fā)酵，提高小腸RES和其他營養(yǎng)素的消化率，我們初步建立了一種優(yōu)化反芻家畜飼糧營養(yǎng)素總體利用率的技術(shù)思路，該體系對小腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收層次的影響仍需深究。奶牛圍產(chǎn)期高強(qiáng)度的脂肪代謝導(dǎo)致機(jī)體自由基蓄積，易誘發(fā)氧化應(yīng)激，因此通過在飼糧中添加脂肪緩解NEB并不適當(dāng)；在保證飼糧營養(yǎng)均衡和小腸氨基酸平衡的前提下，通過飼料加工工藝或其他措施適當(dāng)增加RES和RUP含量，并輔以適量過瘤胃氨基酸(如Leu、Phe)，或可成為緩解奶牛圍產(chǎn)期NEB和蛋白質(zhì)負(fù)平衡(negative protein balance,NPB)的新途徑。當(dāng)然，上述功能性氨基酸能否調(diào)控圍產(chǎn)期奶牛的胰腺外分泌功能，尚需研究支持。

2.3 保障肝臟健康，提高肝臟能量代謝和營養(yǎng)輸出

肝臟是奶牛的能量代謝樞紐和多種重要蛋白質(zhì)的合成場所，如白蛋白和VLDL。奶牛機(jī)體的葡萄糖約70%源于肝糖異生，葡萄糖和脂類在肝細(xì)胞氧化產(chǎn)生的大量ATP是奶牛維持生長、繁殖、泌乳和其他生命活動的重要能量來源。因此，保障肝臟健康，提高其能量代謝和營養(yǎng)輸出效率，是奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)調(diào)控研究的重點領(lǐng)域之一。

奶牛圍產(chǎn)期肝臟健康和代謝面臨如下主要問題[5,57-58]：1)脂質(zhì)完全氧化能力有限，VLDL合成不足，肝臟TG蓄積，造成肝細(xì)胞脂肪浸潤或脂肪肝；2)脂質(zhì)代謝異常旺盛，自由基的產(chǎn)生超出其清除能力，肝細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激，造成氧化損傷；3)生糖前體物不足，且肝細(xì)胞生糖能力下降，造成機(jī)體MG負(fù)平衡；4)在神經(jīng)內(nèi)分泌和多種因素的綜合調(diào)控下，肝細(xì)胞合成相關(guān)代謝酶和活性物質(zhì)的能力下降；5)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，一些急性期蛋白(如腫瘤壞死因子α)抑制肝細(xì)胞功能。造成上述問題的根本原因是奶牛圍產(chǎn)期主要營養(yǎng)素的負(fù)平衡，尤其是能量和蛋白質(zhì)。因此，調(diào)控肝臟健康可通過2條途徑實現(xiàn)：1)促進(jìn)奶牛營養(yǎng)攝入，提高飼糧營養(yǎng)的總體利用率，緩解NEB和NPB，間接促進(jìn)肝臟健康；2)調(diào)控肝臟能量和脂質(zhì)代謝的核心通路，減少肝臟脂質(zhì)沉積，降低肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)肝臟功能[10,59]。

研究表明，腺苷一磷酸激活的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是細(xì)胞能量代謝的開關(guān)，在肝細(xì)胞能量和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮核心作用[17]。AMPK是一種高度保守的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白激酶，由1個催化亞基α和2個調(diào)節(jié)亞基(β和γ)組成，受AMP/ATP、上游激酶[如肝臟激酶B1(liver kinase B1，LKB1)]和激素(如瘦素)等因素的調(diào)控[60-62]。當(dāng)肝細(xì)胞AMPK被激活時，其下游活性蛋白的Ser或Thr殘基被磷酸化，進(jìn)而提高或降低其表達(dá)，抑制肝臟脂類合成，促進(jìn)脂類和碳水化合物的氧化供能(圖2)。有研究證明，瘦素和脂聯(lián)素均可激活下丘腦AMPK，提高嚙齒類動物的采食量[63-65]，而注射腦腸肽可激活大鼠下丘腦AMPK，不利于采食[66-67]，但瘦素和腦腸肽能否通過激活和抑制下丘腦AMPK調(diào)控奶牛圍產(chǎn)期干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)尚未見報道。AMPK在奶牛上的相關(guān)研究多集中于乳腺和脂肪組織的能量及脂質(zhì)代謝[68-70]，肝臟AMPK的研究較少。Deng等[71]研究發(fā)現(xiàn)，BHBA可激活奶牛原代肝細(xì)胞AMPK，促進(jìn)脂質(zhì)氧化，抑制脂質(zhì)合成。據(jù)此推斷，AMPK在奶牛肝臟碳水化合物和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，其網(wǎng)絡(luò)有待解析，且現(xiàn)有營養(yǎng)調(diào)控措施是否通過AMPK發(fā)揮效應(yīng)亦不明確。

Brain：大腦；hypothalamus：下丘腦；Food intake：食物攝入；Heart：心臟；Fatty acid oxidation：脂肪酸氧化；Glucose uptake：葡萄糖攝??；Glycolysis：糖酵解；Adipose tissue：脂肪組織；Fatty acid synthesis：脂肪酸合成；Lipolysis：脂解；Liver：肝臟；Cholesterol synthesis：膽固醇合成；Pancreatic β cell：胰腺β細(xì)胞；Insulin secretion：胰島素分泌；Skeletal muscle：肌肉組織；Fatty acid uptake, oxidation：脂肪酸攝取、氧化；Mitochondrial biogenesis：線粒體生物轉(zhuǎn)化；Exercise：運(yùn)動；Leptin：瘦素；Adiponectin：脂聯(lián)素；AMP：腺苷一磷酸 adenosine monophosphate；ATP：腺苷三磷酸 adenosine triphosphate；SNS：交感神經(jīng)系統(tǒng) sympathetic nervous system；AMPK：腺苷一磷酸激活的蛋白激酶 adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase。

圖2AMPK在碳水化合物和脂質(zhì)代謝中的作用

Fig.2 The role of AMPK in carbohydrate and lipid metabolism[17]

因此，明晰AMPK在奶牛圍產(chǎn)期下丘腦采食調(diào)控和肝臟糖脂代謝中的作用及機(jī)制，篩選可激活肝臟AMPK并調(diào)節(jié)相關(guān)激素分泌的飼料添加劑和(或)活性物質(zhì)，促進(jìn)肝臟營養(yǎng)代謝和轉(zhuǎn)化，理論上可有效緩解奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)素負(fù)平衡，保障胎兒和母體健康，提高產(chǎn)后泌乳性能。

3 小 結(jié)

奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)素負(fù)平衡嚴(yán)重威脅其整個泌乳周期的健康和高效生產(chǎn)，而對DMI的調(diào)控相對較難，因此，保障瘤胃健康和營養(yǎng)高效轉(zhuǎn)化，適當(dāng)增加RES的供應(yīng)量，同時促進(jìn)胰腺α-淀粉酶的合成和分泌，并調(diào)控肝臟健康和營養(yǎng)代謝，是奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)調(diào)控的重要技術(shù)途徑。

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