發(fā)酵雞血中優(yōu)良菌株的篩選與鑒定

梁肖娜，葉青，吳尚，吳尚儀，關(guān)博元，康世墨，陶冬冰，岳喜慶，*

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

雞血是雞肉屠宰加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物之一，約占雞質(zhì)量的4%～9.7%。我國(guó)的雞血資源豐富，但是利用率較低，大部分雞血被作為廢棄物倒掉，只有少部分被加工成血豆腐、血腸等傳統(tǒng)食品或被加工成飼料、血粉等產(chǎn)品[1]。據(jù)調(diào)查研究顯示，畜禽類(lèi)血液尤其是雞血營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，并且是一種含有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)來(lái)源，雞血的蛋白質(zhì)含量高達(dá)16%～18%，其中含有18種氨基酸，有8種為人體生長(zhǎng)所必需的氨基酸。此外，雞血中還含有豐富的維生素和生物酶類(lèi)，以及豐富的氮、磷、鉀、鈣、鎂等礦物質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、全面[2]。

由于目前在我國(guó)雞血資源較少的被得到開(kāi)發(fā)和利用，大部分的雞血倒入到田地中被自然發(fā)酵，導(dǎo)致大量的雞血資源的流失，這不僅對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的資源造成巨大的浪費(fèi)，同時(shí)也給雞血資源充分開(kāi)發(fā)和利用到其他方面造成不良的影響和效果[3-4]。本實(shí)驗(yàn)從微生物學(xué)角度出發(fā)，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，以新鮮的雞血為原料，進(jìn)行常溫下自然發(fā)酵，利用微生物培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)，從霉變的雞血中分離篩選出優(yōu)勢(shì)的有益微生物菌株[5]，并且對(duì)菌株進(jìn)行鑒定研究，利用優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵雞血液體肥料，后期對(duì)雞血液體肥料的肥效進(jìn)行研究。這不僅對(duì)于雞血資源的開(kāi)發(fā)利用做出了一定的貢獻(xiàn)，并且也為雞血資源更好地應(yīng)用于食品、飼料、肥料等方面奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他動(dòng)物血液的生產(chǎn)應(yīng)用提供了潛在的科研價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血（自然條件下微生物狀態(tài)）：沈陽(yáng)市偉峰肉雞加工廠；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、蔗糖、七水硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑盒、蛋白酶K、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、10×PCRbuffer、r-Taq 酶、Loadingbuffer、MarkerDM2000、Gel-red核酸染料、引物：北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BPS-250培養(yǎng)箱：上海梅穎浦儀表制造有限公司；BL-500電子天平：上海亞津電子科技有限公司；OLYMPUS CX21顯微鏡：上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；722G可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)伯樂(lè)公司；TDL-SA離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基；馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基；改良察式培養(yǎng)基；干酪素培養(yǎng)基。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種初步分離與篩選[6-7]

將新鮮雞血置于無(wú)菌狀態(tài)下，室溫自然發(fā)酵30 d，采用10倍梯度稀釋法將霉變雞血分別涂布于細(xì)菌、霉菌分離培養(yǎng)基平板上（細(xì)菌37℃下培養(yǎng)、霉菌30℃下培養(yǎng)），待長(zhǎng)出菌落后，分別從中挑取生長(zhǎng)旺盛的單個(gè)菌株，進(jìn)行反復(fù)分離純化至第三代，最終得到純種菌株并保存?zhèn)溆谩Ｔ偬羧∩鲜黾兎N菌株中生長(zhǎng)旺盛的單個(gè)菌株，分別接種到以2%的雞血代替硝酸鈉作為唯一氮源的改良察式培養(yǎng)基平板上，在適宜溫度條件下培養(yǎng)，并反復(fù)分離純化直至得到純種菌株，初步觀察菌落形態(tài)并分類(lèi)。將細(xì)菌和霉菌分別編為A、B兩組，將上述獲得純種菌株接種到干酪素培養(yǎng)基平板上，分別培養(yǎng)至30 h、60 h，并測(cè)量其透明圈直徑和菌落直徑的比值（DC），根據(jù)水解透明圈與菌落直徑的比值（DC）的大小可以初步判斷菌株蛋白酶活力的大小，最終分離純化在30 h、60 h時(shí)DC值較大的菌株，并且在0℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌種發(fā)酵復(fù)篩選[8]

經(jīng)透明圈初篩后得到的細(xì)菌、霉菌菌株，各取一接種環(huán)量接種到滅菌的雞血中，在160 r/min條件下，搖床培養(yǎng)180 h（細(xì)菌37℃、霉菌30℃），測(cè)定蛋白質(zhì)含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量，比較分析測(cè)定指標(biāo)，篩選出發(fā)酵雞血的優(yōu)勢(shì)菌株[9]。

1.4.3 菌株形態(tài)初步觀察與鑒定

觀察菌落的形狀、顏色、透明度等各項(xiàng)形態(tài)特征，細(xì)菌和霉菌分別通過(guò)革蘭氏染色、小室培養(yǎng)法在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》，進(jìn)行初步鑒定菌屬。

1.4.4 菌株DNA的提取和濃度測(cè)定

將四種菌株搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，11 000 r/min離心15 min，棄去上清液，加無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行重懸，反復(fù)吹打液體，重復(fù)3次以上操作，并收集菌液。試驗(yàn)采用單菌落裂解法制備模板DNA，每個(gè)菌株提取3次，用微量紫外-分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量濃度和在A260nm/A280nm下的光度值，光度值可以表示所提取DNA的純度，在Nucleic Acid的檢測(cè)良好的狀態(tài)下，用滅菌的蒸餾水進(jìn)行多次零點(diǎn)校正，校正之后開(kāi)始測(cè)定樣品DNA的濃度，每次進(jìn)樣量為2 μL。將A260nm/A280nm在1.8～2.0范圍內(nèi)的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。

1.4.5 菌株P(guān)CR擴(kuò)增

1.4.5.1 細(xì)菌DNA的擴(kuò)增[11]

試驗(yàn)以提取細(xì)菌的DNA為模板，細(xì)菌的16SrDNA采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段約為1 500 bp，上游引物為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物為 1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）為：1.0 μL 的 DNA 模板，39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、1.0 μL 2.5mmol/L dNTPs、上下游引物各1.5 μL、DNA Taq 酶 1.0 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；72℃7 min；35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收，在1 500 bp處有清晰條帶后方可送出去檢測(cè)，測(cè)序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4.5.2 真菌DNA的擴(kuò)增[12]

試驗(yàn)以提取霉菌的DNA為模板，霉菌的28SrDNA采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段約為600bp，上游引物為 ITS1：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；下游引 物 為 IS4：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′），PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）為，1.0 μL 的 DNA 模板，39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、1.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs、上下游引物各1.5 μL、DNA Taq 酶 1.0 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min 30 s；72℃7 min；35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收，在600 bp處有清晰條帶后方可送出去檢測(cè)，測(cè)序由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4.6 細(xì)菌和真菌同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)連接互聯(lián)網(wǎng)，將所檢測(cè)到的序列提交到NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心）數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）分析工具，將所分離得到的細(xì)菌的16SrDNA序列和霉菌28SrDNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已建立的16SrDNA序列和28SrDNA進(jìn)行相似性的比較分析，找到與已知目的基因序列同源性最高的已知菌種，再?gòu)腉enBank/EMBL/DDBJ的數(shù)據(jù)庫(kù)中，提取數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列和分離菌株的序列，用ClustalX2.1軟件進(jìn)行校準(zhǔn)排齊，用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

從細(xì)菌、霉菌平板培養(yǎng)基分別獲得細(xì)菌60株和霉菌30株，經(jīng)過(guò)反復(fù)分離純化后，保存?zhèn)溆?。將上述獲得共90株菌株，分別挑一接種環(huán)，接種到以2%雞血為唯一氮源平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得生長(zhǎng)旺盛的細(xì)菌32株，霉菌生長(zhǎng)旺盛的菌株18株，再將其接種到干酪素平板培養(yǎng)基上，獲得有生長(zhǎng)透明圈的細(xì)菌15株，霉菌8株，分別培養(yǎng)至30、60 h測(cè)定其透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算兩者比值（DC值），各菌株在30、60 h生長(zhǎng)以及透明圈大小情況如表1所示。

如表1所示，細(xì)菌和霉菌在30、60 h的透明圈直徑和菌落直徑以及透明圈直徑和菌落直徑比值（DC）可以看出，細(xì)菌A5、A7、A8菌株的產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)，DC值均在2以上；霉菌B1、B3、B4菌株的產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)，DC值均在1.5以上。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌株的復(fù)篩選

雞血中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定如圖1所示。

表1 培養(yǎng)30、60 h后各菌株生長(zhǎng)以及透明圈大小Table 1 The growth of strains 30、60 h and size of transparency

圖1 雞血中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定Fig.1 Determination of protein content in chicken blood

如圖1所示用菌株發(fā)酵后雞血的蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組相比，兩組間數(shù)據(jù)差異非常顯著（P≤0.01），說(shuō)明優(yōu)勢(shì)菌株的添加可以顯著增加雞血中蛋白質(zhì)的含量，細(xì)菌A5與A7、A8之間相比差異非常顯著（P≤0.01），而細(xì)菌A7與A8相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＞0.05）；霉菌B1與B4之間相比有顯著性差異（P≤0.05），B3與B4相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≤0.05），B1與B3相比差異不顯著（P＞0.05）。

雞血中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定如圖2所示。

圖2 雞血中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定Fig.2 Determination of soluble protein content in chicken blood

如圖2所示，發(fā)酵后雞血的可溶性蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組相比，兩組間數(shù)據(jù)差異極顯著（P≤0.01），說(shuō)明添加優(yōu)勢(shì)菌株可以使雞血中可溶性蛋白質(zhì)的含量上升，細(xì)菌A5與A7、A8之間相比數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)存在顯著性差異（P≤0.01），A7、A8 差異不顯著（P＞0.05），霉菌B1、B3和B4之間差異極顯著（P≤0.01）。

雞血中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定如圖3所示。

圖3 雞血中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定Fig.3 Determination of amino acid nitrogen content in chicken blood

如圖3所示，發(fā)酵后的雞血和發(fā)酵前雞血中氨基酸態(tài)氮含量相比較，兩組數(shù)據(jù)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P≤0.01），其中 A5與 A7差異不顯著（P＞0.05）與A8之間差異顯著（P≤0.05），而 A7、A8之間存在顯著性差異（P≤0.05）；霉菌 B1、B3、B4之間差異極顯著（P≤0.01）。綜合以上分析比較可以得出，細(xì)菌A7、A8和霉菌B1、B4為雞血發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌株。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌株菌落形態(tài)觀察

菌落形態(tài)學(xué)特征主要包括菌落形狀、菌落顏色、菌落透明度菌落質(zhì)地等，細(xì)菌A7、A8經(jīng)革蘭氏染色、過(guò)氧化氫和V.P.試驗(yàn)均為陽(yáng)性，菌株在平板上的單菌落呈現(xiàn)乳白色，圓形，邊緣整齊光滑，稍微透明，菌落直徑約為1 cm，負(fù)染色并在顯微鏡下觀察（圖4中A7、A8），均為粗壯的短桿狀，周生鞭毛，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和顯微鏡觀察，初步判斷A7、A8為巨型桿菌。霉菌采用小室培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)觀察，霉菌B1為灰綠色，表面光滑，其菌落呈現(xiàn)大而疏松的棉絮狀，在顯微鏡下觀察產(chǎn)生假菌絲（圖4中B1），形成子囊和子囊孢子，分生孢子為球形；霉菌B4質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀，菌落反面略帶黃色，表面平坦，在邊緣有時(shí)具白色的菌絲體，在顯微鏡下觀察分生孢子球形或近球形（圖4中B4），依據(jù)《中國(guó)真菌雜志》、《真菌鑒定手冊(cè)》，初步判定B1、B4分別為青霉和曲霉。

圖4 細(xì)菌和霉菌顯微鏡圖片F(xiàn)ig.4 Microscopic pictures of bacteria and fungi

2.4 菌株DNA濃度檢測(cè)和提取結(jié)果

如表2所示，細(xì)菌A7、A8，霉菌B1、B4的DNA質(zhì)量濃度均保持在30 ng/μL以上，并且4種菌株A260nm/A280nm下的光度值，也都均保持在1.8～2.0之間的范圍內(nèi)，因此可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表2 4種菌株DNA濃度和純度結(jié)果Table 2 Results DNA concentration and purity of four strains

2.5 PCR擴(kuò)增結(jié)果

試驗(yàn)分別以兩株細(xì)菌和真菌的DNA作為模板，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增的片段。細(xì)菌和霉菌所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別在 1 500 bp（5a）和 600 bp（5b），說(shuō)明 PCR 擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行序列測(cè)定。

2.6 細(xì)菌16SrDNA和霉菌28SrDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

細(xì)菌16SrDNA和霉菌28SrDNA同源性分析結(jié)果如表3所示。

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)篩選出的兩株細(xì)菌和霉菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均達(dá)到97%以上，其中A7與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性達(dá)到了100%，因此基本可以確定A7屬于芽孢桿菌菌屬（Bacillus）；另外有兩株菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性達(dá)到了99%，基本可以確定這兩株屬于青霉菌屬（Penicillium）和曲霉菌屬（Aspergillus），分別是B1和B4；A8與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性達(dá)到了97%，基本可以確定A8是屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）。

圖5 細(xì)菌和真菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of DNA extracted from the bacteria and mould strains

圖6為細(xì)菌根據(jù)16SrDNA，霉菌根據(jù)28SrDNA所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表3 細(xì)菌16SrDNA和霉菌28SrDNA同源性分析結(jié)果Table 3 Homological analysis of bacteria and mould by 16Sr DNA and 28Sr DNA sequence

從圖中可以看出，A7屬于芽孢桿菌菌屬，被鑒定為 Bacillus thuringiensis；B1、B4 屬于霉菌菌屬，B1 被鑒定為Penicillium citreonigrum，B4被鑒定為Aspergillus tubingensis；A8屬于希瓦氏菌屬，被鑒定為Shewanella sp.。本實(shí)驗(yàn)采用生理生化對(duì)該4種菌株進(jìn)行初步鑒定，并結(jié)合上述對(duì)于細(xì)菌16SrDNA和霉菌28SrDNA序列鑒定和同源性分析比對(duì)，這與表3中的同源性分析比對(duì)結(jié)果是一致的，因此可以判斷細(xì)菌A7、A8分別為蘇云金芽孢桿菌和希瓦氏菌；霉菌B1、B4分別為青霉菌屬、塔賓曲霉。

圖6 細(xì)菌16SrDNA（a）和霉菌28SrDNA（b）建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of bacteria and mould established on the basis of 26SrDNA and 28Sr DNA sequence analysis

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代化的微生物技術(shù)對(duì)自然發(fā)酵雞血進(jìn)行微生物的培養(yǎng)、分離、純化，成功地篩選出細(xì)菌60株、霉菌30株，再經(jīng)過(guò)透明圈試驗(yàn)、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、可溶性蛋白質(zhì)含量篩選指標(biāo)對(duì)90株菌株進(jìn)行綜合比較分析，最終篩選出一組發(fā)酵雞血的優(yōu)勢(shì)菌株為細(xì)菌A7、A8，霉菌B1、B4，并通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、顯微鏡觀察以及16SrDNA和28SrDNA對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分子鑒定，經(jīng)同源性分析比對(duì)，最終得出細(xì)菌A7屬于芽孢桿菌菌屬，被鑒定為Bacillus thuringiensis，A8是屬于希瓦氏菌屬，被鑒定為Shewanella sp.；霉菌B1、B4屬于霉菌菌屬，B1被鑒定為Penicillium citre－onigrum，B4被鑒定為Aspergillus tubingensis。隨著人們生活水平的提高，對(duì)畜產(chǎn)品的需求量急劇增加，與此同時(shí)，國(guó)家和社會(huì)對(duì)于環(huán)境的要求也隨之提高，而養(yǎng)殖場(chǎng)的廢棄物的循環(huán)加工和再利用，也成為近年來(lái)研究的熱門(mén)話題之一。本實(shí)驗(yàn)的研究和開(kāi)展將會(huì)對(duì)提高雞血的綜合利用價(jià)值和后續(xù)的開(kāi)發(fā)利用提供充分的理論依據(jù)和奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]王文婷,侯成立,宋璇,等.動(dòng)物血漿蛋白水解物功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2017(7):309-314

[2]楊葆春,靳義超,李全,等.動(dòng)物血液資源的開(kāi)發(fā)利用研究進(jìn)展[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2011(5):44-46

[3]GREENBERG J A,DIMENNA M,HANELT B,et al.Analysis of postblood meal flight distances in mosquitoes utilizing zoo animal blood meals[J].Journal of Vector Ecology,2012,37：83-89

[4]VUDATHALA D,CUMMINGS M,MURPHY L.Analysis of Multiple Anticoagulant Rodenticides in Animal Blood and Liver Tissue Using Principles of QuEChERS Method[J].Journal of Analytical Toxicology,2010,34：273-279

[5]趙曉丹,郭春華,柏雪,等.微生物發(fā)酵牛血生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J].生物學(xué)通報(bào),2016(4):45-49

[6]劉仲敏,何伯安,曹友聲,等.豬、牛血固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),1995(6):351-354

[7]DONG M,JIANG X,JIANG H,et al.Studies on screening,identification and fermentation characteristics of new natto-producing strain with the strong fibrinolytic activity[J].Journal of Nanjing Agricultural University,2001,24(1):95-98

[8]魯云風(fēng),楊柯金,梁子安,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化菌株B10發(fā)酵牛血條件的研究[J].飼料廣角,2010(21):29-31,40

[9]MISSOTTEN J A M,GORIS J,MICHIELS J,et al Screening of isolated lactic acid bacteria as potential beneficial strains for fermented liquid pig feed production[J].Animal Feed Science&Technology,2009,150：122-138

[10]武俊瑞,岳喜慶,石璞,等.PCR-DGGE分析東北自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌多樣性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2014,33(2):127-130

[11]孫慧君,張穎,王洪玉,等.傳統(tǒng)發(fā)酵錦州小菜中主要微生物多樣性分析[J].食品科學(xué),2017(2):15-19

[12]孟令帥,張穎,鄒婷婷,等.辣白菜中乳酸菌的分離鑒定[J].食品科學(xué),2015(11):130-133