桑葚果酒酵母菌的篩選及其發(fā)酵性能研究

曹培杰，馬劍，崔晉，馬艷弘

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西晉中030901；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014）

桑葚又叫桑子、桑棗、桑果，桑科落葉喬木桑樹的果實。桑葚果實富含多種營養(yǎng)成分及黃酮類化合物，傳統(tǒng)醫(yī)學認為，桑葚能補益肝腎、黑發(fā)明目、養(yǎng)血生津，具有多種保健功能；現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，桑葚具有增強人體免疫力、促進造血細胞生長、防止人體動脈硬化、骨骼關(guān)節(jié)硬化以及促進新陳代謝等生理功效，被醫(yī)學界譽為“二十一世紀的最佳保健果品”[1-3]。

由于桑葚是季節(jié)性水果，在常溫下易出現(xiàn)腐爛、變色、變味等情況，不宜儲藏運輸，保質(zhì)期短，所以將桑葚果實加工成便于運輸和儲藏的其他產(chǎn)品，對于提高桑葚的利用價值具有重要作用。目前以桑葚為原料開發(fā)的產(chǎn)品種類較少，主要集中在桑葚汁、桑葚酒、蜜餞、罐頭、果醬、天然花色苷等產(chǎn)品[4-6]。其中利用桑葚釀造果酒，既有利于保持桑葚鮮果中的天然營養(yǎng)成分，發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物又能夠增強桑葚酒的保健功能，具有很高的開發(fā)利用價值和市場潛力[7]。桑葚酒的品質(zhì)在很大程度上與所用酵母菌的發(fā)酵特性密切相關(guān)，然而目前為止，市場上大部分果酒的釀酒均采用的是葡萄酒釀酒酵母[8]，適宜桑葚酒釀造的專業(yè)酵母菌尚未見報道[9-11]。因此，本研究篩選適宜桑葚酒釀造的專用酵母菌株，并進一步研究其發(fā)酵特性，對于提升桑葚酒品質(zhì)，促進桑葚產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有一定的理論意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所微生物實驗室自行分離的桑葚酵母菌株，分別為SG1-1、SG1-2、SG1-3、SG1-4、SG1-5、SG 2-1、SG 2-2、SG 2-3、SG 2-4、SG 3-1、SG 3-2、SG 3-3，共 12 株。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；取50 g固體粉末狀YPD培養(yǎng)基，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至6.5左右，115℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。

1.1.3 試劑

無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸：南京壽德試驗器材有限公司；偏重亞硫酸鉀：北京君悅誠品科貿(mào)有限公司；以上化學試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1B型單人單面凈化工作臺：上海杰兔工貿(mào)有限公司；Blue-pard生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；Five Easy Plus試驗室pH計：梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；ML204電子天平：梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SHENAN滅菌鍋：上海宜川上嶺儀器有限公司；歐諾華榨汁機：美國伊斯曼公司；WYT糖度計：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；THZ-C-1全溫振蕩器：太倉市試驗設(shè)備廠；LXJ-IIB離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離

取-20℃保存的菌種[12]，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min的搖床培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將菌種活化，并進行傳代培養(yǎng)，備用。

1.2.2 酵母菌的篩選

酵母菌的初篩：將活化的菌種按8%的接種量接入到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，采用杜氏小管發(fā)酵法[13]觀察各菌株的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率，初步獲得產(chǎn)氣能力較強的菌株。

酵母菌的復篩：耐糖、酒精、SO2、及耐酸性篩選。將得到的產(chǎn)氣性較強的菌株分別接入到糖度為14，18，21，24，27°Bx，酒精濃度為8%、10%、12%、14%、16%、18%，SO2含量為 60、80、100、120、140 mg/L，pH 值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 的 YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，48 h后分別觀察杜氏小管的產(chǎn)氣情況。進一步篩選出對糖度、酒精度、SO2、酸性耐受性較強的菌株。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵性能的測定

1.2.3.1 酵母菌最適溫度測定

將篩選得到的SG3-2酵母種子液按8%接種量接種于 21 °Bx的桑葚汁中，分別于 20、23、25、28、30、33、35℃條件下培養(yǎng)5 d，于600 nm波長下測定菌懸液的OD值，依據(jù)OD值的大小確定其最適溫度。

1.2.3.2 酵母菌耐酸能力的測定

將篩選出的SG3-2酵母種子液分別接種于pH值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的桑葚汁（21 °Bx）中，28 ℃的恒溫培養(yǎng)5 d，在600 nm波長下測吸光度，根據(jù)吸光度的大小判斷SG 3-2菌株的耐酸性能。

1.2.3.3 酵母菌耐酒精能力的測定

將篩選得到的SG3-2酵母種子液按8%的接種量分別接種于含不同乙醇體積分數(shù)（8%、10%、12%、14%、16%、18%）的桑甚汁（21°Bx）中，28℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，在600 nm波長下測OD值。

1.2.3.4 酵母菌耐SO2能力的測定

21°Bx的桑葚汁中加入偏重亞硫酸鉀，使SO2濃度分別為 60、80、100、120 、140、160 mg/L，接入 SG3-2酵母菌種子液，28℃條件下培養(yǎng)5 d，600 nm處測其吸光度，依據(jù)OD值大小確定其對SO2的耐受能力。

1.2.4 生長曲線的測定

取裝有200 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶1個，不接種酵母菌，作為空白對照。

將菌種SG3-2接種于滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔4 h取樣，在560 nm處測定其吸光度，根據(jù)檢測結(jié)果繪制菌株的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種的篩選

2.1.1 酵母菌產(chǎn)氣性能的比較

分離的酵母菌株采用杜氏管發(fā)酵法，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h時，有少量氣體產(chǎn)生，而48 h后大多數(shù)菌株都有大量氣體產(chǎn)生，其中7株酵母菌株產(chǎn)氣量約等于杜氏小管的體積，分別為SG1-4、SG1-5、SG2-3、SG2-4、SG3-1、SG3-2、SG3-3，說明這些菌株發(fā)酵能力旺盛，酵母菌株的產(chǎn)氣情況見表1。

表1 酵母菌株的產(chǎn)氣情況Table 1 Gas-producing conditions of yeast strains

2.1.2 酵母菌耐酸性試驗結(jié)果

在不同酸度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母菌，可以篩選出耐高酸性的菌株見表2。由表2可以看出，在產(chǎn)氣性良好的7株菌株中，當pH值為2.0時，所有菌株都不能生長，而pH值等于2.5時，有5株能產(chǎn)生大量氣泡，分別為 SG1-4、SG1-5、SG3-1、SG3-2、SG3-3，說明這5株菌株耐酸性較強，在高酸性環(huán)境中仍能正常生長。當pH值大于3.0時，所有菌株均有大量氣泡產(chǎn)生。

表2 酵母菌耐酸性試驗結(jié)果Table 2 Test result of acid-resistance of yeasts

2.1.3 菌株對糖度的耐受性試驗

在不同糖度的培養(yǎng)基中，菌株的生長情況也有所不同見表3。由表3可以看出，當糖度小于18°Bx時，所篩選出的5株耐酸性較強的菌株均有大量氣泡產(chǎn)生，而糖度大于21°Bx時，則其中有4株菌株生長良好，有大量氣泡產(chǎn)生，分別為SG1-5、SG3-1、SG3-2、SG3-3，將這4株菌株作為耐SO2能力測試的出發(fā)菌株。

表3 酵母菌對糖度的耐受性試驗結(jié)果Table 3 Test results of glucose-tolerance of yeasts

2.1.4 酵母菌耐SO2性能的比較

在培養(yǎng)基中添加偏重亞硫酸鉀，可篩選出能耐高濃度SO2的菌株見表4。如表4，在酵母菌耐SO2試驗中得到的4株出發(fā)菌株在SO2濃度小于100mg/L時，杜氏小管中均有大量氣泡產(chǎn)生，當SO2濃度達到120 mg/L時，有一株菌株無氣泡產(chǎn)生，說明其不能耐受較高濃度的SO2，而其他3株均可以耐受140 mg/L的SO2且產(chǎn)生大量氣泡，其編號分別為SG1-5、SG3-2、SG3-3。

表4 酵母菌耐SO2性能試驗結(jié)果Table 4 Test results of yeasts tolerance to SO2

2.1.5 酵母菌的耐酒精能力篩選

根據(jù)以上試驗所篩選出的3株優(yōu)良菌種，進行不同乙醇濃度的耐受性試驗見表5。結(jié)果顯示，乙醇濃度小于12%時，3株菌株均能正常生長，當乙醇濃度為14%時，其中有兩株（編號為SG1-5和SG3-2）菌株有氣體產(chǎn)生，當濃度達到16%時，僅有1株能正常生長，編號為SG3-2。通過以上試驗，所篩選出的SG3-2菌株產(chǎn)氣性能好，耐酸性，耐SO2，耐乙醇能力較強，可作為桑葚果酒發(fā)酵的優(yōu)良酵母。

表5 菌株的耐酒精測定結(jié)果TabIe 5 Determination results of alcohol-tolerance of strains

2.2 酵母菌發(fā)酵能力的測定結(jié)果

2.2.1 酵母菌的最適溫度

酵母菌對溫度的耐受性試驗見表6。由表6可以看出，SG3-2酵母菌在不同的溫度條件下，其菌懸液的OD值不同，說明各發(fā)酵液中菌體濃度不同。當溫度從20℃不斷升高時，發(fā)酵液的OD值也不斷增大，當溫度達到30℃時，其OD值達到最大，當溫度再升高時，菌懸液的OD值有所下降，說明酵母菌的死亡速率大于新生速率。SG3-2最適生長溫度為30℃，但在果酒發(fā)酵過程中，若溫度過高，則會導致酒體風味變差，所以在實際發(fā)酵時，其發(fā)酵溫度應低于30℃。

表6 酵母菌對溫度的耐受性試驗Table 6 The tolerance test of yeast to temperatures

2.2.2 酵母菌耐酸能力的測定

酵母菌耐酸性試驗見表7。由表7可以看出，SG3-2酵母菌在pH值為2.0～7.0范圍內(nèi)均能生長，且隨著pH值的逐漸增大，其OD值也逐漸變大，當pH值達到4.0時，OD值達到最大，pH值繼續(xù)增加，其OD值減小。說明pH值為4.0時，菌體濃度最大，酵母菌生長最為旺盛，低酸性環(huán)境不適合酵母菌SG3-2的生長，所以其最適pH值為4.0左右。

表7 酵母菌耐酸性試驗Table 7 The test of acid-resistance of yeast

2.2.3 酵母菌耐酒精能力的測定

在不同乙醇濃度的的培養(yǎng)基中，酵母菌的生長情況不同見表8。當乙醇濃度由8%到14%逐漸增大時，培養(yǎng)液的OD值逐漸增大，乙醇濃度為14%，OD值最大，酵母菌生長速率最快，最適合果酒發(fā)酵，當乙醇濃度再增加時，其OD值逐漸變小，說明較高濃度的乙醇則會抑制酵母菌的生長。

表8 酵母菌的耐酒精能力Table 8 The alcohol-resistance of yeasts

2.2.4 酵母菌耐SO2能力測定

在發(fā)酵前往桑葚汁中加入SO2，不僅可抑制雜菌的生長，還可以防止色素被氧化。因此，具有較強的SO2耐受性的釀酒酵母有利于優(yōu)質(zhì)桑葚酒的釀造，酵母菌的耐SO2能力見表9。通過表9可以發(fā)現(xiàn)，隨著SO2濃度的增加，發(fā)酵液的OD值逐漸減小。當SO2濃度為100 mg/L時，OD值減小了25%，當SO2濃度為120 mg/L時，OD值減小了42%，說明SO2濃度較高，對酵母菌的生長抑制作用越大。因此最適的SO2濃度為 100 mg/L～120 mg/L。

表9 酵母菌的耐SO2能力Table 9 The resistance to SO2of the yeasts

2.3 酵母菌生長曲線的測定結(jié)果

酵母菌SG3-2的生長曲線如圖1。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增長，培養(yǎng)液的吸光度逐漸增大。SG3-2生長的對數(shù)期為4 h～16 h，穩(wěn)定期是16 h～28 h，在此期間，菌株活力最強，生長最為旺盛。在28h時，吸光度達到最大值，是菌株取樣的最佳時期。28 h后進入衰退期。菌株SG3-2的對數(shù)期和穩(wěn)定期都較長，有利于產(chǎn)生代謝物質(zhì)和發(fā)酵果酒，因此可作為桑葚果酒釀造的優(yōu)良酵母。

圖1 菌株3-2的生長曲線Fig.1 The growh curve of the yeast SG3-2

3 結(jié)論

不同酵母菌種的發(fā)酵能力，產(chǎn)酒精能力和對發(fā)酵環(huán)境的適應性不同，所得到的果酒的風味和質(zhì)量也不同。優(yōu)良的菌株不僅發(fā)酵速度快，發(fā)酵能力強，而且可以產(chǎn)生良好的酒香和果香味。從桑葚中分離得到的12株酵母菌株，通過杜氏管發(fā)酵法和吸光光度法，可得到一株耐酸性，耐SO2及耐酒精能力強的菌株，該菌株在pH值為4.0～4.5，SO2濃度為100 mg/L，酒精濃度為14%的條件下，仍然能夠正常生長，而且在生長到28 h時，生長最為旺盛。

[1]Yuan Qingxia,Xie Yufeng,Wang Wei,et al.Extraction optimization,characterization and antioxidant activityin vitro of polysaccharides from mulberry(Morus alba L.)leaves[J].Carbohydrate Polymers,2015,128:52-62

[2]梁桂秋,吳倩倩,祁廣軍,等.桑葚酒的營養(yǎng)價值及保健作用[J].現(xiàn)代食品科技,2011,27(4):457-460

[3]曾俊.桑葚的植物化學成分及其在食品加工中的研究進展[J].食品研究與開發(fā),2015(7):127-130

[4]吳敏,張東雷,王爽,等.桑葚保健功能的研究進展[J].食品研究與開發(fā),2012(9):214-217

[5]顏雪輝.桑葚酒專用酵母選育及發(fā)酵工藝研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學,2014

[6]梁艷英,任玉巧,王華.桑椹果酒及飲品的研究進展[J].釀酒,2005,32(6):48-50

[7]王琳、岳田利.桑椹紅色素研究進展[J].食品科技,2004(6):58-61[8]史路路,顏雪輝,呂梅,陳茂彬.低度白酒生產(chǎn)方式的研究進展[J].釀酒,2013,40(2):17-19

[9]李靜,黃科.桑葚自然發(fā)酵過程中酵母分離的初步研究[J].西安文理學院學報：自然科學版,2014,17(3):37-40

[10]Dai Chunhua,Feng Xiong,He Ronghai.Effects of low-intensity ultrasound on the growth,cell membrane permeability and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae[J].Ultrasonics Sonochemistry,2017(36):191-197

[11]YeLiu,WeihaoWang,YahanZhou,et al.Isolation,identification and in vitro screening of Chongqing orangery yeasts for the biocontrol of Penicillium digitatum on citrus fruit[J].BiologicalControl,2017,4(2):18-24

[12]潘訓海,劉新露,羅惠波,等.桑葚果酒酵母的分離及篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2013,41（5）：249-251

[13]劉貞,劉小翠,趙思明,等.發(fā)酵米漿中高發(fā)酵性能酵母菌和乳酸菌的篩選和鑒定[J].食品科學,2010,31(7):232-235

[14]鄭平,王在謙,李秀萍.果醋釀造中糖度測定方法及酒精度、酸度對糖度測定的影響[J].中國調(diào)味品,2015,40(9):16-20

[15]熊子書.中國釀造酵母菌的研究：不同酒類酵母篩選與應用[J].釀酒科技,2002(5):28-32

[16]張明科.篩選優(yōu)良酵母提供啤酒的發(fā)酵度[J].釀酒科技,2003(3):60-61