DTAC反膠束W o值對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化性的影響

左錦靜，姚永志

（1.河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學(xué)院，河南鄭州451191；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450000）

乳化性是大豆蛋白質(zhì)最重要的功能性質(zhì)之一，在食品的應(yīng)用中具有重要價(jià)值。大豆蛋白質(zhì)的乳化性與蛋白質(zhì)分子大小、構(gòu)象、氨基酸組成以及電荷分布有關(guān)。人們?yōu)榱颂岣叽蠖沟鞍踪|(zhì)的乳化性進(jìn)行了許多的研究[1-6]，提高蛋白質(zhì)的乳化能力和乳化穩(wěn)定性以及適用范圍一直是食品科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究重點(diǎn)。但是利用十二烷基三甲基氯化銨（dodecyltrimethyl ammonium chloride，DTAC） 反膠束萃取技術(shù)生產(chǎn)的大豆蛋白質(zhì)乳化性的研究鮮見報(bào)道。

反膠束萃取技術(shù)是一種適于生物大分子（如蛋白質(zhì)）分離純化的新技術(shù)，被研究者廣泛用來研究溶菌酶、α-淀粉酶、細(xì)胞色素-C和植物蛋白質(zhì)的分離萃取。反膠束常用的表面活性劑有丁二酸二異辛酯磺酸鈉（sodium bis-（2-ethylhexyl）sulfosuccinate，AOT）、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）等。程小麗等[7]研究了新的十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）反膠束體系的配制，同時(shí)研究得到DTAC/正庚烷-正己醇反膠束體系Wo值較大，對(duì)大豆蛋白的實(shí)際萃取率高。

本文采用DTAC/正庚烷-正己醇反膠束體系，研究了不同Wo值萃取蛋白質(zhì)樣品乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響，并通過分析蛋白質(zhì)樣品構(gòu)象的變化和表面疏水性的變化，研究不同Wo值影響蛋白質(zhì)乳化性的機(jī)理，這些理論對(duì)于掌握反膠束萃取蛋白質(zhì)的乳化性特點(diǎn)以及應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕：過100目篩，安陽(yáng)漫天雪食品制造有限公司。

十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）（生物級(jí)）：安徽奔馬先端科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、正己醇、正庚烷、氯化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid）（ANS）（純度 95%）：百靈威科技有限公司；透析袋（D25 mm）：上海藍(lán)劑生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

自動(dòng)水分滴定儀（ZSD-2J）、高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16G）：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-18C）：上海慕泓真空設(shè)備有限公司；熒光分光光度計(jì)（Cary Eclipse）：安捷倫有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 反膠束溶液中含水量（Wo）的測(cè)定

用Karl-fischer法[8]測(cè)定其“水池”的大小。

式中：Wo為反膠束溶液中增溶水和表面活性劑的摩爾比率。

1.3.2 樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.3 不同Wo值DTAC反膠束溶液的配制

DTAC反膠束溶液是由表面活性劑DTAC、溶劑正庚烷及助溶劑正己醇構(gòu)成的。正庚烷與正己醇體積比為4∶1，表面活性劑DTAC按照濃度為0.08 g/mL加入溶液中，搖床振蕩（或磁力攪拌）使表面活性劑徹底溶解，得到澄清透明的溶液，加入一定量的pH值為7.0，KCl濃度為0.1 mol/l的磷酸二氫鉀－磷酸氫二鈉緩沖溶液，在振蕩器中，恒溫振蕩150 min，溶液若為透明澄清，且底部沒有分出水層，即為反膠束，否則，則不是，需重配。之后靜置12 h。Wo值隨著緩沖溶液量的改變而改變。配制Wo值分別為 15、20、30、35、40 的 DTAC 反膠束溶液備用。

1.3.4 萃取蛋白質(zhì)樣品的制備

1.3.4.1 蛋白質(zhì)的前萃

豆粕粉按照0.025 g/mL的質(zhì)量加入Wo為15、20、30、35、40的DTAC反膠束溶液中，萃取溫度為35℃，恒溫振蕩器振蕩萃取1 h，使之充分溶解；取出離心，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心15 min，萃取體系分為兩層，上層為萃入蛋白質(zhì)的反膠束層，下層為殘?jiān)?，除去殘?jiān)〕錾蠈右簻?zhǔn)備用來后萃。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)的后萃

前萃液與1.0 mol/L KCl緩沖溶液等體積混合，向每組前萃液中加入適量的1.0 mol/L KCl緩沖溶液；35℃條件下，用恒溫振蕩器振蕩80 min，溶解；取出離心，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心15 min，取下層液備用。

1.3.4.3 萃取蛋白質(zhì)樣品的制備

反膠束萃取的后萃液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，采用分子量3 500道爾頓（Dalton，D）規(guī)格的透析袋處理24 h，然后冷凍真空干燥得到萃取后的蛋白質(zhì)樣品，備用。

1.3.5 乳化性的測(cè)定

蛋白質(zhì)的乳化性包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性，采用乳化活性指數(shù)（Emulsifying Activity Index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（Emulsifying Stability Index，ESI）表示。乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）的測(cè)定方法參考 Lamlam Cheung[9]、Chen Chen[10]、Andrea K.Stone[11]等采用的方法。反膠束萃取各樣品和大豆分離蛋白分別溶解于0.01mol/L pH7.0 Na2HPO4和KH2PO4緩沖溶液中配制成蛋白質(zhì)濃度為2 g/L的溶液。將10 mL大豆色拉油和30 mL各樣品蛋白液以及對(duì)照大豆分離蛋白液混合并在25℃，10 000 r/min的速度下均質(zhì)攪拌1 min。在均質(zhì)后0 min和10 min從容器底部吸取100 μL試樣，并分別用0.1%的SDS溶液將其稀釋100倍，采用1 cm比色皿，測(cè)定其在500 nm的吸光度，可得到A0和 A10。

式中：A0是0 min時(shí)的吸光度；A10是10 min時(shí)的吸光度；Δt=10 min。

式中：EAI為乳化活性，m2/g；N為稀釋倍數(shù)；C為形成乳狀液前水相中單位體積蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g/mL；φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)，此時(shí)為0.25。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

不同Wo反膠束萃取的蛋白質(zhì)和對(duì)照大豆分離蛋白的表面疏水性參照W.U.Wu等[12]所采用的方法。以8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）作為熒光探針，ANS采用0.01 mol/L pH7.0 Na2HPO4和KH2PO4緩沖溶液溶解，濃度為8 mmol/L。蛋白質(zhì)樣品分別配制成濃度為 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.5 mg/mL溶液。激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，狹縫寬度5 nm，不同濃度蛋白質(zhì)溶液10 mL中加入50 μL ANS溶液，混勻立即測(cè)定樣品溶液的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白質(zhì)濃度不斷減小，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度無限趨近于0時(shí)，曲線該點(diǎn)的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)（S0）。

1.3.7 蛋白質(zhì)樣品溶液內(nèi)源熒光光譜掃描

反膠束萃取的蛋白質(zhì)樣品溶解于0.01 mol/L pH7.0 Na2HPO4和KH2PO4緩沖溶液中配制成濃度為0.5 mg/ml的溶液。分別測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)280 nm和激發(fā)波長(zhǎng)295 nm處掃描光譜。同時(shí)掃描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜。

1.3.8 試驗(yàn)結(jié)果與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取蛋白質(zhì)樣品和大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量比較

萃取后的蛋白質(zhì)樣品和大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量如表1所示，Wo值越大，反膠束水池越大，萃取的大分子量蛋白質(zhì)越多，萃取得到的樣品蛋白質(zhì)含量越高，反膠束萃取的樣品蛋白質(zhì)含量要比大豆分離蛋白稍高。

表1 萃取蛋白質(zhì)與大豆分離蛋白的蛋白含量比較Table 1 The comparison of protein content between soy protein isolate and protein of reversed micellar extraction

2.2 DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水性采用表面疏水性指數(shù)So的大小來表示。采用W.U.Wu，N.S[12]的試驗(yàn)方法測(cè)得的不同Wo萃取蛋白質(zhì)產(chǎn)品表面疏水性曲線見圖1。由圖1中的曲線方程可得到DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)的影響見圖2。

圖1 Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)表面疏水性的影響曲線Fig.1 The effect of Wo on surface hydrophobicity of protein extracted

圖2 反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)的影響Fig.2 The effect of Wo of reverse micelles on surface hydrophobicity intex of protein extracted

Wo=15時(shí)，曲線方程為y=77.31x2+35.63x+12.55，R2=0.998；Wo=20時(shí)，曲線方程為y=122.5x2+50.57x+12.24，R2=0.999；Wo=30 時(shí)，曲線方程為y=-72.14x2+99.02x+11.76，R2=0.998；Wo=35 時(shí)，曲線方程為 y=-114.2x2+122.2x+12.17，R2=0.998；Wo=40時(shí)，曲線方程為y=-122.6x2+178.6x+11.33，R2=0.994。

由圖2可見，隨著DTAC反膠束含水量Wo值的增加，蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)也逐漸增大。

2.3 DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）殘基。由于苯丙氨酸的量子產(chǎn)率很低，酪氨酸被電離或者接近氨基、羧基時(shí)其熒光幾乎全部猝滅[13]。因此，通常利用Try的熒光來研究蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象的變化。Sulkowska A[14]、Jiang M[15]，Liu Y等[16]認(rèn)為激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光來自于色氨酸和酪氨酸兩者的貢獻(xiàn)，但其中主要是色氨酸貢獻(xiàn)，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，蛋白質(zhì)熒光完全來自于色氨酸。Miller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，由Δλ=15 nm所作出的同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的光譜特性；而由Δλ=60 nm的同步熒光光譜僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光。因氨基酸殘基的最大吸收波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，故而由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。Brustein等[18]認(rèn)為色氨酸的最大熒光發(fā)射峰位對(duì)環(huán)境很敏感，所處環(huán)境的疏水性逐漸增加，其最大發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移。λmax位于342 nm左右時(shí)，色氨酸部分處在疏水性介質(zhì)中。因此同步熒光光譜中最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移時(shí)，其所處環(huán)境的疏水性逐漸增大，說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化。

激發(fā)波長(zhǎng)280 nm和激發(fā)波長(zhǎng)295 nm的蛋白質(zhì)熒光見圖3和圖4。圖3為色氨酸和酪氨酸兩者的熒光圖譜，圖4為蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的熒光圖譜。

圖3 激發(fā)波長(zhǎng)280 nm蛋白質(zhì)熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescence emission spectra of protein at an excitation wavelength of 280 nm

圖4 激發(fā)波長(zhǎng)295 nm蛋白質(zhì)熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of protein at an excitation wavelength of 295 nm

DTAC反膠束不同含水量Wo萃取蛋白質(zhì)樣品的同步熒光光譜如圖5、圖6。圖5為酪氨酸殘基的的熒光，圖6為色氨酸殘基的熒光光譜。通過圖5和圖6可知色氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的熒光起主要貢獻(xiàn)。

圖5 0.5 mg/mL蛋白質(zhì)溶液Δλ=15 nm的同步熒光圖譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectrum of protein concentration 0.5 mg/mL with Δλ=15 nm

圖6 0.5 mg/mL蛋白質(zhì)溶液Δλ=60 nm的同步熒光圖譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectrum of protein concentration 0.5 mg/mL with Δλ=60 nm

圖4中熒光完全來自于色氨酸，色氨酸的熒光最大發(fā)射峰位于340 nm～349 nm之間。圖6是蛋白質(zhì)的同步熒光圖譜，萃取蛋白質(zhì)最大熒光發(fā)射峰λmax位于340 nm～343 nm之間。由此說明色氨酸殘基部分處于疏水性介質(zhì)中，部分位于親水介質(zhì)中。并且最大熒光峰有小的藍(lán)移，說明其所處疏水性增大，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化。萃取蛋白質(zhì)表面疏水性隨著Wo增大而增大，暴露在蛋白質(zhì)表面上的色氨酸殘基會(huì)增多，因此隨著Wo值的增大，色氨酸的熒光值也逐漸增加。

2.4 DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化活性的影響機(jī)理

以大豆分離蛋白的乳化活性指數(shù)為對(duì)照，比較了不同Wo值DTAC反膠束萃取蛋白質(zhì)產(chǎn)品的乳化活性指數(shù)差別見圖7。

圖7 反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化活性的影響Fig.7 The effect of Wo of reverse micelles on emulsifying activity of protein extracted

由圖7可見反膠束體系含水量Wo對(duì)提取蛋白質(zhì)的乳化活性有一定的影響。在表面活性劑DTAC能形成反膠束體系的Wo范圍內(nèi)，隨著Wo的增大，乳化活性逐步減小。與大豆分離蛋白的乳化活性相比，Wo為15和20時(shí)萃取的蛋白質(zhì)乳化活性要稍高，Wo為30、35和40時(shí)萃取的蛋白質(zhì)乳化活性要小于大豆分離蛋白的乳化活性。

蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)與蛋白質(zhì)的溶解性有很大關(guān)系。一定條件下，溶解性的改善將會(huì)有利于蛋白質(zhì)乳化性的提高。另外蛋白質(zhì)的乳化性大小還取決于蛋白質(zhì)分子中親水、親油基團(tuán)以及它們所處的位置。因此蛋白質(zhì)乳化性受分子量大小和構(gòu)象影響比較大[19]。大豆蛋白質(zhì)為球蛋白，在水溶液中溶解度非常小，而經(jīng)過反膠束萃取的蛋白質(zhì)溶解性高，分子量小于大豆分離蛋白，并且隨著Wo的增加，大分子量蛋白質(zhì)比例會(huì)有所增加[7]；蛋白質(zhì)構(gòu)象此時(shí)也發(fā)生了巨大的變化，疏水性氨基酸殘基暴露在表面比例增加，將會(huì)導(dǎo)致親水親油的變化，蛋白質(zhì)表面疏水性變大，影響蛋白質(zhì)的乳化活性。由于這些因素，隨著Wo的增大，萃取蛋白質(zhì)乳化活性略有下降。

2.5 DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的影響

DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的影響見圖8所示。

圖8 反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的影響Fig.8 The effect of Wo of reverse micelles on emulsion stability of protein extracted

由圖8可知，隨著Wo值的增大，萃取蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性逐漸增加，Wo為15和20時(shí)萃取的蛋白質(zhì)乳化性穩(wěn)定性與大豆分離蛋白基本相似，而Wo為30、35和40時(shí)萃取的蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大豆分離蛋白。影響蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的因素與乳化活性相似。蛋白質(zhì)溶解性、蛋白質(zhì)分子量、蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化以及蛋白質(zhì)表面疏水性都會(huì)影響乳化穩(wěn)定性的變化。蛋白質(zhì)分子量和構(gòu)象的變化導(dǎo)致萃取蛋白質(zhì)表面疏水性的增加，從而改善了蛋白質(zhì)的表面活性特征，提高了體系的穩(wěn)定性。

2.6 萃取的蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性相關(guān)性分析

不同含水量Wo值的DTAC反膠束體系萃取的蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性相關(guān)性見圖9，經(jīng)spss相關(guān)性分析見表2。由表2可以得出，萃取蛋白質(zhì)的表面疏水性與乳化穩(wěn)定性顯著正相關(guān)（r=0.990，p＜0.01），表面疏水性與乳化活性顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.941，p＜0.05）。所以蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的表面疏水性有很大的關(guān)系，能夠影響蛋白質(zhì)表面疏水性的因素都可能影響到蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)研究了DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化性的影響，探討了影響的機(jī)理，萃取的蛋白質(zhì)有較好的乳化性，在食品中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖9 萃取的蛋白質(zhì)表面疏水性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性相關(guān)性分析Fig.9 Correlations between surface hydrophobicity and emulsifying activity，emulsion stability of protein extracted

表2 相關(guān)性分析Table 2 Correlations analysis

隨著DTAC反膠束體系含水量Wo值的增大，萃取蛋白質(zhì)色氨酸殘基熒光值逐漸增加，色氨酸殘基部分處于疏水性介質(zhì)中，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化。暴露在蛋白質(zhì)表面上的色氨酸殘基會(huì)增多，蛋白質(zhì)表面疏水性也會(huì)隨著Wo值的增加而增大。

DTAC反膠束含水量Wo對(duì)萃取蛋白質(zhì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性有一定的影響，隨著Wo值的增加，蛋白質(zhì)的乳化活性略微下降，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性顯著提高，并且萃取蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大豆分離蛋白。

萃取蛋白質(zhì)的表面疏水性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性有一定的相關(guān)性。萃取蛋白質(zhì)的表面疏水性與乳化穩(wěn)定性顯著正相關(guān)（r=0.990，p<0.01），表面疏水性與乳化活性顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.941，p<0.05）。

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