高血壓合并高脂血癥大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

趙勝楠，何黎黎*，李自強(qiáng)，王發(fā)展，宋相容，張 智,3*

(1.西南民族大學(xué)，成都 610041； 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 3.四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000)

近年來，隨著生活水平的不斷提高和人口老齡化日益嚴(yán)重，心血管疾病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]，高血壓與血脂異常是目前公認(rèn)的兩大可控制的心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[2-3]。截止2015年，我國(guó)高血壓患者已達(dá)2.7億，其中，約有63.7%患者存在著血脂異常的情況[4-5]。高血壓合并高脂血癥的危險(xiǎn)系數(shù)極大，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素，也是心血管病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素；長(zhǎng)期高血壓合并血脂水平異常還可導(dǎo)致重要臟器如心、腎器官的損傷，最終導(dǎo)致這些靶器官的功能衰竭[6-7]。因此，建立一種經(jīng)濟(jì)便捷、穩(wěn)定的高血壓合并高脂血癥大鼠模型，對(duì)于進(jìn)一步研究高血壓合并高脂血癥的發(fā)病機(jī)制、篩選和評(píng)價(jià)相關(guān)治療藥物將具有重要意義[8]。

目前，高血壓合并高脂血癥大鼠模型主要包括基因相關(guān)模型(遺傳、轉(zhuǎn)基因和基因敲除)、化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型和高脂飲食誘導(dǎo)模型三大類。基因相關(guān)模型傾向于單基因增強(qiáng)或缺陷，弱化了環(huán)境因素，不能完全模仿高血壓合并高脂血癥患者的病理特點(diǎn)，因此通常僅用于病理機(jī)制研究[9]?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)模型易使動(dòng)物產(chǎn)生不耐受而出現(xiàn)死亡，呈現(xiàn)造模成功率低、模型不穩(wěn)定、個(gè)體差異大等缺點(diǎn)[10]。高脂飲食誘導(dǎo)模型則因其較為穩(wěn)定，能模擬人類不健康生活方式對(duì)疾病產(chǎn)生的影響，且其造模成本比基因相關(guān)模型低廉的原因，在藥物篩選研究中應(yīng)用廣泛[11]。利用高脂飼料飼喂自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)構(gòu)建的高血壓合并高脂血癥大鼠模型(HP/HL-SHR)，最接近高血壓合并高脂血癥患者的病理特征，已成為研究高血壓合并高脂血癥的病理機(jī)制、篩選相關(guān)治療藥物的常用動(dòng)物模型[12]。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的HP/HL-SHR造模方法各異、模型重現(xiàn)性差，評(píng)價(jià)指標(biāo)不充分，如未對(duì)關(guān)鍵指標(biāo)心、腎組織損傷程度進(jìn)行考察，不利于直接引用參考。因此，本課題擬以高脂飼料飼喂SHR，構(gòu)建高血壓合并高脂血癥大鼠模型，并對(duì)其心、腎功能進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，為相關(guān)治療藥物的評(píng)價(jià)提供藥效學(xué)動(dòng)物模型及相關(guān)方法的參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SHR大鼠20只，3周齡，體重(85±5)g。SPF級(jí)齡雄性WKY大鼠10只，3周齡，體重(85±5)g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SYXK(京)2013-14]。兩種大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK(川)2011-178]，3只一籠，自由飲水；光照周期為晝夜各12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在20℃～24℃，相對(duì)濕度維持在50%～60%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)處理均嚴(yán)格遵循四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)相關(guān)指南要求。

1.2 飼料

普通維持飼料配方為：玉米73.5%、麥麩20%、魚粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%。

高脂飼料配方為：67 %維持飼料、2.5 %膽固醇、10 %豬油、20.0%蔗糖、0.5 %膽酸鈉，由北京華阜康生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 主要試劑與儀器

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自四川邁克生物科技股份有限公司。

微型冷凍離心機(jī)FRESCO 17(德國(guó)賽默飛公司)，用于分離血清；7020全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，用于血脂測(cè)定；智能無創(chuàng)血壓計(jì)-鼠儀BP-2010 A(北京軟隆生物技術(shù)有限公司)，用于血壓測(cè)定；PHY-111病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器)、石蠟包埋機(jī)EG1150H(德國(guó)徠卡)、石蠟切片機(jī)RM2235(德國(guó)徠卡)，用于心腎組織石蠟切片；正置顯微鏡BX41TF(Olympus)，用于成像拍照。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組

SHR大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(SHR-NC)和模型組(SHR-HF)兩組，每組10只；WKY大鼠10只作為對(duì)照組(WKY-NC)。

大鼠飼養(yǎng)方式為：每日定時(shí)、定量放置飼料以及飲水。3組大鼠均先采用普通維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，再行分組飼養(yǎng)。SHR-NC和WKY-NC組飼喂普通維持飼料，SHR-HF組飼喂高脂飼料。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

造模實(shí)驗(yàn)開始前，稱量大鼠的基礎(chǔ)體重后將大鼠置于智能無創(chuàng)血壓儀的保溫筒內(nèi)，待大鼠穩(wěn)定后，自動(dòng)測(cè)定三次血壓(收縮壓SBP)及心率。大鼠禁食16 h(正常飲水)后，取血測(cè)定基礎(chǔ)血脂指標(biāo)，具體方法為：乙醚麻醉大鼠后，眼眶取血，離心分離血清，測(cè)定基礎(chǔ)血脂水平，具體包括：HDL-C、LDL-C、TC、TG。

表1 造模23周后三組雄性大鼠血漿中血脂的變化(mg/dL，n=10)

注：與SHR-NC組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the SHR-NC group，*P< 0.05，**P< 0.01.

造模實(shí)驗(yàn)期間每周同一時(shí)間監(jiān)測(cè)體重和血壓，具體操作同上。

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，高脂飼料飼喂23周后，同法監(jiān)測(cè)體重、血壓和血脂；然后麻醉處死大鼠，收集腎臟和心臟組織，4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，再分批進(jìn)行Masson染色和HE染色；顯微鏡下觀察各臟器組織的病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模23周后三組雄性大鼠的收縮壓變化

注：與SHR-NC組相比，*P< 0.05。圖1 造模23周后三組大鼠的收縮壓變化(n=10)Note.Compared with SHR-NC group, *P< 0.05.Fig.1 Changes of systolic blood pressure in the male rats after 23 weeks feed with high fat diet or normal chow

造模23周結(jié)束后，WKY-NC、SHR-NC和SHR-HF組的大鼠血壓水平如圖1所示。經(jīng)高脂飲食飼喂后，SHR-HF組的大鼠與飼喂普通飼料的SHR-NC組相比，SBP水平升高幅度明顯(P< 0.05)；而WKY-NC組的大鼠血壓水平明顯低于SHR-NC、SHR-HF組。

2.2 造模23周后三組雄性大鼠血脂的變化

造模23周結(jié)束后，WKY-NC、SHR-NC和SHR-HF組的大鼠血脂水平見表1，具體指標(biāo)對(duì)比情況如圖2所示。SHR-HF組與SHR-NC組相比，大鼠血漿血脂水平表現(xiàn)出了較為明顯的紊亂特征，在各個(gè)指標(biāo)上差異有顯著性：SHR-HF組的大鼠HDL-C水平下降了27%(P< 0.01)；LDL-C水平也上升了138%(P< 0.05)；TC、TG水平明顯升高，升高倍數(shù)分別高達(dá)130%、123%(P< 0.01，P< 0.05)。兩組SHR大鼠血脂水平與WKY-NC組相比，表征血脂水平的各個(gè)指標(biāo)(HDL-C、LDL-C、TC、TG)均明顯低于WKY-NC組。

2.3 造模23周后三組雄性大鼠體重的變化

注：與SHR-NC組相比，*P< 0.05，**P < 0.01。圖2 造模23周后大鼠血漿中血脂變化(n=10)Note.Compared with the SHR-NC group，*P< 0.05，**P < 0.01.Fig.2 Plasma lipid levels in the rats with normal chow or high fat diet for 23 weeks

圖3 造模23周后三組大鼠的體重變化Fig.3 The changes of body weight in the rats with normal chow or high fat diet for 23 weeks.

WKY-NC、SHR-NC和SHR-HF組的大鼠體重隨周齡變化規(guī)律如圖3所示，大鼠體重隨飼喂時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，飼喂10周后，增長(zhǎng)速度逐漸變緩。造模23周后，高脂飲食飼喂的SHR-HF組的大鼠體重與SHR-NC組相比，平均增加了41 g(P< 0.01)，較WKY-NC組平均增加了27 g。

以上結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)可成功誘導(dǎo)SHR發(fā)生高血壓合并高脂血癥，因此，進(jìn)一步對(duì)高血壓合并高脂血癥大鼠的心腎靶器官進(jìn)行了深入的研究觀察。

2.4 造模23周后三組雄性大鼠腎臟病理變化

2.4.1 腎纖維化損傷

造模23周結(jié)束后，對(duì)各組大鼠腎臟組織的石蠟切片進(jìn)行Masson染色后，以腎臟皮質(zhì)或近皮質(zhì)區(qū)域?yàn)橛^察對(duì)象，光學(xué)顯微鏡下對(duì)每張切片中不同區(qū)域進(jìn)行拍照(100倍)，并應(yīng)用IPP系列多功能圖像分析軟件測(cè)量腎臟纖維化程度；其中，膠原纖維呈藍(lán)色，腎臟纖維化程度以圖片中纖維化區(qū)域的總光密度值表示，即藍(lán)色區(qū)域的強(qiáng)度。

WKY-NC、SHR-NC和SHR-HF組的大鼠腎臟纖維化損傷情況如圖4所示。結(jié)果表明，高脂飲食飼喂的SHR-HF組與SHR-NC組相比，大鼠的腎臟纖維化情況加重，纖維化面積增幅高達(dá)130%(P< 0.01)；而WKY-NC組的大鼠腎臟組織病理損傷較輕，纖維化情況明顯低于SHR-NC、SHR-HF組。

2.4.2 腎小葉間動(dòng)脈血管重構(gòu)

注： a、b、c：大鼠腎臟HE染色(×800)；a#、b#、c#：大鼠腎臟HE染色(×400);B：腎動(dòng)脈血管壁腔內(nèi)徑比(MT/LD);與SHR-NC組相比，*P< 0.05。圖5 造模23周后大鼠腎動(dòng)脈的病理改變Note.A. Renal tissues and arteries. a,b,c: Renal arteries, ×800. a#,#,c#: Kidney tissues, ×400. B: The ratio of renal artery wall/ diameter (MT / LD), compared with the SHR-NC group，*P< 0.05.Fig.5 Histological changes of renal arteries in the rats with normal chow or high fat diet for 23 weeks. HE staining

造模23周結(jié)束后，對(duì)大鼠腎臟組織石蠟切片進(jìn)行HE染色后，以腎小管區(qū)域?yàn)橛^察對(duì)象，光學(xué)顯微鏡下對(duì)每張切片中不同區(qū)域進(jìn)行拍照(400倍)，觀察腎小管區(qū)域小葉間動(dòng)脈血管形態(tài)，并應(yīng)用IPP系列多功能圖像分析軟件測(cè)量血管管腔內(nèi)徑(LD)和血管壁厚度(WT)，并進(jìn)一步計(jì)算出血管壁腔內(nèi)徑比(WT/LD)。

WKY-NC、SHR-NC和SHR-HF 組的大鼠腎小葉間動(dòng)脈血管情況如圖5所示。 高脂飲食飼喂的SHR大鼠腎動(dòng)脈血管出現(xiàn)了明顯的病理學(xué)改變：血管壁明顯增厚、血管腔狹窄，重構(gòu)嚴(yán)重。與SHR-NC組相比，高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠(SHR-HF組)腎動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)改變，發(fā)生明顯重構(gòu)(P< 0.05)；而WKY-NC組大鼠的血管結(jié)構(gòu)并未發(fā)生嚴(yán)重的病理學(xué)改變，腎臟血管受損情況明顯輕于SHR-NC、SHR-HF組大鼠。結(jié)果表明：高脂飲食誘導(dǎo)SHR-HF組的大鼠腎臟器官受損嚴(yán)重。

2.5 造模23周后三組雄性大鼠心臟組織的病理變化

注：A：大鼠心臟心肌組織Masson染色；a(a#)、b(b#)、c(c#)：橫切Masson染色；d、e、f：縱切Masson染色；與SHR-NC組相比，**P< 0.01。圖6 造模23周后大鼠心臟Masson染色(×100)Note.A: Heart tissues. a(a#),b(b#),c(c#): slitting Masson staining；d,e,f: crosscutting Masson staining.Compared with the SHR-NC group，**P< 0.01.Fig.6 Histology of the heart tissue in rats with normal chow or high fat diet for 23 weeks. Masson staining

WKY-NC、SHR-NC和SHR-HF組的大鼠心臟心肌纖維化損傷情況如圖6所示。高脂飲食飼喂的SHR-HF組與SHR-NC組相比，大鼠心臟心肌細(xì)胞的纖維化程度加深，心肌細(xì)胞增大、肥厚嚴(yán)重(P< 0.01)；與WKY-NC組相比，SHR-NC、SHR-HF組的大鼠心臟心肌纖維化區(qū)域面積增大明顯(P< 0.01)；然而，SHR-NC組的大鼠心肌細(xì)胞并未有增厚等病理改變，而SHR-HF組心肌細(xì)胞增厚明顯(P< 0.01)。以上結(jié)果表明：高脂飲食誘導(dǎo)的SHR-HF組大鼠心臟器官受損明顯。

3 討論

HP/HL是一種對(duì)心腎損傷極大，致殘致死率較高的全球性公共衛(wèi)生疾病，其臨床表現(xiàn)通常為血壓過高，并發(fā)血漿中TC、TG或LDL-C過高，或HDL-C過低的血脂異常[3]。目前針對(duì)HP/HL的治療藥物多采用合并用藥，且側(cè)重點(diǎn)大多在于合理控制患者的血壓血脂水平，并未過多強(qiáng)調(diào)對(duì)心腎器官的保護(hù)作用。因此，在開發(fā)HP/HL合并癥治療藥物時(shí)，除對(duì)血壓血脂進(jìn)行評(píng)價(jià)外，關(guān)注藥物對(duì)心腎器官的保護(hù)作用也有極其重要的臨床意義；同時(shí)，構(gòu)建高血壓合并高脂血癥且伴隨心腎功能損傷的大鼠模型，將助益于推動(dòng)更高效的HP/HL合并癥治療藥物的開發(fā)。

本課題組在預(yù)試驗(yàn)階段，采用文獻(xiàn)中報(bào)道的高脂飼料[12-15]飼喂SHR，旨在構(gòu)建HP/HL-SHR模型，但TG水平始終未發(fā)生顯著性改變，推測(cè)原因可能是處方中脂肪含量較高(豬油10%～30%不等)，制得的高脂飼料質(zhì)地較軟，導(dǎo)致大鼠的每日攝食量減少。本課題優(yōu)選的高脂飼料處方脂肪含量?jī)H為10%、蔗糖含量為20%、且具有較高的膽固醇含量(2.5%)，質(zhì)地堅(jiān)硬，適合大鼠咀嚼，攝食量增多，SHR大鼠飼喂23周后可成功引發(fā)脂質(zhì)紊亂，誘導(dǎo)HP/HL。

WKY大鼠常被用作SHR的模型對(duì)照組，廣泛用于高血壓治療藥物的降壓作用評(píng)價(jià)。本課題研究發(fā)現(xiàn)，SHR-NC組的LDL-C、TC與TG水平均顯著低于WKY-NC組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-13]；此血脂水平的差異可能源于WKY與SHR分屬不同種系?；诖嗽?，本課題構(gòu)建的HP/HL-SHR模型是以SHR-NC組參照來評(píng)價(jià)血脂水平，即：SHR-HF與SHR-NC組比較，HDL-C降低，TC、TG和LDL降低，則視為SHR-HF組大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)紊亂即高脂血癥。此外，本課題進(jìn)一步的對(duì)心腎功能進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，在SHR-HF組，高血壓及高血脂對(duì)應(yīng)的靶器官心臟和腎臟均出現(xiàn)大量的損傷，顯著嚴(yán)重于SHR-NC組；然而，盡管WKY-NC組的血脂(TC、TG與LDL-C)高于SHR-HF組，但WKY大鼠的心腎靶器官并未出現(xiàn)明顯損傷，表明SHR-HF組造模成功。綜合可見，本課題構(gòu)建的HP/HL-SHR模型不僅可以模擬HP/HL的臨床表現(xiàn)，更能直觀的模擬出合并癥對(duì)于靶器官的損傷作用。

目前關(guān)于HP/HL造模的文獻(xiàn)往往只是簡(jiǎn)單選擇血壓、血脂作為造模成功與否評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)， 缺少對(duì)心腎靶器官的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。本課題不僅成功構(gòu)建了HP/HL-SHR模型，還進(jìn)一步對(duì)腎臟、心臟組織的具

體病變損傷情況進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究分析；結(jié)果提示，所造動(dòng)物模型可直觀表征出HP/HL對(duì)心腎靶器官的損害，可為治療HP/HL并改善心腎系統(tǒng)損傷的藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

[ 1 ] Han TS, Lean ME. A clinical perspective of obesity, metabolic syndrome and cardiovascular disease [J]. JRSM Cardiovasc Dis, 2016, 5: 1-13.

[ 2 ] Bernhardi RV, Zanlungo S, Arrese M, et al. The metabolic syndrome: from an aggravating condition to a pathogenic risk factor for chronic diseases [J]. Revista Medica De Chile, 2010, 138(8): 1012-9.

[ 3 ] 陳偉偉, 高潤(rùn)霖, 劉力生, 等. 《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》概要 [J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2016, 31(6): 521-528.

[ 4 ] Bundy JD, He J. Hypertension and related cardiovascular disease burden in China [J]. Annals Global Health, 2016, 82(2): 227-233.

[ 5 ] 殷玥琪, 楊立剛, 孫桂菊. 高脂血癥與高血壓相關(guān)性及其代謝異常研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)老年學(xué), 2014, 34(5): 1414-1417.

[ 6 ] 鄭婧. 自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-97a與TGF-β1蛋白表達(dá)的改變及意義 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 26(11): 72-76.

[ 7 ] 謝亞菲, 蔣學(xué)華, 王凌, 等. Dunkin Hartley白化豚鼠和Hartley花色豚鼠高脂造模以及降脂藥效學(xué)的比較 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(9): 56-61.

[ 8 ] 劉曉敏, 陳虹. “二腎一夾”復(fù)合高脂灌胃法建立高血壓復(fù)合高脂血癥大鼠模型 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2008, 19(2): 306-307.

[ 9 ] 程軼群, 李曉輝. 若干實(shí)驗(yàn)性高血壓大鼠模型的介紹 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 16(5): 305-308..

[ 10 ] Jang SM, Yee ST, Choi J, et al. Ursolic acid enhances the cellular immune system and pancreatic beta-cell function in streptozotocin-induced diabetic mice fed a high-fat die t[J]. Int Immunopharmacol, 2009, 9(1): 113-119.

[ 11 ] Knight SF, Quigley JE, Yuan J, et al. Endothelial dysfunction and the development of renal injury in spontaneously hypertensive rats fed a high-fat diet [J]. Hypertension, 2008, 51: 352-359.

[ 12 ] 夏曉莉, 陳伯鈞, 劉泉穎, 等. 利用自發(fā)性高血壓大鼠建立營(yíng)養(yǎng)性高血壓肥胖模型的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2009, 18(8): 945-947.

[ 13 ] Knight SF, Yuan J, Roy S, et al. Simvastatin and tempol protect against endothelial dysfunction and renal injury in a model of obesity and hypertension [J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2010, 298(1): F86-94.

[ 14 ] Chung HW, Lim JH, Kim MY, et al. High-fat diet-induced renal cell apoptosis and oxidative stress in spontaneously hypertensive rat are ameliorated by fenofibrate through the PPARα-FoxO3a-PGC-1α pathway [J]. Nephrol Dial Transplant, 2012, 27: 2213-2225.

[ 15 ] Chung S, Park CW, Shin SJ, et al. Tempol or candesartan prevents high-fat diet-induced hypertension and renal damage in spontaneously hypertensive rats [J]. Nephrol Dial Transplant, 2010, 25: 389-399.