全長與成熟形式IL-37b的真核表達載體的構建與研究

李夢媛，韋榮飛，楊星九，朱瑞敏，高 苒

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100121)

IL-37是IL-1家族細胞因子，曾經被命名為IL-1F7[1]，在人體多種組織、器官中都有表達；在多種人源細胞系中也能夠檢測到IL-37，如THP-1、U937、A431、IMTLH、KG -1、HL60、HPBMC、HPT4和NHDC細胞等[2-4]。小鼠體內并未發(fā)現(xiàn)IL-37同類細胞因子的表達[5]，因此小鼠及其來源的細胞系能夠排除背景干擾，作為較理想的對象應用于IL-37的研究。IL-37共有6個外顯子，IL-37b是IL-37五種亞型a～e中序列最長的一個，全長的IL-37b共有218個氨基酸，含有外顯子1、2、4、5、6[6]，并在1號外顯子處有caspase-1酶切位點，能夠經其切割轉變?yōu)槌墒煨问降腎L-37b[7]，下文中分別將二者命名為FL-IL-37b(full-length-IL37b)與M-IL-37b(mature-IL-37b)。目前，大量研究已證明IL-37b具備生物學活性，能夠作為炎癥抑制因子在多種炎癥性疾病中發(fā)揮功能，同時，這些疾病引起的炎癥反應也能夠上調IL-37b的表達[8-12]。本實驗中構建的IL-37b真核表達載體旨在為人類炎癥性疾病病理機制的研究提供基礎，并為疾病的治療方案提供潛在的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

含有全長IL-37b編碼區(qū)基因的質粒pUBC 2(+)以及載體質粒pEGFP N1由本實驗室制備保存。

T4連接酶、限制性內切酶購自NEB公司；DNA分子量marker、PCR Premix Taq購自TaKaRa公司；RAW 264.7細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所；IL-37抗體購自Abcam公司；HRP標記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物公司；LPS(Lipopolysaccharide)購自Sigma公司；轉染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；預染蛋白分子量marker、反轉錄試劑盒、8孔腔室載玻片等購自Thermo公司；質粒提取試劑盒購自Qiagen公司；SYBR green real-time PCR Master Mix購自Toyobo公司；熒光定量PCR儀專用96孔板與封板膜購自ABI公司；實時熒光定量PCR儀為ABI Step One Plus Real-Time PCR System；共聚焦顯微鏡為Leica Microsystems；引物合成與DNA測序服務由英濰捷基(上海)公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 IL-37b基因的克隆與pEGFP N1/IL-37b真核表達載體的構建

全長與成熟形式的IL-37b基因模板來自本實驗室制備的含IL-37b全長編碼區(qū)基因的質粒pUBC/IL-37b。以該質粒為模板，通過PCR技術對FL-IL-37b與M-IL-37b編碼區(qū)基因進行擴增。上、下游引物序列見表1，下劃線為EcoR I和Xho I酶切位點，PCR反應條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，擴增30個循環(huán)；72℃延伸10 min，預計目的基因片段大小分別為654 bp、519 bp。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，并對目的條帶DNA進行回收，用于連接構建真核表達載體。用限制性內切酶EcoR I和Xho I分別對目的基因的PCR產物與表達載體pEGFP N1進行雙酶切，再次進行瓊脂糖凝膠電泳，通過膠回收純化收集酶切產物，于16℃環(huán)境過夜連接，構建表達載體。次日，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，吸取約200 μL轉化液均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑選若干菌落進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果后，將陽性克隆進行DNA測序，鑒定IL-37b基因片段是否正確插入，陽性克隆質粒命名為pEGFP N1/IL37b。

表1 IL-37b基因引物序列

1.2.2 RAW 264.7細胞的培養(yǎng)與表達載體的轉染

將RAW 264.7細胞制成濃度為每毫升5×104個的細胞懸液，分別接種于8孔腔室載玻片與12孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)至細胞貼壁。按照轉染試劑Lipofectamine2000說明書步驟將pEGFP N1/IL-37b質粒轉染至8孔腔室載玻片與培養(yǎng)板的細胞中。轉染完畢更換培養(yǎng)基后加入工作濃度為500 ng/mL的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h。

1.2.3 Western blot檢測轉染后細胞中IL-37b蛋白的表達

收集12孔培養(yǎng)板中的細胞，用RIPA裂解液裂解并提取蛋白。配制濃度為12%～15%的分離膠，將細胞裂解液進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后進行轉膜，將蛋白條帶電轉至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，減少非特異性結合后，按1∶1000的比例用IL-37抗體4℃孵育過夜。次日，用0.1%的PBST洗膜，加入按1∶5000比例稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG，室溫作用1 h。洗膜后加顯影液，觀測蛋白條帶。

1.2.4 共聚焦顯微鏡檢測轉染后細胞中IL-37b的表達與定位

棄去8孔腔室載玻片中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞后，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min。洗去多余的固定液，用0.2%的Triton X-100冰上通透細胞10 min。再次洗滌細胞后，用DAPI避光孵育細胞10 min，對細胞核進行染色。染色后用PBS洗滌細胞一次，除去8孔腔室，留下下方有細胞貼附的載玻片，用中性樹脂封片。待中性樹脂晾干后，在Leica共聚焦顯微鏡下觀察細胞中FL-IL-37b與M-IL-37b的表達情況并拍照記錄。

1.2.5 Real-time PCR檢測轉染細胞中IL-37b的抑制作用

收集12孔細胞培養(yǎng)板中的細胞，按照TRIzol說明書與Thermo反轉錄試劑盒說明書的步驟提取細胞總RNA，并對RNA進行反轉錄，獲得cDNA。通過real-time PCR檢測細胞中IL-6的相對表達量。GAPDH與IL-6基因的引物序列如表2所示，real-time PCR的反應體系如表3所示，反應條件為：保溫，95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，擴增40個循環(huán)；熔解曲線為60℃～95℃升溫。

表2 Real-time PCR引物序列

表3 Real-time PCR反應體系

1.3 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism V.5.0軟件對數據進行t檢驗及統(tǒng)計學分析，計量資料以平均數±標準差(x±s)表示，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 IL-37b基因的PCR擴增產物與重組質粒的鑒定

M-IL-37b與FL-IL-37b基因的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，在500～750 bp之間有兩條明亮的條帶，一條接近500 bp，為M-IL-37b基因擴增的產物；另一條約在650 bp附近，為FL-IL-37b基因擴增的產物，與預期的目的基因大小相符。重組質粒單克隆菌落PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，陽性的菌落在與M-IL-37b與FL-IL-37b基因相近的位置各有一條明亮的特異性條帶。對陽性克隆菌落進行DNA測序，結果顯示IL-37b基因片段正確插入pEGFP N1質粒，堿基無突變，可進行下一步的轉染實驗。

注：M：Marker；1：成熟IL-37b；2：全長IL-37b；3：陰性對照；4：成熟IL-37b陽性克隆菌落；5：全長IL-37b陽性克隆菌落。圖1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳Note.M：Marker.1:M-IL-37b.2:FL-IL-37b.3:Negative control. 4: Positive colony of M-IL-37b. 5: Positive colony of FL-IL-37b.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products

2.2 重組表達載體在細胞中的表達

2.2.1 Western blot檢測轉染后細胞中IL-37b蛋白的表達

如圖2所示，給予LPS刺激后，轉染的RAW 264.7細胞裂解液的Western blot結果顯示，有兩條特異性的蛋白條帶，位置分別在25 kDa與15 kDa附近，分別為FL-IL-37b與M-IL-37b，條帶大小與預期結果相符[8,13]。證實轉染后的RAW 264.7細胞中有M-IL-37b與FL-IL-37b的表達。

圖2 轉染的RAW 264.7細胞中IL-37b的表達Fig.2 Expression of IL-37b protein in the transfected RAW 264.7 cells

2.2.2 共聚焦顯微鏡檢測轉染后細胞中IL-37b的表達與定位

如圖3所示，綠色為融合了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的IL-37b，藍色為DAPI染色的細胞核。轉染后，M-IL-37b主要在細胞核中表達，F(xiàn)L-IL-37b則在細胞質、細胞核中都有表達；LPS能夠在一定程度上誘導IL-37b表達上調。

圖3 帶GFP標簽的IL-37b在RAW 264.7細胞中的表達Fig.3 Expression of IL-37b with GFP tag in the transfected RAW 264.7 cells

2.3 Real time-PCR檢測轉染后的RAW 264.7細胞對于LPS刺激的抑制作用

如圖4所示，real-time PCR結果顯示轉染pEGFP N1/IL-37b質粒的RAW 264.7細胞對于LPS刺激引起的促炎性細胞因子IL-6的表達有抑制作用，與轉染空質粒載體的對照組相比差異顯著，并且FL-IL-37b對于IL-6的抑制作用稍強于M-IL-37b。證實轉染的IL-37b能夠穩(wěn)定表達并在細胞內發(fā)揮炎癥抑制作用。

注：與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 LPS刺激轉染的RAW 264.7細胞中IL-6的表達(n=3)Note.Compared with the LPS group，*P<0.05；**P<0.01.Fig.4 Expression of IL-6 mRNA in the transfected RAW 264.7 cells stimulated by LPS

3 討論

Bulau等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IL-37b的1號外顯子能夠編碼caspase-1酶切位點，IL-37b前體分子需要caspase-1切割修飾才能成為成熟分子移入細胞核參與轉錄調控；突變導致caspase-1失活后，IL-37b不能進入細胞核，并且對炎癥反應的抑制作用降低。成熟形式的IL-37b進入細胞核后，能夠與Smad 3 (mothers against decapentaplegic homolog 3)結合形成功能性復合物影響基因轉錄，并抑制Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)誘導表達促炎癥性細胞因子，從而抑制樹突狀細胞的活化以及相應的免疫應答反應[8,14]。成熟形式的IL-37b的向細胞外分泌同樣需要caspase-1的作用，但LPS誘導的巨噬細胞分泌IL-37b前體分子的過程不依賴caspase-1[7,14]。用相應的中和抗體中和IL-37b轉基因小鼠體內的IL-37b，并注射LPS誘導感染性休克，小鼠血清中IL-6的表達顯著升高，表明IL-37b的作用受到抗體拮抗，因而證實IL-37b能夠分泌到細胞外發(fā)揮作用，說明其在細胞內外環(huán)境中具有雙向功能[7]。

同為IL-1家族細胞因子的IL-18與其受體IL-18R結合形成的復合物能夠誘導IFN-γ表達。IL-37b與IL-18有很高的同源序列，無論是全長還是成熟形式的IL-37b都能夠與IL-18R的α鏈產生結合，且成熟形式IL-37b的結合能力較全長形式更強。但IL-18與IL-18Rα的結合能力比IL-37b成熟分子更強，因此IL-37b不能拮抗IL-18的功能。IL-18BP(IL-18 binding protein)是IL-18的天然抑制劑，能夠抑制IL-18與IL-18R的結合；成熟形式的IL-37b可以與IL-18BP結合，增強IL-18BP對IL-18信號轉導的抑制，從而抑制IFN-γ的表達[15-16]。近年來也有研究顯示IL-37b發(fā)揮作用需要IL-1家族細胞因子受體IL-1R8參與，IL-1R8可能與IL-18Rα一樣作為IL-37b的受體參與免疫應答。此外，IL-37b還能夠通過抑制STAT1-4、c-Jun、p38 MARK、ERK等信號分子的磷酸化來調控促炎信號的傳導[17]。

本實驗中構建的真核表達載體pEGFP N1/IL-37b含有SV40和CMV啟動子及GFP標簽，能夠穩(wěn)定表達外源基因并有利于檢測基因的轉染效率。同時，GFP有利于檢測全長與成熟形式的IL-37b在不同細胞器中的定位。實驗中采用的RAW 264.7細胞系小鼠來源的單核巨噬細胞，自身并無IL-37表達，能夠排除以人源細胞系作為研究對象產生的背景干擾。LPS在體內與體外都能夠誘導大量促炎性細胞因子的表達[8]，同時，在LPS刺激細胞后，IL-37b mRNA和蛋白的表達水平上調，表明LPS能夠使IL-37b mRNA趨于穩(wěn)定[16]。Western blot與共聚焦顯微鏡觀測結果顯示構建的FL-IL-37b與M-IL-37b的真核表達載體轉染后經LPS誘導均可表達FL-IL-37b與M-IL-37b，其中M-IL-37b主要在定位于細胞核中，F(xiàn)L-IL-37b則在細胞質、細胞核中都有表達。Real-time PCR結果顯示轉染后的細胞中LPS誘導的IL-6的表達降低，表明轉染后FL-IL-37b與M-IL-37b能夠在細胞中發(fā)揮炎癥抑制作用。上述結果與已報導的文獻中的數據相符，證實構建的pEGFP N1/IL-37b能夠穩(wěn)定的表達相應的IL-37b，為進一步研究IL-37b在炎癥反應中的發(fā)揮的作用及其細胞內外機制提供了便利。

[1] Dinarello C, Arend W, Sims J, et al. IL-1 family nomenclature [J]. Nat Immunol，2010，11(11): 973.

[2] Akdis M, Burgler S, Crameri R, et al. Interleukins,1 to 37,and interferon-γ：Receptors,functions,and roles in disease[J]．J Allergy Clin Immunol,2011,127(3):701-721．

[3] Gao W, Kumar S, Lotze MT, et al. Innate immunity mediated by the cytokine IL-1 homologue 4 (IL-1H4/IL-1F7) induces IL-12-dependent adaptive and profound antitumor immunity [J]. J Immunol, 2003, 170(1): 107-113.

[4] Kumar S, Hanning CR, Brigham-Burke MR, et al. Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspase-1 and mature IL-1F7B binds to the IL-18 receptor but does not induce IFN-gamma production [J]. Cytokine,2002,18(2): 61-71.

[5] Boraschi D, Lucchesi D, Hainzl S, et al. IL-37: a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family [J]．Eur Cytokine Netw, 2011, 22(3): 127-147．

[6] Kumar S, McDonnell PC, Lehr R, et al. Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family [J]. J Biol Chem, 2000, 275(14): 10308-10314.

[7] Bulau AM, Nold MF, Li S, et al. Role of caspase-1 in nuclear translocation of IL-37, release of the cytokine, and IL-37 inhibition of innate immune responses [J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(7): 2650-2655.

[8] Nold MF, Nold-Petry CA, Zepp JA, et al. IL-37 is a fundamental inhibitor of innate- immunity [J]. Nat Immunol, 2010, 11(11): 1014-1022.

[9] McNamee EN, Masterson JC, Jedlicka P, et al. Interleukin 37 expression protects mice from colitis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(40): 16711-16716.

[10] Zhao PW, Jiang WG, Wang L, et al. Plasma levels of IL-37 and correlation with TNF-a, IL-17A, and disease activity during DMARD treatment of rheumatoid arthritis [J]. PLoS One, 2014, 9(5): e95346.

[11] Bulau AM, Fink M, Maucksch C, et al. In vivo expression of interleukin-37 reduces local and systemic inflammation in concanavalin A-induced hepatitis [J]. Sci World J, 2011, 11: 2480-2490.

[12] Lunding L,Webering S, Vock C, et al. IL-37 requires IL-18Ra and SIGIRR/IL-1R8 to diminish allergic airway inflammation in mice [J]. Allergy, 2015, 70(4): 366-373.

[13] Smith DE, Renshaw BR, Ketchem RR, et al. Four new members expand the interleukin-1 superfamily [J]. J Biol Chem, 2000, 275(2): 1169-1175.

[14] Sharma S, Kulk N, Nold MF, et al. The IL-1 family member 7b translocates to the nucleus and down-regulates proinflammatory cytokines [J]. J Immunol, 2008, 180(8): 5477-5482.

[15] Bufler P, Azam T, Gamboni-Robertson F, et al. A complex of the IL-1 homologue IL-1F7b and IL-18-binding protein reduces IL-18 activity [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(21): 13723-13728.

[16] Bufler P, Gamboni-Robertson F, Azam T, et al. Interleukin-1 homologues IL-1F7b and IL-18 contain functional mRNA instability elements within the coding region responsive to lipopolysaccharide [J]. Biochem J, 2004, 381(Pt2): 503-510.

[17] Li S, Neff CP, Barber K, et al. Extracellular forms of IL-37 inhibit innate inflammation in vitro and in vivo but require the IL-1 family decoy receptor IL-1R8 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(8): 2497-2502.