實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系遺傳質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)的研究

吳端生，劉 娟，張朝暉

(1.南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，湖南 衡陽(yáng) 421001； 2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001； 3.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目前，國(guó)際上常用的實(shí)驗(yàn)魚類有斑馬魚、青鳉、虹鱒、劍尾魚等10余種[1-7]，國(guó)內(nèi)科技工作者還常使用稀有鮈鯽、鯉魚、金魚、鯽魚(紅鯽)等10余種[1-5]。然而，具有中國(guó)本土特色的標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)魚類卻非常缺乏。目前，稱得上中國(guó)本土“準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)”實(shí)驗(yàn)魚類的只有實(shí)驗(yàn)稀有鮈鯽和實(shí)驗(yàn)紅鯽。

實(shí)驗(yàn)紅鯽是由紅鯽馴化而來(lái)，紅鯽是鯽的變種，分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域，屬于我國(guó)的本土魚類。吳端生等[8-10]經(jīng)過(guò)多年研究，發(fā)現(xiàn)紅鯽作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有體型較小、繁殖力強(qiáng)、雜食性、紅體色等優(yōu)點(diǎn)，并成功培育出實(shí)驗(yàn)紅鯽近交品系，命名為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系。2016年12月湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局[11]發(fā)布了《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系遺傳質(zhì)量控制》湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)(以下簡(jiǎn)稱本標(biāo)準(zhǔn))。本文報(bào)道本標(biāo)準(zhǔn)的研究與編制發(fā)布的過(guò)程。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制的目的與意義

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與科技進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)魚類在生物醫(yī)藥、水生態(tài)毒理學(xué)、水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治、水產(chǎn)藥物研制等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多[1-7]，尤其在化學(xué)品、農(nóng)藥、除草劑、化肥及工業(yè)排污的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)中顯得特別重要[12-14]。加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)魚類標(biāo)準(zhǔn)化研究、建立實(shí)驗(yàn)魚類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)魚類法制化、標(biāo)準(zhǔn)化管理體系的需要, 有助于提升實(shí)驗(yàn)魚類的科技水平和對(duì)科技創(chuàng)新的支撐能力與服務(wù)水平, 并依法為實(shí)驗(yàn)魚類行政許可、行政執(zhí)法管理提供技術(shù)保障和科學(xué)依據(jù)[15]。目前，我國(guó)還沒(méi)有本土實(shí)驗(yàn)魚類的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，編制發(fā)布的本標(biāo)準(zhǔn)是我國(guó)本土實(shí)驗(yàn)魚類的第一個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)，為規(guī)范實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系的保種及生產(chǎn)，開展遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)規(guī)范和法規(guī)依據(jù)，并為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系的應(yīng)用提供了標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。

2 標(biāo)準(zhǔn)編制的依據(jù)和原則

本標(biāo)準(zhǔn)編制的依據(jù)是國(guó)家和湖南省的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)。《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》第七條規(guī)定：“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)、微生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)和飼養(yǎng)環(huán)境等方面的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局制定”；《湖南省實(shí)施<實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例>辦法》第二十四條規(guī)定：“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)應(yīng)當(dāng)執(zhí)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；尚未制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的，執(zhí)行相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者地方標(biāo)準(zhǔn)”。本標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)參數(shù)取自于作者多年來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)紅鯽標(biāo)準(zhǔn)化研究的成果和本標(biāo)準(zhǔn)研究的驗(yàn)證性試驗(yàn)[10,16]。

本標(biāo)準(zhǔn)的編制遵循科學(xué)性、先進(jìn)性和可操作性原則，力求內(nèi)容及表述的簡(jiǎn)明和準(zhǔn)確，并充分考慮我國(guó)和我省的實(shí)情，適應(yīng)我國(guó)科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平。標(biāo)準(zhǔn)文本格式按照《標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》(GB/T 1.1—2009)[17]給出的規(guī)則起草，內(nèi)容的編寫參照了國(guó)內(nèi)同類標(biāo)準(zhǔn)[18-20]。

3 標(biāo)準(zhǔn)編制與發(fā)布的過(guò)程

本標(biāo)準(zhǔn)的編制工作于2012年獲得湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局的立項(xiàng)(湘質(zhì)監(jiān)發(fā)[2012]531號(hào))。隨即，成立了標(biāo)準(zhǔn)“編制委員會(huì)”和“起草小組”。然后經(jīng)過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn)、文獻(xiàn)調(diào)研、同行專家咨詢等過(guò)程，起草了本標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明，分別征求省內(nèi)外同行專家提出修改意見(jiàn)。再根據(jù)專家修改意見(jiàn)，形成本標(biāo)準(zhǔn)的送審稿。湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局標(biāo)準(zhǔn)化處組織召開專家審查會(huì)，對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)送審稿逐條地進(jìn)行了審查。再根據(jù)專家審查會(huì)的綜合意見(jiàn)，形成本標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿。最后，經(jīng)湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦公室推薦，報(bào)湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)，于2016年12月發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)，即《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系質(zhì)量控制》(DB43/T 1191—2016)[11]。

4 本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容及主要技術(shù)參數(shù)

本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容包括前言、范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、主要生物學(xué)特性、繁殖方法、養(yǎng)殖環(huán)境、遺傳學(xué)質(zhì)量檢測(cè)及附錄A、B、C等。其中，主要生物學(xué)特性部分對(duì)外形、可數(shù)性狀、可量性狀、解剖特征、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖生理特性、染色體數(shù)目與核型、體色標(biāo)記、生化遺傳標(biāo)記、DNA分子標(biāo)記等內(nèi)容進(jìn)行了表述。繁殖方法部分對(duì)育種繁殖方法、保種繁殖方法、生產(chǎn)繁殖方法等內(nèi)容進(jìn)行了規(guī)定。養(yǎng)殖環(huán)境部分對(duì)水環(huán)境指標(biāo)、飼養(yǎng)密度等內(nèi)容進(jìn)行了規(guī)定。遺傳學(xué)質(zhì)量檢測(cè)部分對(duì)抽樣方法和檢測(cè)頻率、性狀測(cè)定、體色分析、染色體核型檢測(cè)、生化遺傳標(biāo)記檢測(cè)、DNA分子標(biāo)記檢測(cè)、結(jié)果判斷等內(nèi)容進(jìn)行了規(guī)定。

按照遺傳學(xué)原理，并參考哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和養(yǎng)殖魚類種質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)[18-28]，本標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)紅鯽標(biāo)準(zhǔn)化研究和驗(yàn)證性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別采納了分類形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、同工酶、血液生化、DNA分子標(biāo)記等方面的技術(shù)參數(shù)。

4.1 分類形態(tài)學(xué)特性

體色全紅，身體側(cè)扁，全鱗，口端位，無(wú)須，單尾。3 月齡以下的個(gè)體體色為青灰色，3 月齡以上的個(gè)體體色逐漸轉(zhuǎn)為紅色。

4.2 生長(zhǎng)與繁殖特性

在普通環(huán)境條件下飼養(yǎng)，1年齡的實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系平均體長(zhǎng)約66 mm，平均體重約12 g。2年齡的實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系平均體長(zhǎng)約113 mm，平均體重約34 g。

1年齡即達(dá)性成熟，屬于一年多次產(chǎn)卵類型，性成熟的雌性紅鯽在生殖季節(jié)里卵巢系數(shù)達(dá)16%～21%。

4.3 染色體數(shù)目與核型

體細(xì)胞染色體數(shù)2n=100。核型：中部著絲粒染色體(m組)11對(duì)，亞中部著絲粒染色體(sm組)15 對(duì)，亞端部著絲粒染色體(st組)12對(duì)，端部著絲粒染色體(t組)12 對(duì)，染色體臂數(shù)(NF)152。

4.4 遺傳標(biāo)記

4.4.1 體色標(biāo)記

紅體色為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系體色基因純合時(shí)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記。

4.4.2 生化遺傳標(biāo)記

血清蛋白聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳圖譜具有SP-A1、SP-B7 和SP-B8特征帶，此為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系的血清蛋白標(biāo)記。

紅細(xì)胞酯酶同工酶(EST)和超氧化物歧化酶同工酶(SOD)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中，EST-1、EST-3 酶帶和SOD-3、SOD-8酶帶分別為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD 系特有的酯酶同工酶標(biāo)記和超氧化物歧化酶同工酶標(biāo)記。

4.4.3 DNA分子標(biāo)記

序列為“GACTAAGCCC”的隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，長(zhǎng)度為2100 bp 的DNA電泳條帶，為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD 系的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(RAPD)。

序列為“3′ATTGTGAAGCATCGGTAATGC和5′TACTTGATTTGCTATTGGAC”引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中，長(zhǎng)度為67 bp 的DNA電泳條帶，為實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系的微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)。

5 遺傳質(zhì)量控制方法

按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化管理要求，本標(biāo)準(zhǔn)從保種繁殖和種群遺傳質(zhì)量?jī)煞矫嬉?guī)定了實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系的遺傳質(zhì)量控制方法。

5.1 種子保存方法

根據(jù)遺傳學(xué)原理，應(yīng)選擇科學(xué)的保種繁殖方法來(lái)保持實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD 系的同基因性及其基因純合性。因此，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，將實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系設(shè)立為基礎(chǔ)群和生產(chǎn)群，以基礎(chǔ)群保種。從基礎(chǔ)群中挑選健壯的2 年齡雌性實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系，采用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)進(jìn)行繁殖生產(chǎn)，其子代用于構(gòu)建實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD 系下一代的基礎(chǔ)群，如此傳代。

5.2 繁殖生產(chǎn)

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，生產(chǎn)群用于繁殖生產(chǎn)。生產(chǎn)群的實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系以人工授精方法進(jìn)行隨機(jī)交配繁殖，且繁殖代數(shù)不得超過(guò)3代。

5.3 遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)

5.3.1 保種繁殖的監(jiān)控

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每一世代均采用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)進(jìn)行保種繁殖。繁殖生產(chǎn)過(guò)程中設(shè)置繁殖記錄(卡)、繁殖系譜和繁殖生產(chǎn)臺(tái)賬，并有完整的記錄。

5.3.2 遺傳質(zhì)量檢測(cè)

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，對(duì)每1世代的每1繁殖批次的實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系進(jìn)行1次遺傳質(zhì)量檢測(cè)。

首先對(duì)實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系體色進(jìn)行檢測(cè)。如果體色是灰色或不全部是紅色，則判定為不合格。對(duì)體色全部為紅色的個(gè)體，再進(jìn)行可數(shù)性狀檢測(cè)。當(dāng)體色檢測(cè)結(jié)果和可數(shù)性狀檢測(cè)結(jié)果均符合本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可初步判定為合格?？蓴?shù)性狀檢測(cè)結(jié)果可疑或有必要時(shí)，再進(jìn)行生化遺傳標(biāo)記或DNA標(biāo)記的檢測(cè)，必要時(shí)進(jìn)行染色體核型的檢測(cè)。對(duì)被檢個(gè)體的體色、可數(shù)性狀、生化遺傳標(biāo)記或DNA 標(biāo)記等項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果均符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的，則判定為合格。

6 討論

6.1 國(guó)內(nèi)外同類標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀

國(guó)內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚類標(biāo)準(zhǔn)的研究始于本世紀(jì)初，主要集中在劍尾魚、斑馬魚、實(shí)驗(yàn)紅鯽、蝦虎魚、稀有鮈鯽等。

2000年左右，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所吳淑勤等就開始了劍尾魚標(biāo)準(zhǔn)的研究。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部[19]于2012年3月1日發(fā)布了《劍尾魚 RR-B系》中華人民共和國(guó)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T1115-2012)，2012年6月1日實(shí)施。

2007 年，國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所聯(lián)合中國(guó)食品藥品檢定研究院、中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、北京大學(xué)等單位，開展了實(shí)驗(yàn)用魚地方標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)研究[15,29-32]。由北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局[20,33-37]于2013年正式頒布了《實(shí)驗(yàn)用魚》北京市地方系列標(biāo)準(zhǔn)(DB11/T 1053.1-2013～DB11/T 1053.6-2013)，并于2014年4月1日開始實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)主要適用于斑馬魚和劍尾魚，包括微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、遺傳質(zhì)量控制、配合飼料技術(shù)要求、環(huán)境條件、病理診斷規(guī)范等六個(gè)部分的內(nèi)容。

最近，柯賢福等[38]在應(yīng)用斑馬魚的基礎(chǔ)上，也開展了斑馬魚的環(huán)境設(shè)施、養(yǎng)殖用水及飼料標(biāo)準(zhǔn)等研究，以期建立實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)。

2013年，以稀有鮈鯽為標(biāo)準(zhǔn)供試生物的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 29763-2013 化學(xué)品稀有鮈鯽急性毒性試驗(yàn)》由上海市檢測(cè)中心聯(lián)合原環(huán)境保護(hù)部化學(xué)品登記中心、中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所等5 家單位共同研制完成，并正式頒布實(shí)施[39-40]。2014年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)又批準(zhǔn)了由上海市檢測(cè)中心牽頭的六家單位共同參與《化學(xué)品稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制工作(項(xiàng)目編號(hào)20140324-T-469)[40]。

2009年，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所向全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)申報(bào)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 魚類環(huán)境與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》編制并獲得立項(xiàng)(編號(hào)20091329-T-469)。2014年底，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所等5家單位起草完成了《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 魚類環(huán)境與質(zhì)量控制》等5個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)送審稿。該標(biāo)準(zhǔn)主要適用于斑馬魚、劍尾魚和諸氏鯔蝦虎魚。

尚未檢索到國(guó)外的實(shí)驗(yàn)魚類標(biāo)準(zhǔn)。不過(guò)，美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所等編寫的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》相當(dāng)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，它對(duì)科研、測(cè)試和培訓(xùn)用的實(shí)驗(yàn)魚類在水生小環(huán)境和大環(huán)境、水質(zhì)、生命維持系統(tǒng)、溫度、濕度和通風(fēng)、照明、噪音與振動(dòng)和飼養(yǎng)與管理等方面均有較詳細(xì)的規(guī)定[41]。類似的還有《歐洲保護(hù)用于實(shí)驗(yàn)和其他用途的脊椎動(dòng)物公約》等[42-44]。

6.2 本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施

本標(biāo)準(zhǔn)于2016年12月29日由湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布，于2017年2月28日開始實(shí)施[11]。因?yàn)閷?shí)施的時(shí)間不久，未見(jiàn)有用戶不良反映，政府主管部門也尚未將實(shí)驗(yàn)紅鯽納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證管理范圍。

6.3 建議與展望

值得注意的是，單一的遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不利于實(shí)驗(yàn)紅鯽的應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)的推廣，還應(yīng)該編制完善的實(shí)驗(yàn)紅鯽標(biāo)準(zhǔn)系列。業(yè)內(nèi)人士指出，實(shí)驗(yàn)魚類疾病的控制和健康狀況的維持是實(shí)驗(yàn)魚類標(biāo)準(zhǔn)化研究的核心內(nèi)容和首要環(huán)節(jié)[38,45]。實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系的微生物與寄生蟲學(xué)質(zhì)量控制和環(huán)境質(zhì)量控制是制約本標(biāo)準(zhǔn)推廣的關(guān)鍵因素。所以，要全面實(shí)施和推廣本標(biāo)準(zhǔn)，還必須相應(yīng)編制《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》、《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系環(huán)境及控制》和《實(shí)驗(yàn)魚類 實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系飼料營(yíng)養(yǎng)及配合技術(shù)》等標(biāo)準(zhǔn)系列。目前，這幾部標(biāo)準(zhǔn)的研究工作正在進(jìn)行，預(yù)計(jì)2年內(nèi)完成。

實(shí)驗(yàn)紅鯽C1HD系作為一種標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)魚類，將有望在水生態(tài)毒理學(xué)、水產(chǎn)動(dòng)物疾病模型、化學(xué)品環(huán)境測(cè)試、農(nóng)藥與重金屬等環(huán)境污染檢測(cè)等方面得到很好的推廣應(yīng)用[10]。未來(lái)，政府主管部門有必要資助建立國(guó)家或省級(jí)實(shí)驗(yàn)紅鯽保種繁育中心，并立項(xiàng)編制《實(shí)驗(yàn)紅鯽》國(guó)家系列標(biāo)準(zhǔn)。

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