利用人工ta-siRNA策略培育抗PVY煙草

吳斌 姜珊珊 張眉 徐德坤 辛志梅 王升吉

摘要：人工ta-siRNA基因沉默技術(shù)具有同時表達多個ta-siRNA和產(chǎn)生ta-siRNA位置固定等特點，在精確性和高效性等方面有明顯優(yōu)勢。本研究以馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）外殼蛋白（coat protein，CP）為靶基因，選取不同位置的3個siRNA為靶序列，煙草TAS3a作為ta-siRNA表達的骨架，分別構(gòu)建植物表達載體PVY-CP5′、PVY-CPM和PVY-CP3′，并利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。瞬時表達檢測結(jié)果顯示，3個syn-tasiRNA植物表達載體均能在植物體內(nèi)成功表達siRNA;抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PVY-CP5′、PVY-CPM和PVY-CP3′的轉(zhuǎn)基因株系中抗病株系的比率分別為45.08%、27.21%、61.90%;Northern雜交分析顯示，目的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（總RNA）的積累量與植株的抗病性呈負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)基因植株中均有siRNA存在，表明植株的病毒抗性是由RNA介導(dǎo)的。

關(guān)鍵詞：人工ta-siRNA;馬鈴薯Y病毒（PVY）;RNA介導(dǎo)的病毒抗性;轉(zhuǎn)基因煙草

中圖分類號：S572.034文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）12-0086-05

RNA沉默是植物調(diào)控內(nèi)源基因表達和防御外源核酸入侵的重要機制，其根本就是產(chǎn)生小RNA整合到RNA沉默復(fù)合體中介導(dǎo)靶RNA的降解或抑制其翻譯[1]。其中Trans-acting siRNAs作為植物中起反式調(diào)控作用的一類siRNA[2]，在植物生長發(fā)育過程中具有重要的表達調(diào)控功能。目前為止，在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)4個編碼ta-siRNA的TAS基因家族[3]，其中TAS1和TAS2依賴于miR173的剪切作用，TAS3依賴于miR390的剪切作用，TAS4依賴于miR828的剪切作用。研究發(fā)現(xiàn)，TAS3基因中同時存在2個miRNA靶位點，對ta-siRNA的正確形成是必需的[4， 5]，同時，TAS3基因中miR390靶位點及兩個相連的ta-siRNA產(chǎn)生位點高度保守，目前在番茄、煙草、水稻、草莓等植物中均發(fā)現(xiàn)了TAS3的同源基因[6， 7]。

在此基礎(chǔ)上一種新的植物基因沉默技術(shù)——人工trans-acting siRNA（synthetic trans-siRNA， syn-tasiRNA）建立起來，通過替換ta-siRNA序列進而干涉其他靶基因[8]，其在精確性和高效性等方面有了新突破[9， 10]。de la Luz Gutiérrez-Nava等在擬南芥中用靶向FAD2的人工ta-siRNA序列替換內(nèi)源ta-siRNA，有效抑制了FAD2基因的表達，達到基因沉默的效果[11];Montgomery等借助人工ta-siRNA成功抑制了擬南芥PDS基因的表達，發(fā)現(xiàn)替換TAS1c的miR173靶位點3′端的序列后能夠產(chǎn)生次級siRNA，為單個syn-tasiRNA抑制多基因表達提供理論依據(jù)[12];Carbonell等針對擬南芥TAS1c建立了更為有效、更易于操作的沉默體系[13]。syn-tasiRNA的應(yīng)用多見于擬南芥中TAS1的應(yīng)用，Montgomery等利用擬南芥TAS3a成功抑制了擬南芥PDS基因的表達，證明TAS3用于人工ta-siRNA技術(shù)的可行性[14]。

本研究以馬鈴薯Y病毒為研究材料，利用煙草TAS3基因改造人工ta-siRNA表達體系，同時構(gòu)建靶向PVY的人工ta-siRNA表達載體，對獲得的轉(zhuǎn)基因植物進行抗性等方面的分析，明確人工ta-siRNA技術(shù)在介導(dǎo)植物抗病毒中的可行性和有效性，為利用該策略培育高抗、多抗和高安全性的抗病毒作物提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

馬鈴薯Y病毒壞死株系（PVYN）繁殖并保存于煙草NC89，由作物生物學(xué)國家重點實驗室植物抗病基因工程研究室饋贈;大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105、農(nóng)桿菌LBA4404、改造后含有煙草TAS3基因的表達載體pROKⅡ-TAS3均由本實驗室保存;植物轉(zhuǎn)化受體煙草品種為NC89。

主要試劑：Easy Taq （5 U/μL ）、10 × Easy Taq Buffer、dNTPs均購自康為世紀(jì)有限公司，T4 DNA連接酶、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶購于大連TaKaRa，DIG Northern Starter Kit試劑盒購于Roche公司，DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omga公司，Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司，Hybond-N+尼龍膜購于Amersham公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?試驗方法

1.2.1?植物表達載體構(gòu)建

在網(wǎng)絡(luò)軟件（http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）中分別輸入PVY CP核苷酸序列，尋找潛在的可能形成siRNA的序列。將這些序列分別在煙草mRNA數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo3.noble.org/miRNA/miRU.htm）中篩選，以連續(xù)互補序列不超過5個堿基為原則，去掉可能以煙草內(nèi)源mRNA為靶序列的siRNA。

針對篩選出的靶序列設(shè)計引物合成帶有BspHⅠ酶切位點的靶序列，插入同樣經(jīng)過酶切的植物表達載體pROK Ⅱ-TAS3中，構(gòu)建植物表達載體PVY-CP5′、PVY-CPM和PVY-CP3′（表1）。

1.2.2?瞬時侵染檢測植物表達載體的有效性

將構(gòu)建成功的重組載體PVY-CP5′、PVY-CPM、PVY-CP3′和空載體pROKⅡ-TAS3利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。用滲透培養(yǎng)液沖懸YEP培養(yǎng)的農(nóng)桿菌細胞，調(diào)節(jié)濃度到OD600為0.5～1.0，室溫下培養(yǎng)3 h，選擇4 ～?5葉期本氏煙進行注射。3 d后，提取接種葉片的siRNA，以PVY-CP為探針進行Northern blot檢測，分析siRNA的表達情況。

1.2.3?轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測

利用凍融法將構(gòu)建成功的植物表達載體直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，同時以pROKⅡ-TAS3的空質(zhì)粒作為對照，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并進行PCR鑒定。

1.2.4?[JP3]轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析

待煙草長至4～5片葉時，選取感染PVYN的煙草葉片，按1∶10（w/v）比例用磷酸緩沖液（PB，pH 7.4）研磨，汁液摩擦接種，同時以非轉(zhuǎn)基因的野生型煙草NC89及轉(zhuǎn)pROKⅡ-TAS3的轉(zhuǎn)基因煙草為對照，在接種后45 d內(nèi)每天觀察記錄癥狀。

1.2.5?轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析

隨機選取部分抗病和感病的轉(zhuǎn)基因植株及對照植株，進行Northern blot分析。Trizol法提取植株基因組總RNA，電泳和分光光度計確定RNA濃度后，每個樣品約取20 μg，進行甲醛變性凝膠電泳分離，借助核酸印記儀轉(zhuǎn)移至HybondTM-N+尼龍膜上，80℃固定2 h。雜交RNA探針設(shè)計合成及Northern blot雜交分析按說明書的方法進行。

借助Pure LinkTM miRNA Isolation Kit（Invitrogen）提取轉(zhuǎn)基因植株的siRNA，經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)儀20 V轉(zhuǎn)移1 h至HybondTM-N+尼龍膜上，6 000 mJ強度下UV光線交聯(lián)1 min固定，雜交方法與總RNA Northern blot分析方法相同。

2?結(jié)果與分析

2.1?syn-tasiRNA結(jié)構(gòu)植物表達載體的構(gòu)建

將構(gòu)建完成的重組表達載體利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。隨機選取抗性菌落，以pROKⅡ-3′引物作為上游引物，以插入片段自身的5′端引物作為下游引物進行PCR檢測，以空質(zhì)粒pROKⅡ-TAS3為陰性對照。結(jié)果顯示：各抗性菌落均擴增到170 bp左右的片段，表明各片段已成功連入pROKⅡ-TAS3載體中。

2.2?瞬時表達后siRNA的檢測

為了檢測構(gòu)建植物表達載體的有效性，將3個表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后瞬時侵染本氏煙。利用空載體pROKⅡ-TAS3處理的煙草上沒有檢測到病毒CP基因特異siRNA的積累，而利用各重組載體處理的煙草葉片上均能檢測到siRNA積累，表明構(gòu)建的syn-tasiRNA載體能成功誘導(dǎo)植物體自身的RNA沉默系統(tǒng)，識別dsRNA，產(chǎn)生siRNA。

2.3?轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

將構(gòu)建的植物表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，并利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。植株經(jīng)PCR檢測后，共獲得轉(zhuǎn)PVY-CP5′載體的植株122株，轉(zhuǎn)PVY-CPM載體的植株136株，轉(zhuǎn)PVY-CP3′載體的植株126株，轉(zhuǎn)pROK Ⅱ-TAS3的植株65株。轉(zhuǎn)基因植株在生長發(fā)育和形態(tài)性狀等方面與非轉(zhuǎn)基因植株無明顯差異。

2.4?轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性分析

在煙草摩擦接種PVYN10天左右，所有轉(zhuǎn)pROKⅡ-TAS3和非轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出花葉和脈壞死癥狀，而其余三種轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出抗病或者感病兩種類型，且感病植株癥狀與非轉(zhuǎn)基因植株相同，抗病植株全生育期無病毒感染癥狀產(chǎn)生，與健康對照無明顯差異。抗性檢測結(jié)果（表2）表明，不同的轉(zhuǎn)基因植株對PVY的抗性存在明顯差異。

2.5?轉(zhuǎn)基因煙草的Northern blot分析

隨機選取轉(zhuǎn)化各載體中部分抗病和感病的轉(zhuǎn)基因煙草進行Northern雜交分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)PVY-CP5′、PVY-CPM和PVY-CP3′的植株均檢測到特異的雜交信號，表明外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上均得到正常表達，且抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，即目的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累量與病毒抗性呈負(fù)相關(guān);而轉(zhuǎn)pROKⅡ-TAS3煙草中沒有檢測到任何雜交信號。Northern blot分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對PVY的抗性是由RNA介導(dǎo)的。

2.6?轉(zhuǎn)基因煙草植株中siRNA的雜交分析

為進一步探討抗病植株的抗性是否由RNA介導(dǎo)及抗性與siRNA積累量之間的關(guān)系，隨機選取轉(zhuǎn)化各載體中部分抗病和感病的轉(zhuǎn)基因煙草進行siRNA的Northern雜交分析。結(jié)果顯示，抗病和感病的轉(zhuǎn)基因煙草中均能檢測到siRNA特異條帶，且抗病植株中siRNA的積累量明顯高于同類型的感病植株，即目的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累量與病毒抗性呈正相關(guān)。結(jié)果進一步表明植株對PVY的抗性是由RNA介導(dǎo)的。

3?討論與結(jié)論

RNA介導(dǎo)病毒抗性具有特異性強、抗性持久、抗病程度高等特點[15]，已廣泛應(yīng)用于植物基因功能研究和作物抗病育種等領(lǐng)域。相比其他RNA介導(dǎo)病毒抗性方法，syn-tasiRNA有多方面優(yōu)勢，在基因沉默的準(zhǔn)確性和高效性方面有新的突破。首先，ta-siRNA是由植物內(nèi)源基因編碼，不易與內(nèi)源基因發(fā)生同源重組，具有更高的生物安全性;其次，能產(chǎn)生可控的21堿基的siRNA，較為有效地避免潛在的脫靶現(xiàn)象;最后，可以同時表達多個ta-siRNA并且產(chǎn)生ta-siRNA位置固定，更易于將多個siRNA序列構(gòu)建到同一個載體中，進而借用一個表達載體沉默多個基因[16]。本研究利用syn-tasiRNA策略構(gòu)建了靶向PVY CP syn-tasiRNA重組載體，獲得抗PVY的煙草植株，Northern blot分析表明該抗性是由RNA介導(dǎo)產(chǎn)生的，證明了syn-tasiRNA在抗病毒作物培育上的可行性和高效性，同時為進一步利用該策略培育高抗、多抗和高安全性的抗病毒作物提供理論依據(jù)。

前期的研究表明，RNA沉默的效率多與靶序列的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，復(fù)雜的靶序列結(jié)構(gòu)導(dǎo)致siRNA難以結(jié)合，進而降低沉默效率。局部最小自由能ΔGloc往往用于體現(xiàn)靶序列二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度，靶序列的內(nèi)部結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定表現(xiàn)為ΔGloc越低，越不利于siRISC復(fù)合物的親近[17]。本試驗中，靶向PVY CP基因不同區(qū)段syn-tasiRNA的轉(zhuǎn)基因植株對PVY的抗性存在明顯差異，分析可能與靶序列的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。借助Mfold（http：//www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold）預(yù)測PVY CP基因序列的二級結(jié)構(gòu)，并統(tǒng)計各靶序列的ΔGloc，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，具有較低抗病性載體靶向的區(qū)段具有較低的ΔGloc，與ΔGloc所代表的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性規(guī)律相符合，表明syn-tasiRNA培育抗病毒植株策略中靶序列的二級結(jié)構(gòu)和抗病效率之間存在相關(guān)性。

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