大蔥離體雌核發(fā)育誘導單倍體研究

陳偉 孫楊 王清華 王海英 高莉敏

摘要：以大蔥未開放花蕾為試材，研究花蕾大小、培養(yǎng)基、外源激素濃度配比不同對大蔥離體雌核誘導單倍體的影響，旨在建立大蔥離體雌核發(fā)育誘導單倍體技術體系。結果表明：直徑為2.0～2.5 mm的未開放花蕾為最適外植體;在MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1 2，4-D和1.5 mg·L-1 6-BA時，其雌核發(fā)育胚誘導率可達3.5%;在B5培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1 2，4-D和1.0 mg·L-1 6-BA時，其雌核發(fā)育胚誘導率可達2.5%。將雌核發(fā)育胚轉移至不含外源激素的1/2MS培養(yǎng)基中誘導生根，可發(fā)育成完整植株。通過根尖染色體計數(shù)分析，136株再生植株中有15株為單倍體，單倍率11%。由單倍體加倍獲得的雙單倍體是重要性狀遺傳分析、分子標記及數(shù)量性狀研究的理想材料，此研究可為大蔥遺傳育種奠定基礎。

關鍵詞：大蔥;雌核發(fā)育;誘導;單倍體

中圖分類號：S633.103.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）12-0010-06

大蔥（Allium fistulosum L.）是典型的異花授粉作物，育成優(yōu)良自交系至少需要6～10年的時間。而通過單倍體途徑在較短時間內(nèi)就可以選育出整齊一致的純系，同時由于不存在等位基因位點的顯隱性作用，一些由隱性基因決定的性狀便可以得到充分表現(xiàn)，這樣在篩選育種材料時能大大降低誤選頻率，明顯提高選擇效果。此外，單倍體培養(yǎng)可以快速獲得雙單倍體群體。利用突變技術來創(chuàng)造有用變異已被實踐證明是一種非常有潛力的育種方法，而在離體培養(yǎng)中，雙單倍體技術則是促進突變技術應用的更有效的方法，至今全世界已在150多種植物中選出近2 000個優(yōu)良突變品種在生產(chǎn)中推廣應用[1]。

關于未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究，最早的工作始于20世紀50年代，但直到70年代末才出現(xiàn)了研究成功的報道。San Noeum[2]利用大麥未受精子房在離體條件下培養(yǎng)獲得了單倍體再生植株，并首次釆用了“雌核發(fā)育”（gynogenesis）一詞來說明在離體條件下由未受精胚囊產(chǎn)生單倍體植株的現(xiàn)象。從此，國內(nèi)外許多學者開始對各種植物的離體雌核發(fā)育展開研究。顏昌敬與趙慶華[3]在進行水稻葉鞘與枝梗愈傷組織誘導再生植株的研究時，也由子房培養(yǎng)獲得了小植株。借助單倍體技術我國已成功育成水稻品種近百個，小麥品種十多個，玉米、大白菜、油菜品種多個，以及甜椒、煙草和果樹等新品種，總計種植面積超過200萬公頃，是世界上借助單倍體技術育成品種最多、應用最廣的國家[4]。

目前，關于大蔥離體雌核誘導單倍體研究還未見報道。本課題主要研究在大蔥雌核離體培養(yǎng)過程中，花蕾大小、培養(yǎng)基類型、外源激素添加對雌核發(fā)育和胚狀體誘導的影響。本研究結果可為大蔥雌核發(fā)育誘導單倍體再生體系的建立提供理論依據(jù)，并為大蔥雜交種選育、分子標記研究、遺傳圖譜構建等奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料的獲取

大蔥品種魯蔥雜5號，由本課題組選育。2015年7月5日播種于山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所試驗基地，同年10月8日將蔥苗定植于溫室大棚中，次年3月中旬抽薹后取材。分別選取直徑2.0～2.5、2.5～3.5 mm兩種大小的未開放花蕾作為試材。

1.2?試驗材料的處理和培養(yǎng)

選材后剪去花柄，在超凈工作臺上用75%的酒精溶液表面消毒30 s，再用有效濃度5%（體積比）的NaClO消毒15 min，然后用無菌水沖洗3遍，最后用滅菌濾紙吸干表面水分，分別接種在不同外源激素濃度配比的B5和MS培養(yǎng)基中（表2和表3）。

培養(yǎng)條件：溫度（24 ± 2）℃，光照強度25 μmol·m-2·s-1，光周期15 h·d-1。

所有誘導培養(yǎng)基均添加100 g·L-1蔗糖和7 g·L-1植物凝膠，然后將其pH值調(diào)至5.8，并于高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min。用直徑90 mm的培養(yǎng)皿分裝培養(yǎng)基，Parafilm石蠟膜封口，每處理接種20個培養(yǎng)皿，每皿接種花蕾20個，即每個處理接種400個花蕾。

1.3?植株再生

花蕾在單倍體誘導培養(yǎng)基中誘導成為胚狀體，待芽生長至大約1 cm后轉入無植物生長調(diào)節(jié)劑、含有30 g·L-1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中發(fā)育成完整植株。植株生長至兩葉一心后，打開瓶蓋馴化培養(yǎng)3～5 d，用鑷子小心地將幼苗取出用自來水沖洗干凈，移栽到裝有高溫滅菌蛭石的營養(yǎng)缽中，在培養(yǎng)室培養(yǎng)成活后定植于溫室中。

胚狀體誘導率（%）= 有胚狀體發(fā)生的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.4?倍性鑒定

染色體計數(shù)法：每株取2～3 mm長的新生幼嫩根尖進行染色體鑒定，經(jīng)卡諾氏液固定過夜后，使用70%的酒精在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。切取的根尖部分?%的醋酸洋紅染色，覆上蓋玻片，用鑷子一端垂直輕輕敲片，使染色體散開。在顯微鏡下觀察，選取染色體分散較好的體細胞拍照，統(tǒng)計染色體數(shù)。

2?結果與分析

2.1?花蕾在誘導培養(yǎng)基中的發(fā)育過程

接種在添加不同濃度外源激素的培養(yǎng)基中的花蕾2 d后陸續(xù)開放，伸出花絲，5 ～ 6 d 后花藥敗育，15 d左右子房開始逐漸膨大，珠被表面開始發(fā)白發(fā)亮。大約50 d后，從子房中長出雌核發(fā)育的胚，之后胚逐漸增多，直到5個月后很少再出現(xiàn)成胚。

2.2?花蕾大小對離體雌核誘導單倍體的影響

分別將直徑為2.0～2.5 mm和2.5～3.5 mm的未開放花蕾接種在培養(yǎng)皿中，每皿接種20個，5個月后統(tǒng)計出胚率。由表1可以看出，在培養(yǎng)基B5和MS中，直徑為2.0～2.5 mm的未開放花蕾誘導出的胚狀體個數(shù)明顯高于直徑為2.5～3.5 mm的未開放花蕾胚狀體誘導數(shù)。所以，進行大蔥離體雌核誘導單倍體時，要注重對花蕾大小的選擇，這樣可提高再生植株的誘導頻率。

2.3?不同培養(yǎng)基及外源激素濃度對離體雌核誘導單倍體的影響

以B5和MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的外源激素，進行大蔥離體雌核單倍體誘導。由表2可以看出，在添加了1.0 mg·L-12，4-D和1.0 mg·L-1 6-BA的B5培養(yǎng)基中，其雌核發(fā)育胚總誘導率可達2.5%。由表3可以看出，在MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-12，4-D和1.5 mg·L-1 6-BA時，其雌核發(fā)育胚總誘導率最高，可達3.5%。表明這兩種培養(yǎng)基比較適合大蔥離體雌核發(fā)育誘導成胚，其中MS培養(yǎng)基更適合大蔥離體雌核誘導單倍體。

2.4?植株再生及倍性鑒定

將胚狀體轉移到未添加外源激素的含有30 g·L-1蔗糖的B5培養(yǎng)基中，發(fā)育成136棵完整植株。個別植株存在分蘗現(xiàn)象，也就是說可以由一株變?yōu)閮芍晟踔粮嘀?，所以本試驗中胚狀體誘導數(shù)目和成苗數(shù)不統(tǒng)一，有增加現(xiàn)象的就屬于這種情況，另有些減少情況的基本是胚狀體沒有成苗。

以正常二倍體大蔥為對照，對試驗所得再生植株根尖細胞染色體數(shù)進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)部分植株的根尖染色體細胞含有8條染色體，誘導再生的136棵植株中有15株為單倍體，單倍體率達11%。

3?討論與結論

在利用未授粉子房、胚珠離體培養(yǎng)單倍體方面，已在黃瓜[5]、甜瓜[6，7]、西葫蘆[8，9]等許多蔬菜作物上成功報道;在蔥屬植物研究中也取得了一定的成果，如田慧橋等[10]研究了韭菜未傳粉子房的培養(yǎng)及單倍體胚胎發(fā)生和植株再生;劉穎穎等[11]對大蒜進行了未受精子房離體培養(yǎng)，獲得了單倍體植株;劉冰江等[12]進行了洋蔥離體雌核發(fā)育誘導單倍體研究，并獲得了洋蔥單倍體植株。本研究以大蔥未開放花蕾為外植體成功獲得了單倍體植株。

在利用離體雌核誘導單倍體過程中，外植體發(fā)育程度是一個重要的影響因素，對于子房接種適宜時間節(jié)點的界定，不同作物的結論相差很大。大麥胚珠離體培養(yǎng)時，在胚囊快成熟的時期容易誘導出單倍體植株，但誘導率最高出現(xiàn)在單核至四核胚囊時期[2]。洋蔥從大孢子母細胞至成熟胚囊期的整個過程中都能誘導單倍體植株[13，14]。目前尚未見大蔥花蕾直徑大小與胚囊發(fā)育時期關系的相關報道，而且大蔥品種不同、花蕾屬于成株開花還是半成株開花，其花蕾直徑大小與胚囊發(fā)育時期的關系應該也不相同。本試驗針對魯蔥雜5號品種半成株開花時期的花蕾大小進行研究，當花蕾直徑為2.0～2.5 mm時誘導單倍體成功率較高。

大蔥離體雌核誘導單倍體成功與否，培養(yǎng)基和外源激素起著至關重要的作用。大多未受精子房或胚珠培養(yǎng)通常采用Miller、N6、MS、H、White或其改良型培養(yǎng)基加上適宜濃度的外源激素進行培養(yǎng)[15]。劉穎穎等[11]篩選出的適宜大蒜未受精子房離體培養(yǎng)的誘導培養(yǎng)基為：B5+2 mg· L-1 6-BA+1 mg· L-1NAA;關于洋蔥離體雌核發(fā)育誘導單倍體的研究較多，篩選到的培養(yǎng)基各不相同，劉冰江等[12]篩選出的適宜培養(yǎng)基為含有1.5 mg· L-1 2，4-D+1.5 mg· L-1 6-BA或2.0 mg· L-1 2，4-D+2.0 mg· L-1 6-BA的B5培養(yǎng)基，Yarali等[16]篩選出的適宜培養(yǎng)基為BDS+2 mg· L-1 2，4-D+1 mg· L-1 6-BA，Michalik等[17]篩選出的適宜培養(yǎng)基為B5或BDS+2.0 mg·L-1 2，4-D+2.0 mg·L-1 6-BA。本試驗采用B5和MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4-D和6-BA進行培養(yǎng)，篩選出的適宜培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.5 mg·L-1 6-BA以及B5+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA，這兩種培養(yǎng)基都能有效地刺激大蔥離體雌核的發(fā)育。

單倍體只有加倍成為雙單倍體才能應用于育種實踐。本試驗通過對再生植株進行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)其中既有單倍體也有二倍體。之前類似的研究中也發(fā)現(xiàn)，誘導單倍體所獲得的再生植株經(jīng)檢測，大多是單倍體、二倍體甚至多倍體都存在。通過西葫蘆未受精子房離體培養(yǎng)獲得的再生植株，其中二倍體植株占60%[18];而利用黃瓜胚珠進行離體培養(yǎng)，再生植株的單倍體率僅為18.2%[19]?？梢?，植物單倍體培養(yǎng)中廣泛存在著染色體自然加倍現(xiàn)象，但其原因和加倍的具體時期尚不明確。有的材料自然加倍率可達10%，而有的材料幾乎不發(fā)生自然加倍[20]，這些都說明非單倍體率在不同作物間存在顯著差異。Keller和Armstrong曾提出小孢子胚自然加倍與胚胎發(fā)生初始的核內(nèi)有絲分裂相關[21]，而小麥的游離小孢子培養(yǎng)研究則證明再生植株的自然加倍率與外植體的預處理方式也有密切關系[22]。本研究中大蔥離體雌核誘導培養(yǎng)的單倍體率較低，僅為11%，其余的二倍體屬于自然加倍形成的雙單倍體還是體細胞形成的普通二倍體植株，尚無有效的鑒定方法。在下一步研究工作中，將結合胚珠發(fā)育的全過程細胞組織學研究和再生植株自交后代性狀觀察，深入分析再生植株來源和染色體自然加倍現(xiàn)象。

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