一測多評法同時測定柴胡藥渣總皂苷中3種次生柴胡皂苷含量

河南科技大學化工與制藥學院，河南 洛陽 471003

柴胡是一味常用中藥，具有和解表里，升陽舉陷的作用[1]。湯劑是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，以水為溶劑的煎煮法是含柴胡成藥生產(chǎn)工藝中較為常用的一種的提取方法。本課題組在對涉及柴胡煎煮的相關(guān)工藝進行研究時，如柴胡口服液的制備，發(fā)現(xiàn)柴胡煎煮過后的藥渣中仍然含有大量的皂苷，具有較高的再利用價值?；诖?，建立了柴胡藥渣中皂苷的提取富集工藝，并從中制備了柴胡皂苷的提取物。該提取物中所含的皂苷不同與柴胡藥材中所含的原生柴胡皂苷，如柴胡皂苷a、c、d，而是以次生柴胡皂苷為主，如柴胡皂苷h、b2和b1(分別為柴胡皂苷c、d、a的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物)[2-4]。以上述3種次生皂苷為指標建立柴胡藥渣皂苷提取物的質(zhì)量標準時，發(fā)現(xiàn)上述柴胡皂苷標準品價格較高，或不易得到，造成所制定的標準在實際應用中存在較大的不便。“一測多評”法，即測定1個成分的含量，利用該成分與其他成分間的校正因子，來實現(xiàn)對多個成分含量的監(jiān)控，為多指標質(zhì)量控制標準的實際應用帶來便利[5]。

基于此，本文以柴胡皂苷b2為對照品，建立其與柴胡皂苷b1、h的相對校正因子，并用校正因子計算柴胡皂苷的含量。同時以t檢驗法對相對校正因子的計算值和外標法實測值進行比較，并對不同品牌色譜柱、高效液相色譜儀以及不同實驗室的試驗結(jié)果進行考察，綜合評價一測多評法在以柴胡藥渣總皂苷質(zhì)量控制中應用的準確性和科學性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimazu LC-15C高效液相色譜儀；LC-Solution 色譜工作站(日本島津公司)；Waters Alliance2695-2487高效液相色譜儀(Empower 2 色譜工作站，美國Waters公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA2004B型電子分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；Hypersil-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，WondaSil C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Waters Xbridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 材料 柴胡藥渣總皂苷提取物(自制，4批)；柴胡皂苷b2、b1、h(自制，經(jīng)MS、1H-NMR 和13C-NMR確定結(jié)構(gòu)，HPLC 色譜峰面積歸一化法測得純度均HPLC面積歸一化法測定其純度高于98%)，柴胡皂苷h(批號：16111514，寶雞市辰光生物科技有限公司)；甲醇(色譜純，DIKMA公司)，哇哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評法方法學考察

2.1.1 色譜條件 Hypersil-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫(0～70min，22%→50%)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：254nm；進樣量：10.0μL。理論塔板數(shù)按照柴胡皂苷b2峰計算應不低于6000。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷h、b1、b2對照品適量置于50 mL的量瓶中，配置成濃度分別為0.03、0.1、0.24 mg·mL-1的混合對照品溶液Ⅰ，分別精密吸取上述混合對照品溶液1.5、1.0、0.5、0.2 mL ，置于4個不同的2 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅱ～Ⅴ，于4℃冰箱中保存，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取柴胡藥渣總皂苷提取物5 mg，精密稱定，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 線性范圍 取“2.1.2”項下混合對照品溶液Ⅰ～Ⅴ，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀。按照“2.2.1”項下色譜方法分析，并記錄峰面積。以進樣量X為橫坐標與峰面積Y(A×10-5)為縱坐標，進行線性回歸，得柴胡皂苷b1、b2、h的回歸方程及線性范圍，即柴胡皂苷b1Y=11.93X+0.1188 (r=0.9993)，線性范圍0.10～1.0 μg；柴胡皂苷b2Y=14.33X+3.233(r=0.9997)，線性范圍0.24～2.40 μg；柴胡皂苷hY=9.2438X-0.1945(r=0.9996)，線性范圍0.03～0.30 μg。

2.1.5 精密度試驗 精密吸?、籼柣旌蠈φ掌啡芤?0 μL，連續(xù)進樣6次，記錄柴胡皂苷b2、b1、h的峰面積，其峰面積的RSD分別為2.10%、1.50%、1.01%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液10 μL分別于1、2、4、6、8、10 h進樣測定, 記錄柴胡皂苷b2、b1、h峰面積，其峰面積的RSD分別為2.32%, 1.89%和2.30%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定不變。

2.1.7 重復性試驗 稱取同一批柴胡藥渣皂苷富集物5 mg，共5份，精密稱定，按供試品溶液處理方法制備樣品并測定， 柴胡皂苷h、b1、b2含量的RSD(n=5)分別為，2.82%、2.32%、2.95%，表明重復性良好。

2.1.9 加樣回收率 稱取已知含量的柴胡皂苷富集物適量5份，每份2.5mg，精密稱定，分別加入適量的柴胡皂苷b2、b1、h對照品，按照供試品溶液的處理方法制備樣品并依法測定，計算加樣回收率，柴胡皂苷b2、b1、h的平均加樣回收率為99.7%、99.7%、RSD(n=5)分別為1.03%、1.17%、2.10%。表明實驗方法準確度符合要求。

2.2 相對校正因子的計算 在“2.1.1”項下確定的HPLC 色譜分析條件下，精密吸取“2.2.2”項下5 個濃度的混合對照品溶液，分別進樣10 μL。以柴胡皂苷b2為內(nèi)標，根據(jù)相對響應因子計算公式fr=(An×Ws)/(As×Wn) ，其中，fr，A，W 分別為相對校正因子、峰面積及成分質(zhì)量，下標n，s 分別代表待測成分和內(nèi)參成分[6-8]，分別計算柴胡皂苷b1、h的相對響應因子。結(jié)果見表1。

表1 次生柴胡皂苷b1和h的相對校正因子

注：SS-柴胡皂苷

2.3 一評多測法耐用性和系統(tǒng)適應性評價

2.3.1 不同進樣量對形影因子的影響 在Shimazu LC-15C、WondaSil C18、流速1.0 mL·min-1下，取“2.1.2”項下對照品溶液Ⅳ，分別進樣2、5、10、15、20 μL，計算fssb2/ssb1、fssb2/ssh，考察不同進樣量對相對響應因子的影響，結(jié)果各成分相對響應因子重現(xiàn)性良好，RSD 值分別為1.11%、3.20%。

2.3.2 色譜柱和高效液相色譜儀考察 實驗考察了Shimazu LC-15C和Waters Alliance2695-2487兩種高效液相色譜系統(tǒng)和Hypersil-C18(250mm×4.6mm，5μm)，WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)3種色譜柱。結(jié)果見表2。

表2 不同儀器和不同色譜柱測得的校正因子

2.3.3 待測組分色譜峰的定位 采用相對保留時間值作為定位標準，計算不同色譜儀和色譜柱的相對保留時間。結(jié)果RSD<5%，表明不同色譜儀和色譜柱下相對保留時間波動較小，重現(xiàn)性較好。結(jié)果見表3。

表3 不同色譜儀和色譜柱測得的相對保留時間

2.3.5 實驗室考察 取“2.1.2”項下對照品溶液Ⅳ，對建立的一評多測分析方法在兩個實驗室進行復核實驗。結(jié)果見表4。

表4 不同實驗室測得的相對校正因子

2.4 樣品測定 取不同批次柴胡藥渣皂苷富集物，每批3份，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，并依法測定，計算樣品中各次生柴胡皂苷的含量，分別采用一評多測法和外標法計算柴胡皂苷h、b1的含量。結(jié)果見表5。

2.5 統(tǒng)計分析 采用統(tǒng)計學t檢驗，對表5中一評多測法和外標法得到的柴胡藥渣中柴胡皂苷b1、h的含量進行比較，結(jié)果顯示P值均大于0.05，表明兩種方法測得的柴胡皂苷b1、h含量沒有顯著性差異。可見所建立的QAMS 法準確可行，可以替代外表法測定柴胡皂苷b1、h。

表5 兩種方法測定不同批次柴胡藥渣中柴胡皂苷的含量 (mg/g)

注：A外標一點法測定值 B一評多測計算法

3 討論

針對于水提柴胡工藝的藥渣中含有的柴胡皂苷，建立了如下的提取富集工藝：以含0.05%NaOH的50%乙醇-水溶液為提取溶媒，采用溶劑回流的方式進行提?。桓患に嚥捎么罂孜綐渲╗9]，首先采用堿性水溶液進行洗脫除雜，然后用不同濃度的乙醇進行洗脫，收集高濃度的乙醇洗脫部位，濃縮，干燥，即得柴胡總皂苷。

對于檢測波長的選擇，通過對供試品和對照品溶液在不同波長下的圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)254nm下，3種柴胡皂苷的吸收強度較大、圖譜基線平穩(wěn)，且分離度較好，故將測定波長確定為254nm。實驗考察了不同的儀器、色譜柱，不同的實驗條件下，柴胡皂苷b2對柴胡皂苷b1和h的相對校正因子的影響。結(jié)果顯示，在上述不同的條件下相對校正因子重現(xiàn)性良好，RSD值均小于5%。為了檢驗所建立方法的準確性，采用外標法與一評多測法計算值進行反復驗證，結(jié)果顯示各待測成分實際含量與計算含量經(jīng)過t-檢驗沒有顯著性差異。

不同于外標法，一評多測法能否成功應用的關(guān)鍵在于如何對測定對象的色譜峰進行準確定位[5]。本實驗中，在所確定的色譜條件下，經(jīng)過除雜、富集所得柴胡藥渣皂苷的色譜峰相對較簡單，干擾峰較少，通過3種柴胡皂苷間的相對保留時間即可實現(xiàn)目標成分的準確定位。

綜上，本實驗所建立的一評多測法測定柴胡藥渣中總皂苷含量的方法具有較高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和可行度，有利于柴胡藥渣總皂苷提取物的質(zhì)量評價，證明了采用一評多測法測定同類化合物成分的可行性。