Toll樣受體在寄生蟲引起的肝膽管纖維化中的作用

韓 慈，劉偲奇，宋 蕾，路 越，李云鵬，張德凱

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086

病原體相關(guān)性肝膽管纖維化是一種由各種細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲導(dǎo)致的膽管細(xì)胞損傷和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積在膽管周圍而形成的一種肝臟纖維化。Toll樣受體是先天免疫系統(tǒng)中一類重要的跨膜受體,它可以識(shí)別一種或多種特定的微生物病原體及其產(chǎn)物共有的高度保守分子結(jié)構(gòu)，即病原相關(guān)性分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)。Toll樣受體在病原體相關(guān)性肝膽管纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。然而，對(duì)于這一病理過程和病理機(jī)制，人們了解得還不多。但是，為了深入了解病原體相關(guān)性肝膽管纖維化的發(fā)病機(jī)制，從而找到最有效的臨床治療方案，理解Toll樣受體在寄生蟲引起的肝膽管纖維化中的作用是必需的。寄生蟲在肝膽管中的Toll樣受體信號(hào)通路可能是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)治療。

1 Toll樣受體—免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體侵襲的關(guān)鍵受體

先天免疫 Toll樣受體的發(fā)現(xiàn)，是人類醫(yī)學(xué)史上的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，贏得2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。Toll樣受體作為機(jī)體天然免疫的第一道屏障，也是識(shí)別并結(jié)合病原體，激活免疫系統(tǒng)反饋的最重要的受體。Toll樣受體在先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[1]。Toll樣受體家族中不同成員的細(xì)胞內(nèi)定位與其識(shí)別的配體的性質(zhì)有關(guān)[2]。在Toll樣受體家族中，TLR1、2、4、5、6和11存在于細(xì)胞膜上，并能識(shí)別細(xì)菌成分[3]。然而，抗病毒受體，TLR3、7、8和9識(shí)別病毒的核酸成分，這些受體不是在細(xì)胞表面表達(dá)，而是存在于內(nèi)核體(endosome)。在病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)且被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)核體之后，釋放的核酸可以被這些Toll樣受體識(shí)別出來，從而激活相應(yīng)的信號(hào)通路[4]。寄生蟲的糖基磷脂酰肌醇(GPI)[5]及糖醇磷脂(GIPLs)[6]被TLR2復(fù)合體識(shí)別，所以，TLR2在寄生蟲病引起的疾病(如瘧疾)中起重要作用。瘧原蟲色素(Hemozin)被TLR4識(shí)別，從而激活免疫反應(yīng)[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，TLR11識(shí)別寄生蟲的纖維蛋白 (Profilin)。

2 寄生蟲引起的肝膽管纖維化

細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等病原體感染可引起慢性肝臟疾病，以損傷膽管上皮細(xì)胞、ECM沉積在膽管周圍為特征，稱為寄生蟲引起的肝膽管纖維化，并最終發(fā)展成為膽汁淤積性肝硬化且會(huì)因缺乏有效的臨床治療措施最終導(dǎo)致肝臟衰竭和膽管癌。然而，寄生蟲引起的肝膽管纖維化[9]與其他種類肝纖維化的形成不同，我們對(duì)它的發(fā)病機(jī)制還知之甚少。Toll樣受體作為一種先天性免疫相關(guān)受體，起著防御感染和病原體入侵的第一道防線作用，其可識(shí)別病原體的保守結(jié)構(gòu)，如病原體包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲。TLR2和TLR4有多種寄生蟲相關(guān)性的配體，如原蟲、線蟲、吸蟲和絳蟲[10]，其中許多寄生蟲可以定植于膽道或間接作用于膽道系統(tǒng)，引發(fā)膽系疾病。

2.1后睪肝吸蟲后睪肝吸蟲是一種常見的膽道寄生蟲，其中包含一種由Ov-GRN-1編碼的顆粒體蛋白，研究[11]表明，當(dāng)這種顆粒體蛋白被抑制，后睪肝吸蟲刺激引起的膽道上皮細(xì)胞擴(kuò)增狀態(tài)也將被抑制。后睪肝吸蟲還可在代謝過程中產(chǎn)生甾醇，導(dǎo)致血脂代謝異常，引起血脂沉積，致使機(jī)體產(chǎn)生高膽固醇血癥，從而導(dǎo)致產(chǎn)生膽管纖維化[12]。

2.2華支睪吸蟲華支睪吸蟲是在亞洲東部地區(qū)包括中國、韓國、越南等地區(qū)流行的食源性寄生蟲。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約1 500萬人因進(jìn)食含有華支睪吸蟲的生冷或熟的魚肉而受到感染。成蟲會(huì)寄居在終宿主而引起膽管炎、膽石癥、膽汁淤積，甚至膽管癌。值得注意的是，華支睪吸蟲的慢性感染可以刺激門靜脈周圍如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，這些細(xì)胞的相互作用有助于肝膽管纖維化的形成[13]。

2.3其他除了肝吸蟲之外，一些其他寄生蟲也對(duì)膽道產(chǎn)生惡劣的影響，如血吸蟲感染后可通過增強(qiáng)Natch1/Jagged1信號(hào)后聯(lián)合TLRs，引起巨噬細(xì)胞活化后導(dǎo)致可溶性蟲卵抗原M2極化，從而引起膽管及肝臟的纖維化[14]；而肝片吸蟲病還可通激活起肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化膽管及肝部肌成纖維細(xì)胞，致使產(chǎn)生膽管及肝臟的纖維化[15]。馬來絲蟲的微絲蚴不僅可以下調(diào)人類樹突狀細(xì)胞TLR3和TLR4的表達(dá)，也可以使這些細(xì)胞對(duì)TLR3和TLR4配體的應(yīng)答降低。研究[16]表明，微絲蚴可通過改變Toll樣受體的表達(dá)，干擾MyD88依賴的信號(hào)通路，從而影響NF-κB的活性，干擾抗原呈遞細(xì)胞影響T細(xì)胞的活化?？偟膩碚f，寄生蟲是膽道損傷及膽道疾病不可忽視的病因。

膽道纖維化過程中多種細(xì)胞被認(rèn)為通過2EMT導(dǎo)致ECM的生產(chǎn)，包括HSCs、肝祖細(xì)胞、匯管區(qū)成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞[17]。然而，被激活的HSCs因高表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)被認(rèn)為是最有意義的細(xì)胞，它不同于產(chǎn)生ECM的肌成纖維細(xì)胞[18]。因此，激活HSCs是肝纖維化形成過程中的中心事件，這是由細(xì)胞因子和活性氧的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所執(zhí)行的[19-20]。盡管許多細(xì)胞因子參與肝纖維化的形成過程，但主要促進(jìn)HSCs激活的是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，而且它還能通過TGF-β/Smads信號(hào)通路促進(jìn)ECM的產(chǎn)生[21]。

3 TLR4在寄生蟲引起的肝膽管纖維化中的作用

Toll樣受體是病原體相關(guān)分子模式中的最重要模式識(shí)別受體，通過天然免疫促進(jìn)宿主防御機(jī)制，控制宿主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。最近，TLR4也被證實(shí)與肝纖維化的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，且TLR4對(duì)HSCs的效應(yīng)起關(guān)鍵作用[22]。激活的TLR4信號(hào)可促進(jìn)骨髓源性肝細(xì)胞與內(nèi)源性肝細(xì)胞之間的交叉，促進(jìn)TGF-β的釋放和提高HSCs對(duì)TGF-β 的敏感性。

3.1TLR4突變可以抑制膽管纖維化研究[13]表明，在華支睪吸蟲感染的小鼠TLR4突變可以抑制膽管纖維化。TLR4在華支睪吸蟲感染的小鼠高表達(dá)，TLR4野生型小鼠在被華支睪吸蟲感染后顯示出腦葉腫脹和表面的大結(jié)節(jié)，但突變型小鼠僅在腦葉的表面顯示有局限的蒼白區(qū)域；膠原蛋白沉積在感染后的野生型小鼠和突變型小鼠都明顯增加，而野生型小鼠的膠原沉積含量明顯高于突變型小鼠；且突變型小鼠較野生型小鼠的羥脯胺酸含量減少2倍，這些數(shù)據(jù)表明，TLR4與病原體相關(guān)性膽管纖維化相關(guān)。

3.2TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)華支睪吸蟲引起纖維化有重要影響[13]。對(duì)比未被華支睪吸蟲感染的小鼠與被華支睪吸蟲感染的小鼠，感染的小鼠有較高水平的α-SMA和I型膠原蛋白(無論在TLR4野生型小鼠和TLR4缺失型小鼠)。然而，野生型小鼠的α-SMA 和I型膠原蛋白要顯著高于TLR4缺失型小鼠。通過Western blotting分析顯示，MyD88和磷酸化NF-κB對(duì)于華支睪吸蟲感染的野生型小鼠和缺失型小鼠都顯著生長，而突變型小鼠顯著低于野生型小鼠。感染的野生型小鼠的MyD88和磷酸化NF-κB比未被感染的小鼠增加2倍。且相比突變型小鼠，MyD88和磷酸化NF-κB高表達(dá)于野生型小鼠，這說明損傷TLR4通路能阻止華支睪吸蟲引起的肝膽管纖維化。

3.3損傷TLR4會(huì)阻止轉(zhuǎn)化生長因子介導(dǎo)的寄生蟲引起的肝膽管纖維化由于轉(zhuǎn)化生長因子對(duì)于HSCs的活化及細(xì)胞外基質(zhì)的生產(chǎn)是至關(guān)重要的，且我們先前提到轉(zhuǎn)化生長因子信號(hào)通路在華支睪吸蟲感染的小鼠中不但被激活且會(huì)促進(jìn)膽管纖維化[23]。與未感染小鼠相比，轉(zhuǎn)化生長因子和p-Smad2/3在感染后的TLR4野生型和突變型小鼠中都是高表達(dá)的，但對(duì)比感染的野生型小鼠，TLR4缺失型小鼠的轉(zhuǎn)化生長因子和p-Smad2/3表達(dá)明顯受到抑制。此外，以往的研究[20]表明，TLR4配體會(huì)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子的虛擬受體用來促進(jìn)HSC對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子的敏感性。研究[13]發(fā)現(xiàn)，在嘗試使用相統(tǒng)計(jì)量華支睪吸蟲造模時(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子的虛擬受體在缺失型小鼠相對(duì)于野生型小鼠顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，TLR4缺陷將會(huì)減少轉(zhuǎn)化生長因子介導(dǎo)的寄生蟲引起的肝膽管纖維化。

3.4減少HSCs在華支睪吸蟲感染的TLR4缺失型小鼠在肝臟中的激活HSCs作為生物標(biāo)志分化成肌成纖維細(xì)胞，α-SMA可被染色用于評(píng)價(jià)在華支睪吸蟲感染的缺失型小鼠和野生型小鼠活化的HSCs[13]。對(duì)于未感染小鼠，HSCs表達(dá)α-SMA或肌成纖維細(xì)胞在TLR4缺失型和野生型的健康型小鼠中很難找到，然而大量的HSCs和肌成纖維細(xì)胞在華支睪吸蟲感染的TLR4缺失型或野生型小鼠的膽管周圍被抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體強(qiáng)染色。然而相比缺失型小鼠，α-SMA的表達(dá)在華支睪吸蟲感染的野生型小鼠的肝臟中顯著增加，提示TLR4功能缺陷會(huì)減弱HSCs因華支睪吸蟲感染引起的寄生蟲引起的肝膽管纖維化。

寄生蟲引起的肝膽管纖維化是特殊類型的肝纖維化，其特點(diǎn)是膽管上皮細(xì)胞增生、肝門靜脈炎癥細(xì)胞浸潤、肌成纖維細(xì)胞的活化。然而，對(duì)寄生蟲引起的肝膽管纖維化持續(xù)性和進(jìn)展性的機(jī)制仍然知之甚少，目前的研究顯示，Toll樣受體與寄生蟲引起的肝膽管纖維化相關(guān)，且TLR4缺陷能改善體內(nèi)因華支睪吸蟲引起的膽管纖維化和在體外敲除TLR4信號(hào)通路后能減弱HSCs對(duì)ECM的產(chǎn)生?？傊?，TLR4信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)華支睪吸蟲引起的寄生蟲引起的肝膽管纖維化[13]。

研究[24-25]顯示，在小鼠感染華支睪吸蟲28 d后會(huì)形成大量的膽管周圍纖維化，且年幼的華支睪吸蟲在感染21～23 d時(shí)會(huì)在膽管周圍發(fā)展成為成蟲。此外，最近研究顯示，在華支睪蟲感染的小鼠的肝臟中會(huì)檢測到蟲卵(無論缺失型還是野生型小鼠都是100%的感染率)。更重要的是，在華支睪吸蟲感染小鼠28 d后TLR4的表達(dá)升高且高表達(dá)于HSCs和成肌細(xì)胞，這說明TLR4在這種類型的肝纖維化中扮演重要角色[24]。

越來越多的數(shù)據(jù)表明，先天性免疫參與各種有害刺激引起的纖維化過程。Toll樣受體是模式識(shí)別受體中的保護(hù)性家族，它在感染和未感染的疾病中都能啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[13-20]。然而，TLR4似乎在不同的微環(huán)境調(diào)節(jié)纖維化的過程中發(fā)揮不同的作用[26]。例如，TLR4信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子信號(hào)通路在非感染性肝臟纖維化中起到促進(jìn)HSCs細(xì)胞活化及肝纖維化的作用[20-27]，然而TLR4在肺損傷模型中卻作為一個(gè)阻止纖維化的負(fù)性調(diào)節(jié)[28-29]。最新的研究[18]表明，HSCs 是毒性、膽固醇和脂肪型肝纖維化中促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白的普遍原因，這更支持了 TLR4 突變能減弱因華支睪吸蟲引起的膽管纖維化和野生型小鼠因感染華支睪吸蟲而引起 HSCs 的激活增加。

轉(zhuǎn)化生長因子是介導(dǎo)纖維化的最強(qiáng)效的介導(dǎo)因子且參與 HSCs 的激活，研究[23]表明，這種通路也參與華支睪吸蟲引起的纖維化。但僅有轉(zhuǎn)化生長因子基因轉(zhuǎn)移的小鼠最終不能發(fā)展成為肝臟纖維化，其過程需要協(xié)同因子的參與[30]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子的虛擬受體在華支睪吸蟲感染的TLR4野生型小鼠和被華支睪吸蟲的分泌—排泄產(chǎn)物處理后的 HSCs 中表達(dá)顯著降低。因轉(zhuǎn)化生長因子的虛擬受體表達(dá)于HSCs表面，從而會(huì)通過轉(zhuǎn)化生長因子介導(dǎo)HSCs的活化，造成虛擬受體的下調(diào)[20,31-32]。在TLR4基因敲除后，轉(zhuǎn)化生長因子的虛擬受體的表達(dá)顯著增加，下游pSmad2/3減少，且研究數(shù)據(jù)表明，TLR4介導(dǎo)的TNF-α通過NF-κB抑制虛擬受體的轉(zhuǎn)錄活性[33]。在 TLR4信號(hào)通路被敲除后膽管上皮細(xì)胞(BECs)受到ESPs刺激時(shí)，TNF-α的表達(dá)顯著降低[34]。因此可以想到 TLR4 信號(hào)通路缺失導(dǎo)致TNF-α降低是造成轉(zhuǎn)化生長因子的虛擬受體表達(dá)上調(diào)的原因，從而不利于激活HSCs和寄生蟲引起的膽管纖維化。

總之，目前的研究為寄生蟲引起的肝膽管纖維化的作用提供了證據(jù)，這些證據(jù)可能有助于更好地理解寄生蟲引起的肝膽管纖維化發(fā)展時(shí)發(fā)生的先天性免疫反應(yīng)。鑒于Toll樣受體參與寄生蟲引起的肝膽管纖維化，Toll樣受體信號(hào)通路需要我們進(jìn)一步探索及研究。

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