環(huán)狀RNAs在肝細(xì)胞癌中的作用*

周旭紅 居林玲 顧春燕 邵建國 卞兆連#

南京中醫(yī)藥大學(xué)1(210023) 南通大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院 南通市肝病研究所2

一、環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)概述

CircRNAs是一類新型的內(nèi)源性非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)，大量存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，具有多種生物學(xué)功能。CircRNAs最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，1976年Sanger等[1]在一些植物的類病毒中首次觀察到這種通過共價鍵首尾相連的閉合環(huán)狀RNA。1979年Hsu等[2]首次通過電子顯微鏡觀察到在部分真核生物的細(xì)胞質(zhì)中亦存在共價連接的circRNAs。然而，circRNAs一度被認(rèn)為是前體RNA剪接過程中發(fā)生的錯誤，并未引起研究者的足夠重視，研究進(jìn)程被一再擱置。直至2012年Salzman等[3]首次采用高通量RNA測序(RNA-sequencing,RNA-seq)對circRNAs進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)circRNAs具有多種生物學(xué)功能，是細(xì)胞基因表達(dá)的一種普遍形式，廣泛存在于人類組織中，是數(shù)百種人類基因的主要轉(zhuǎn)錄形式，circRNAs與人類生命活動存在密切聯(lián)系。諸多研究表明，circRNAs廣泛參與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展，在多種癌癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，可作為潛在的疾病診斷和預(yù)測生物學(xué)標(biāo)志物，為癌癥的診斷和靶向治療提供新思路。至此掀起circRNAs的研究熱潮。

CircRNAs是一類新型ncRNAs，與經(jīng)典線性剪接不同，circRNAs的形成通過反向剪接將下游5’位剪接供體與上游3’位剪接受體連接，通過共價鍵形成閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核糖核酸酶R(RNase R)降解[4]。CircRNAs的表達(dá)具有普遍性、保守性、組織特異性、細(xì)胞特異性、發(fā)育階段特異性、穩(wěn)定性等特征[5-6]，可能在諸多生理病理過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。近年來，circRNAs與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注，研究[7-9]發(fā)現(xiàn)circRNAs在胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中存在差異表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián)，提示circRNAs可作為潛在的臨床生物學(xué)標(biāo)志物和腫瘤治療靶標(biāo)，在腫瘤預(yù)防、診斷、治療等方面具有重要價值。

二、CircRNAs的功能

CircRNAs擁有微RNA(miRNA)應(yīng)答元件(miRNA response element,MRE)，是競爭性內(nèi)源性RNAs(ceRNAs)的一種類型，能競爭性結(jié)合miRNA，抑制其與靶標(biāo)結(jié)合，從而調(diào)控靶基因表達(dá)[5-6]。部分circRNAs相較一般ceRNAs具有更多的 miRNA結(jié)合位點，能更好地抑制miRNA活性，具有強效吸附miRNA的作用。CircRNAs作為miRNA海綿吸附miRNA并調(diào)控其功能是circRNAs參與癌癥發(fā)生、發(fā)展過程的重要機制[10-11]。

Zhang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞核內(nèi)，內(nèi)含子來源的circRNAs ci-ankrd52在其轉(zhuǎn)錄位點大量聚集，并促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)依賴的轉(zhuǎn)錄過程。敲低ci-ankrd52可導(dǎo)致其親本基因表達(dá)下調(diào)。Li等[13]亦發(fā)現(xiàn)circEIF3J和circPAIP2可通過順式調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)其親本基因的表達(dá)。上述研究提示circRNAs參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。Ashwal-Fluss等[14]的研究發(fā)現(xiàn)circMbl及其側(cè)翼內(nèi)含子包含保守的MBL結(jié)合位點，且由MBL特異性約束，MBL可促進(jìn)circMbl的合成。當(dāng)MBL過多時，circMbl合成增加，相應(yīng)的線性RNA合成減少，使MBL轉(zhuǎn)錄減少，從而減少MBL含量，反之亦然。提示circRNAs可通過競爭調(diào)控前體RNA的修飾，影響剪接與后剪接相互作用，從而調(diào)節(jié)線性RNA的生成。

2017年Legnini等[15]發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609通過剪接依賴和帽獨立的方式翻譯蛋白質(zhì)，為真核生物circRNAs編碼蛋白質(zhì)提供了依據(jù)。2018年Yang等[16]證實circ-FBXW7翻譯形成的蛋白FBXW7-185aa可協(xié)同母基因編碼的FBXW7蛋白調(diào)控原癌基因c-myc蛋白的穩(wěn)定性，抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。Du等[17]發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21結(jié)合形成circ-FOXO3-CDK2-p21三元復(fù)合物，抑制CDK2與細(xì)胞周期蛋白A、E的聯(lián)系，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)展。上述研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs既能翻譯蛋白質(zhì)，同時亦能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，調(diào)控蛋白功能，進(jìn)一步拓展了circRNAs的功能研究領(lǐng)域。

三、CircRNAs與肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的關(guān)系

HCC是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，每年全球近75萬患者死于肝癌，高居全球癌癥相關(guān)性死亡原因第3位，且發(fā)病率呈不斷增加趨勢，嚴(yán)重危害人類生命健康[18]。病毒性肝炎、酒精性肝病、黃曲霉素等被認(rèn)為是HCC的危險因素[19]，但具體發(fā)病機制尚未完全明確，且缺乏早期診斷的臨床生物學(xué)標(biāo)志物。目前臨床最常用的檢測HCC的標(biāo)志物是甲胎蛋白(AFP)，但其特異性和敏感性均不理想[20]。2010年版美國肝病研究學(xué)會(AASLD)指南已不再將AFP作為篩查HCC的首選指標(biāo)[21]。治療方面，目前臨床常用的治療HCC的方法主要是外科手術(shù)，但僅約30%的患者在確診HCC后可行手術(shù)治療。其他治療方法主要包括肝移植、經(jīng)皮局部消融、動脈栓塞、放化療等，經(jīng)過綜合臨床治療，目前HCC 5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%以上[22]。HCC高致死率、高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率的特點，使尋找HCC的早期診斷標(biāo)志物和新型靶向治療方法成為近年的研究熱點。

Conn等[23]發(fā)現(xiàn)大量circRNAs在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中受調(diào)節(jié)，而EMT是胚胎發(fā)育過程中重要的生物學(xué)行為，在腫瘤的形成、演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。因此，推測circRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色。與相應(yīng)癌旁組織相比，circRNAs在腫瘤組織中差異表達(dá)，表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)，推測其起致癌或抑癌作用。盡管許多circRNAs以低水平表達(dá)，但部分circRNAs含量較同一基因來源的線性RNA更為豐富，甚至為線性RNA的10余倍[24]，且circRNAs在唾液、血液和外泌體中的表達(dá)較線性RNA更穩(wěn)定，可作為癌癥診斷、預(yù)后以及治療反應(yīng)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[25-26]。

Ren等[27]采用系統(tǒng)生物學(xué)方法構(gòu)建并分析circRNAs在HCC中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。共檢測到127個差異表達(dá)的circRNAs和3 235個差異表達(dá)的miRNA，選取其中前5個上調(diào)的circRNAs構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其參與癌癥相關(guān)通路，如p53信號通路以及關(guān)于血管新生和細(xì)胞周期的通路等。進(jìn)一步采用熒光定量PCR法驗證此5個circRNAs，結(jié)果顯示circZFR、circFUT8和circIPO11在HCC中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織，且具有促進(jìn)HCC增殖、分化的作用。circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)可能有助于進(jìn)一步揭示HCC的分子機制。

Shang等[28]對33例HCC患者的癌組織和相應(yīng)癌旁組織circRNAs表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)61個circRNAs差異表達(dá)，其中26個circRNAs上調(diào)，35個circRNAs下調(diào)。其中hsa_circ_0005075在HCC組織中顯著上調(diào)，其表達(dá)變化與腫瘤大小相關(guān)，且顯示出較高的診斷價值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005075可通過影響細(xì)胞黏附參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。Huang等[29]通過circRNAs微陣列分析4例HCC患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織，確定了226個差異表達(dá)的circRNAs，其中189個上調(diào)，37個下調(diào)。circRNA-100338表達(dá)在HCC組織中顯著上調(diào)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-100338在HCC中充當(dāng)miR-141-3p的內(nèi)源性海綿，與miR-141-3p相互拮抗，調(diào)控HCC的侵襲性。Yu等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA Cdr1as(ciRS-7)在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，可能通過與miR-7相互作用，抑制CCNE1和PIK3CD基因表達(dá)，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和侵襲。Xu等[31]的研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中Cdr1as高表達(dá)與肝微血管侵犯(MVI)、AFP水平和年齡相關(guān)，是肝MVI的獨立因素之一，Cdr1as有望成為肝MVI生物學(xué)標(biāo)志物和抑制肝MVI的新型治療靶點。既往有研究發(fā)現(xiàn)，HCC的發(fā)病可能與性激素相關(guān)[32]。Shi等[33]分析了HCC細(xì)胞中雄激素受體(AR)對circRNAs表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR通過上調(diào)RNA編輯酶ADAR1，抑制circRNAs表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AR可能通過調(diào)控circARSP91(hsa_circ_0085154)的表達(dá)，參與原發(fā)性HCC的發(fā)病機制。上述研究表明circRNAs可在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，通過不同的機制參與HCC發(fā)病。

Yao等[34]的研究結(jié)果顯示，circZKSCAN1在HCC組織中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)癌旁組織。 circZKSCAN1通過與ZKSCAN1 mRNA相互作用，可抑制HCC生長、遷移和侵襲。Qin等[35]分析了89例HCC及其相應(yīng)癌旁組織發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001649的表達(dá)在HCC組織中較癌旁組織顯著下調(diào)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001649的表達(dá)水平與腫瘤大小和栓塞的發(fā)生呈正相關(guān)。Fu等[36-37]的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005986和hsa_circ_0004018在HCC中的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)癌旁組織，且與腫瘤大小、分化程度、TNM分期以及AFP水平等相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005986下調(diào)可促進(jìn)G0/G1期至S期的轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖，此過程主要依靠miRNA海綿的吸附作用實現(xiàn)。hsa_circ_0004018表達(dá)伴隨疾病進(jìn)展而逐漸下降。此外，F(xiàn)u等[38]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003570表達(dá)在HCC組織中亦發(fā)生下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、數(shù)量、肝硬化程度、血管侵襲、微血管浸潤以及腫瘤分級等相關(guān)，且在慢性肝炎、肝硬化和HCC中的表達(dá)水平逐漸降低。Zhang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001445在HCC組織中的表達(dá)顯著降低，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。進(jìn)一步研究顯示，hsa_circ_0001445在HCC患者中的表達(dá)水平顯著低于肝硬化、乙型肝炎患者和正常人。Yu等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，HCC中hsa_circ_0001445表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞侵襲性顯著相關(guān)，且是HCC切除術(shù)后患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存期的獨立危險因素。其機制可能為，hsa_circ_0001445作為miR-17-3p和miR-181b-5p海綿，可促進(jìn)腫瘤抑制因子金屬蛋白酶組織抑制劑3(TIMP3)表達(dá)，發(fā)揮抑制HCC增殖、遷移等作用。Han等[41]的研究顯示circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135)表達(dá)在HCC組織中顯著下調(diào)，通過吸附miR-9，促進(jìn)p21表達(dá)，進(jìn)而抑制HCC進(jìn)展。circMTO1表達(dá)降低與HCC患者預(yù)后差顯著相關(guān)。上述研究顯示，circRNAs在HCC中表達(dá)下調(diào)，其主要作為miRNA海綿，吸附miRNA發(fā)揮生物學(xué)作用，可能與HCC預(yù)后潛在相關(guān)。

四、結(jié)語和展望

在過去數(shù)十年中，circRNAs一直被認(rèn)為是RNA剪接過程中的“噪音”，隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的發(fā)展，circRNAs的生理功能及其與疾病間的關(guān)系不斷被發(fā)掘，其在生理和病理過程中具有重要價值，已成為新的研究熱點。circRNAs具有高度的組織和細(xì)胞特異性，且在體液中具有更高的穩(wěn)定性，在HCC的診斷和預(yù)后判斷等方面具有良好的應(yīng)用前景。circRNAs作為miRNA海綿，可抑制miRNA的功能，為HCC的靶向治療提供了新思路。諸多研究證實，circRNAs可通過多種機制參與HCC的發(fā)生、發(fā)展，但其表達(dá)豐度較低，且目前對circRNAs的研究尚處于起步階段，具體作用機制尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步研究探索?，F(xiàn)階段應(yīng)加快對circRNAs的研究進(jìn)程，逐步完善circRNAs相關(guān)數(shù)據(jù)庫，建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測方案，以期實現(xiàn)從基礎(chǔ)向臨床的轉(zhuǎn)化。