基于近紅外量子點的熒光共振能量轉移生物探針構建及應用

修景銳，胡思怡，李金華*，任 升，劉麗煒

(1.長春理工大學 理學院，吉林 長春 130022；2.深圳大學 光電工程學院，廣東 深圳 518060)

1 引 言

熒光共振能量轉移(FRET)是一種通過熒光物質間發(fā)生非輻射能量轉移進行分析的光譜分析法[1-2]。自該理論提出以來，F(xiàn)RET已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、司法鑒定和科學研究的各個領域中[3-8]。

近年來，F(xiàn)RET技術在空間分辨率、敏感性方面有很大的提高，根據(jù)FRET設計的傳感器在生物學研究領域得到廣泛應用，如檢測生物大分子的構象變化、生物大分子之間的相互作用、生物分子間納米尺度的距離等[9-12]。研究表明能量供受體的光學性質及傳感器的組裝方法對FRET傳感器的檢測性能有至關重要的影響[13]，然而傳統(tǒng)的能量供受體(如有機熒光染料、生物材料、鑭系元素等)由于熒光強度低、光穩(wěn)定性弱、對環(huán)境敏感、生物相容性較差，并且毒性較大，容易受到生物體內(nèi)自發(fā)熒光和雜散光干擾，導致出現(xiàn)熒光強度下降、生物檢測達不到預期目標等缺點，從而限制了FRET傳感器的發(fā)展與應用[14-19]。

目前，南京工業(yè)大學課題組[20]將近紅外FRET體系應用于光動力治療方面進行研究，一定程度上改善了可見FRET體系的缺點，達到了更好的治療效果，但目前近紅外FRET體系作為敏感型探針的研究依然比較缺乏。

本文構建了近紅外區(qū)域的FRET體系，供體為熒光發(fā)射峰在近紅外的InP/ZnS量子點，受體為吸收在近紅外的熒光染料Cy7(C45H44K3N3O16S4)。彌補了傳統(tǒng)可見光量子點在生物應用中的缺陷。同時對該體系進行濃度和細胞微環(huán)境pH敏感性檢測，結果表明FRET體系的熒光強度可直接反映細胞微環(huán)境的酸堿度變化，對體系pH值有較高的檢測精度，本研究為FRET體系作為敏感型探針應用于癌癥早期診斷提供了理論和實驗依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗試劑與儀器

實驗試劑：醋酸銦(In(Ac)3)，硬脂酸鋅(Zn(St)2)，十二烷基硫醇(DDT)，購于Alfa公司；肉豆蔻酸(MA)，購于TCI公司；1-十八烯(ODE)，購自Sigma公司；二硫代蘇糖醇(DTT)，磷化鋅(Zn3P2)購買于國藥上海試劑公司。氫氧化鈉，鹽酸以上藥品均購于國藥試劑。熒光染料Cy7(C45H44K3N3O16S4)，購于武漢斯奈德生命科技有限責任公司。實驗所用溶劑如不作特殊說明均用超純水(HPLC),購于Alfa公司。DMEM高糖培養(yǎng)液，其中含有10%的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，100 μg/mL的盤尼西林和100 μg/mL的鏈霉素，均購于Gibco公司。

實驗儀器：高精度電子天平(Sartorius，Quintix224-1cn)，磁力攪拌器加熱臺(Thermo Scientific，Cimarec)，超聲清洗器，恒溫水浴箱，移液器，紫外-可見-近紅外分光光度計(Agilent，Cary 5000 UV-Vis-NIR)，熒光分光光度計(Agilent，Cary Eclipse)，透射電子顯微鏡， FLS980超快熒光壽命光譜儀，熒光倒置顯微鏡(DMI3000，Leica，德國)。

2.2 實驗方法

量子點的制備：將0.2 mmol的醋酸銦，0.6 mmol的肉豆蔻酸和15 mL 1-十八烯在氮氣保護下保持110 ℃加熱1 h，獲得In前驅液。將3 mL鹽酸(4 M)注入磷化鋅，生成的磷化氫氣體通入到加熱至240 ℃的In前驅液中，獲得InP量子點。將0.6 mmol硬脂酸鋅溶解于2 mL 1-十八烯中并加熱至120 ℃后，將其注入InP量子點溶液中，形成InP/ZnS復合物，最后，將加熱至260 ℃的十二烷基硫醇(0.6 mmol)加入InP/ZnS復合物，反應1 h后獲得InP/ZnS量子點。

上一步驟中制備了油性的InP/ZnS量子點，我們接下來對油性量子點進行了表面修飾，以便其更好的生物應用，具體修飾方法如下：將1 mL甲醇，1 mL氯仿，4 mL MPA和油性量子點混合攪拌5 min，向攪拌后的混合溶液中加入3%的NH4OH，繼續(xù)攪拌5 h，獲得水溶性InP/ZnS量子點。

FRET體系的構建:將InP/ZnS量子點溶液和Cy7熒光染料摩爾比例1∶0、1∶0.01、1∶0.02、1∶0.03、1∶0.04和1∶0.05混合加入反應樣品瓶中，在常溫、常壓條件下攪拌5 min，對混合溶液進行測定。

熒光光譜測定：在室溫條件下，依次取1 mL的量子點與染料構建FRET體系溶液，以600 nm為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5 nm，記錄620 nm到850 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜變化。

傅里葉紅外光譜測定：50 ℃下將InP/ZnS量子點，Cy7熒光染料和FRET體系烘干成粉末狀備用。分別將3種待測樣品與溴化鉀粉末以1∶10的比例混合后充分研磨，將混合后的粉末進行壓片處理，獲得待測樣品。

MCF-7乳腺癌細胞熒光成像：用于熒光成像的MCF-7乳腺癌細胞在使用前要分種在6孔培養(yǎng)板中。實驗前的細胞需培養(yǎng)24 h，密度在60%～70%即可。用于熒光成像的FRET體系樣品按照10～20 μg/mL的濃度溶于PBS中(pH=7.2)。向六孔板的每個孔中加入20～40 μL的樣品，輕輕搖勻后，在37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，移去培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并進行熒光成像研究。

3 結果與討論

3.1 InP/ZnS量子點-Cy7熒光染料FRET體系的構建

由圖1可知，InP/ZnS量子點的發(fā)射光譜與Cy7染料的吸收光譜有較大的重疊面積，圖中的陰影部分為重疊部分。而InP/ZnS量子點的發(fā)射光譜與染料的發(fā)射光譜相距較遠，最大發(fā)射峰值相差60 nm，有效避免了供受體之間的熒光干擾。所以InP/ZnS量子點和Cy7熒光染料符合構建FRET體系的基本條件[21-22]，其中InP/ZnS量子點和Cy7染料分別作為FRET體系的供體和受體。

圖1 InP/ZnS量子點和Cy7熒光染料的吸收和發(fā)射光譜對比圖 Fig.1 Comparison of absorption and emission spectra of InP/ZnS quantum dots and Cy7 fluorescent dyes

根據(jù)實驗室經(jīng)驗，供體InP/ZnS量子點表面游離的羧基(—COOH)能與受體染料Cy7表面游離的氨基(—NH2)通過化學鍵和的方式相連接，以拉近供受體之間的距離。為了驗證該結論，我們利用傅里葉紅外光譜測試(FTIR)對InP/ZnS量子點與染料Cy7之間化學鍵合的情況進行驗證。在圖2中，InP/ZnS量子點溶液在1 650 cm-1(COO—)處有振動峰的存在，Cy7染料在3 438 cm-1(NH2)處有振動峰存在。供體InP/ZnS量子點與受體Cy7染料的結合是通過Cy7上的—NH2和量子點表面的—COOH(來自于量子點的表面修飾劑MPA)，脫水縮合形成的肽鍵(—CO—NH—)。圖2中曲線1代表了InP/ZnS量子點和Cy7染料構建的FRET體系，InP/ZnS-Cy7染料在1 576 cm-1(—CO—NH—)處的振動峰存在，確定了兩種樣品成功結合，這個1 576 cm-1的振動峰在InP/ZnS量子點和Cy7單獨的紅外光譜中均不存在。而且，伴隨著1 576 cm-1(—CO—NH—)的出現(xiàn)InP/ZnS量子點上的1 650 cm-1(COO—)振動峰明顯減弱，這進一步確認了InP/ZnS量子點與Cy7染料之間的化學鍵合過程的成功實現(xiàn)。

圖2 InP/ZnS量子點，Cy7，F(xiàn)RET體系的FTIR光譜 Fig.2 FTIR spectra of InP/ZnS quantum dots, Cy7 fluorescent dyes and FRET system

3.2 InP/ZnS量子點和Cy7染料濃度對FRET體系的影響

不同濃度的InP/ZnS量子點與Cy7染料構建FRET體系。如圖3(a)所示，當Cy7染料濃度不變時，隨著量子點濃度的增加(0.1～0.5 μmol/L)，Cy7染料的熒光強度會明顯增強，可以看出量子點與染料之間發(fā)生了熒光共振能量轉移。隨著供體InP/ZnS量子點濃度的增加，F(xiàn)RET體系的熒光共振能量轉移效率逐漸減小，如圖3(b)所示，這是因為隨著供體分子數(shù)量的增多，圍繞在單個供體附近的受體分子平均數(shù)目減少，體系的熒光共振能量轉移效率減少。本論文轉移效率是基于熒光強度計算的，Styrer和Haugland 給出[23]，同理，保持量子點濃度不變，改變Cy7染料的濃度，獲得FRET體系的變化情況如圖4所示。從圖4(a)中可以看出，隨著Cy7染料濃度的增加，量子點的熒光強度隨之減小。通過公式(1)，計算得到了改變Cy7染料后的熒光共振能量轉移效率，如圖4(b)所示。從圖4(b)中可以看出，隨著受體濃度的增加，F(xiàn)RET體系能量轉移效率逐漸增大，但當QDs:Cy7小于1:250后，熒光共振能量轉移效率達到最大，因為當Cy7染料濃度增加到一定程度時，量子點周圍圍繞的受體染料分子供數(shù)目達到飽和。

(1)

式中，ID-A、ID分別代表有受體和無受體時供體的熒光強度。這樣，通過測量供體的熒光強度可以計算出熒光共振能量轉移的效率E。

圖3 改變InP/ZnS量子點濃度時的FRET體系(a)熒光光譜圖(b)相應的FRET轉換效率 Fig.3 FRET system when the InP / ZnS quantum dot concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency

圖4 改變Cy7濃度時的FRET體系(a)熒光光譜圖(b)相應的FRET轉換效率 Fig.4 FRET system when the Cy7 concentration is changed. (a)Fluorescence spectra (b)FRET conversion efficiency

3.3 pH值對FRET體系的影響

如圖5所示，將Cy7染料和InP/ZnS量子點分別溶在pH值為4、7、10、12的去離子水中進行熒光光譜的測試。從圖5(a)中可以看出，隨著溶液pH值從4升至12，溶液中染料的熒光強度沒有明顯的改變，可以說明染料本身對pH值不敏感。但從圖5(b)可以明顯看出，隨著溶液pH值的改變，量子點的熒光強度有明顯的變化，強酸性條件下，量子點的熒光強度最弱，這是因為溶液中較為豐富的H+抑制了量子點表面羧基的解離。相反當溶液偏堿性時，其中會有含有豐富的OH-，能夠促進羧基的解離，但過高的pH值同樣會降低量子點的熒光。

圖5 Cy7(a)和InP/ZnS量子點(b)在不同pH值溶液中的熒光光譜圖 Fig.5 Fluorescence spectra of Cy7(a) and InP/ZnS quantum dots(b) in different pH solutions

測試了供受體對pH值的響應之后，通過調(diào)節(jié)FRET體系(InP/ZnS-Cy7)的pH值，驗證該體系的對pH值的敏感性。癌細胞形成初期表現(xiàn)是pH值的微弱改變，因此，本文擬利用自行構建的FRET體系對pH值的敏感性實現(xiàn)對不同pH值緩沖液的監(jiān)測，最終應用于癌細胞微環(huán)境檢測，實現(xiàn)癌癥早期診斷。如圖5所示，驗證了pH值的微弱改變(pH=6.7～9.1)對體系的熒光強度的影響。在一定范圍內(nèi)，pH值的降低，體系的熒光強度逐漸減弱，呈現(xiàn)出明顯趨勢，實驗結果表明該體系可以作為pH值敏感型生物探針。

圖6 FRET體系在不同pH值溶液中的熒光光譜圖 Fig.6 Fluorescence spectra of FRET system in different pH solutions

3.4 FRET體系對生物微環(huán)境檢測的應用

為了驗證InP/ZnS-Cy7體系生物應用的可行性，首先采用MTT比色分析法對體系的細胞毒性進行測試，具體測試過程如下：

利用96孔板培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細胞，F(xiàn)RET體系按照濃度梯度為4、2、1、0.5和0.25 nmol/mL溶解，向孔中分別加入不同濃度的待測樣品，搖勻后置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)24 h，確保樣品進入細胞并對細胞產(chǎn)生作用。24 h后，取出含有樣品的96孔板，向每個孔中加入5 μg/mL的MTT溶液20 μL，搖勻后再培養(yǎng)4 h，活細胞的線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚。抽取孔上層溶液后加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO，購于Sigma)，利用酶標儀在495 nm處對其進行掃描，得到細胞活性數(shù)據(jù)。如圖7所示，24 h后，隨著InP/ZnS-Cy7體系濃度的增加，細胞活性雖然有所降低，但總體細胞活性均保持在60%以上，具有良好的生物兼容性，可以進行相關的生物研究和應用。

圖7 FRET體系的細胞毒性測試 Fig.7 Relative cell viability of MCF-7 breast cancer cell treated with FRET system

為了證明該體系可以作為熒光探針對生物微環(huán)境進行檢測，便于未來應用于癌癥的早期診斷研究中。我們應用所構建的近紅外熒光探針對不同的細胞微環(huán)境進行了檢測，分別采用高糖培養(yǎng)基(DMEM)、50%密度的巨噬細胞(RAW 264.7)培養(yǎng)48 h后的含有代謝產(chǎn)物的細胞外液、50%密度的MCF-7乳腺癌細胞培養(yǎng)48 h后的含有代謝產(chǎn)物的細胞外液作為檢測溶液，測試所獲的熒光光譜如圖8所示?？梢悦黠@看到，探針的熒光隨著細胞外液酸堿度的變化而產(chǎn)生明顯變化，通過與精確pH試紙(MN,MACHEREY-NAGEL,德國)比對，該FRET體系對細胞微環(huán)境pH值檢測精度可達到0.1，在乳腺癌細胞外液中的FRET體系的熒光強度最弱。

圖8 FRET體系對不同細胞微環(huán)境的檢測 Fig.8 Detection result of different cell microenvironment by FRET system

量子點良好的熒光信號決定了所構建的FRET體系除了能夠實現(xiàn)癌細胞的pH值敏感度檢測外，還能夠實現(xiàn)癌細胞的熒光標記。圖9顯示了FRET體系對MCF-7乳腺癌細胞的成像實驗。從明場圖像可以看出對照組和實驗組細胞生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)正常，呈不規(guī)則多邊形，沒有發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)的變化，或細胞壁破損的情況，說明該FRET體系毒性較低。通過暗場熒光圖可以看出，相比對照組，實驗組的細胞內(nèi)具有來自于FRET體系的明顯熒光信號，證明該FRET體系可作為熒光探針對乳腺癌進行熒光標記。

圖9 FRET體系對MCF-7乳腺癌細胞的熒光標記 Fig.9 Fluorescently label in MCF-7 breast cancer cells by FRET system

4 結 論

本文采用近紅外InP/ZnS量子點與近紅外Cy7染料構建FRET體系，通過改變體系中量子點和Cy7染料的濃度對FRET體系轉移效率的影響進行了討論分析。最后，研究了不同pH值溶液對FRET體系的影響，結果顯示Cy7染料本身對pH值并不敏感，F(xiàn)RET體系對pH值的敏感性主要源于量子點對pH值的敏感性，當溶液pH值處在7～10時，F(xiàn)RET體系具有較高的FRET轉移效率。細胞測試結果表明，F(xiàn)RET探針的熒光信號隨著細胞外液酸堿度的變化而產(chǎn)生明顯變化，可用于生物微環(huán)境中對癌細胞的檢測。同時，乳腺癌細胞外液中的FRET體系的明顯熒光信號可以應用于癌細胞成像，實現(xiàn)了FRET體系的雙重功能。

[1] 胡珊.熒光共振能量轉移體系的研究及其在均相免疫分析中的應用[D].武漢：華中科技大學，2010.

HU SH. Sudy on fluorescence resonance energy transfer system and its application in homogeneous immunoassay[D]. WuHan：Huazhong University of Science and Technology,2010.(in Chinese)

[2] FORSTER T. Intermolecular energy migration and fluorescence[J].Ann.Physics,1948,2:55-75.

[3] 郭堯君.熒光實驗技術及其在分子生物學中的應用[M].北京：科學出版社，1979.

GUO Y J.FluorescenceExperimentalTechniquesandTheirApplicationsinMolecularBiology[M]. Beijing:Science Press,1979.(in Chinese)

[4] LAKOWICZ J R.EnergyTransfer:InPrinciplesofFluorescenceSpectroscopy[M]. New York:Plenum Press,1983.

[5] CLEGG R.FluorescenceImagingSpectroscopyandMicroscopy[M]. NewYork:Wiley,1996.

[6] ANGELIS D A D.FluorescenceResonanceEnergyTransferFret[M]. Encyclopedia of Medical Genomics and Proteomics.2004:1420.

[7] FENG Y SH,LIU L W,HU S Y,etal.. F?rster resonance energy transfer properties of a new type of near-infrared excitation PDT photosensitizer: CuInS2/ZnS quantum dots-5-aminolevulinic acid conjugates[J].RSCAdv.,2016,6:55568-55576.

[8] FENG Y SH,LIU L W,HU S Y,etal.. Four-photon-excited fluorescence resonance energy transfer in an aqueous system from ZnSe:Mn/ZnS quantum dots to hypocrellin A[J].OpticsExpress,2016,24(17):19627-19637.

[9] KIKUCHI K,TAKAKUSA H,NAGANO T. Recent advances in the design of small molecule-based FRET sensors for cell biology[J].TrendsinAnalyticalChemistry,2004,23(6):407-415.

[10] JANSSEN A,BEERLING E,MEDEMA R,etal.. Intravital FRET imaging of tumor cell viability and mitosis during chemotherapy[J].PLoSOne,2013,8(5):e64029.

[11] YUAN L,LIN W,ZHENG K,etal.. FRET-based small-molecule fluorescent probes:rational design and bioimaging applications[J].AccountsofChemicalResearch,2013,46(7):1462-1473.

[12] TAO H L,LIAO X F,etal.. Determination of trace Hg2+ions based on the fluorescence resonance energy transfer between fluorescent brightener and CdTe quantum dots[J].JournalofLuminescence,2014,146: 376-381.

[13] JIANG G F,TANG Y. A novel two-photon fluorescent probe for hydrogen sulfide in living cells using an acedan-NBD amine dyad based on FRET process with high selectivity and sensitivity[J].NewJournalofChemistry,2017,41(14):6769-6774.

[14] WANG Y,SI B,LU S,etal.. Near-infrared excitation of CdTe quantum dots based on fluorescence resonance energy transfer and their use as fluorescent sensors[J].Sensors&ActuatorsBChemical,2017,246:127-135.

[15] 張旭霞,李斌,張黎明,等.有機-無機復合納米材料的傳感應用及機理[J].中國光學,2015,8(4):651-666.

ZHANG X X,LI B,ZHANG L M,etal.. Sensing application and mechanism of organic-inorganic nanocomposites[J].ChineseOptics,2015,8(4):651-666.(in Chinese)

[16] 翟英歌,楚學影,徐銘澤,等.ZnS∶Cu-羅丹明B的熒光共振能量轉移性質[J].發(fā)光學報,2017,38(8):1028-1032.

ZHAI Y G,CHU X Y,XU M Z,etal.. Properties of fluorescence resonance energy transfer of ZnS:Cu-rhodamine B[J].ChineseJournalofLuminescence,2017,38(8):1028-1032.(in Chinese)

[17] 袁曦,鄭金桔,李海波,等.Mn摻雜ZnSe量子點變溫發(fā)光性質研究[J].中國光學,2015,8(5):806-813.

YUAN X,ZHENG J J,LI H B,etal.. Temperature-dependent photoluminescence properties of Mn-doped ZnSe quantum dots[J].ChineseOptics,2015,8(5):806-813.(in Chinese)

[18] 王英帥,周穎,王珺楠,等.金納米棒核/二氧化硅殼納米復合結構的可控制備及細胞成像[J].中國光學,2013,6(5):743-749.

WANG Y SH,ZHOU Y,WANG J N,etal.. Controlled synthesis and cell imaging of gold nanorod-silica core-shell nanoparticles[J].ChineseOptics,2013 6(5):743-749.(in Chinese)

[19] 劉姝妤,鐘綿增,孟秀清,等.ZnO/ZnS核-殼量子點的雙光子吸收效應[J].發(fā)光學報,2015,36(2):249-255.

LIU SH Y,ZHONG J Z,MENG X Q,etal.. Two-photon absorption in ZnO/ZnS core-shell quantum dots[J].ChineseJournalofLuminescence,2015,36(2):249-255.

[20] 劉惠玲.納米材料內(nèi)部FRET體系的設計及在單/雙光子光動力治療中的潛在應用[D].南京:南京工業(yè)大學,2016.

LIU H L. Design of FRET system in nanomaterials and its potential application in single/two photon photodynamic therapy[D]. Nanjing:Nanjing University of Technology,2016.(in Chinese)

[21] REMEDIOS C G,MOENS P D. Fluorescence resonance energy transfer spectroscopy is a reliable “ruler” for measuring structural changes in proteins-dispelling the problem of the unknown orientation factor[J].JournalofStructuralBiology,1995,115(2):175-185.

[22] LIU L. Quantum dots:the new development of FRET[J].ProgressinChemistry,2006,18(2):337-343.

[23] STEYER L,HAUGLANG R P. Energy transfer:a spectroscopic ruler[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1967,58(2):719.