原發(fā)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移胃腸道間質(zhì)瘤KIT及PDGFRA突變與臨床病理特征間的關(guān)系

顧怡瑾，李安琪，董 磊，許海敏，申 霞，謝嘉玲，袁 菲，王朝夫

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院病理科，上海 200025）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見(jiàn)的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1%～4%[1]。原癌基因KIT 和血小板源性生長(zhǎng)因子受體α（platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRA) 基因檢測(cè)不僅在原發(fā)性GIST 診斷及其與梭形細(xì)胞腫瘤等鑒別診斷方面具有輔助價(jià)值，在預(yù)測(cè)患者分子靶向治療藥物療效上均具有重要意義[2]。雖然手術(shù)切除是目前治療GIST 的首選方法，然而很多患者在初次診療時(shí)即存在轉(zhuǎn)移性GIST[3]。此外，部分原發(fā)性GIST 患者在使用了靶向藥物后亦會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。本研究擬觀(guān)察這部分患者腫瘤組織中KIT、PDGFRA 基因的突變狀態(tài)，以期為晚期GIST 患者提供更多治療機(jī)會(huì)。

有研究示，攜帶不同基因變異類(lèi)型的GIST 患者可能表現(xiàn)出不同的臨床特點(diǎn)和預(yù)后[4]。針對(duì)不同基因變異，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于GIST 治療的靶向藥物不同。目前，一線(xiàn)靶向藥物甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，IM）是KIT 和PDGFRA 激酶域的ATP 結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其可阻礙底物磷酸化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制GIST 生長(zhǎng)。攜帶KIT 基因外顯子11 突變的患者對(duì)IM 治療敏感[5]，其中攜帶KIT 基因外顯子11 缺失突變的GIST患者，與未接受IM 治療的患者相比，其無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)[6]。然而，IM 治療攜帶KIT 基因外顯子9 突變的GIST 患者的療效較差，針對(duì)此類(lèi)突變可使用二線(xiàn)靶向藥物[如舒尼替尼（sunitinib）]進(jìn)行治療[7]。KIT 基因外顯子13 和外顯子17 突變是GIST 二次繼發(fā)性突變的特征，二線(xiàn)靶向藥物舒尼替尼對(duì)治療攜帶KIT 基因13 號(hào)外顯子V654A 點(diǎn)突變的GIST 有效，而三線(xiàn)靶向藥物瑞戈非尼（regorafenib）則可有效治療KIT 基因外顯子17 二次繼發(fā)性突變的GIST 和對(duì)IM、舒尼替尼治療后發(fā)生耐藥的GIST 患者[8-9]。近年來(lái)，阿泊替尼（avapritinib）靶向藥物的研發(fā)也為非KIT 外顯子突變及攜帶PDGFRA 外顯子18 突變（包括PDGFRA D842V 突變）的不可手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性GIST 患者帶來(lái)了治療機(jī)會(huì)[10-12]。因此，評(píng)估不同類(lèi)型KIT 和PDGFRA 基因不同突變模式在臨床診療中具有重要價(jià)值。

本研究收集了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院收治的167 例原發(fā)GIST 患者，其中22 例存在腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。本研究運(yùn)用第一代測(cè)序技術(shù)對(duì)GIST 的原發(fā)灶、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行KIT、PDGFRA基因突變檢測(cè)（KIT 基因?yàn)榈?、11、13、17 號(hào)外顯子，PDGFRA基因?yàn)榈?2、18號(hào)外顯子），總結(jié)GIST 中KIT 和PDGFRA 基因的突變頻率及類(lèi)型，并進(jìn)一步分析其與臨床病理特征之間的相關(guān)性，為GIST 個(gè)體化治療、預(yù)后預(yù)測(cè)提供參考。

資料與方法

一、資料

收集2004年3 月至2020年12 月期間上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院病理科診斷為167 例原發(fā)性GIST 的腫瘤組織石蠟標(biāo)本，其中22 例為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移灶。所有標(biāo)本對(duì)應(yīng)患者的臨床資料均完整。根據(jù)中國(guó)胃腸道間質(zhì)瘤診斷治療專(zhuān)家共識(shí)（2017年版）[13]，分類(lèi)整理其病理組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤部位、直徑及核分裂數(shù)及免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色結(jié)果（DOG1、CD117、CD34 和Ki-67）。

二、方法

1.免疫組化檢測(cè)：所有手術(shù)切除樣本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水后，行石蠟包埋，3 μm 厚切片。采用Dako Omnis 自動(dòng)免疫組化平臺(tái)進(jìn)行En Vision 法染色，一抗均使用Dako FLEX 即用型抗鼠或抗兔一抗，CD117[陽(yáng)性定義為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)染色]、DOG1[陽(yáng)性定義為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)染色]、CD34[陽(yáng)性定義為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)染色]、Ki-67（陽(yáng)性定義為細(xì)胞核染色）。每批染色均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。

染色結(jié)果按染色強(qiáng)度（判定標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞無(wú)著色為0 分，淺黃色為1 分，黃色至棕褐色為2 分，深黃色為3 分）和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行計(jì)量，兩者乘積>3 分為陽(yáng)性[14]。所有結(jié)果均經(jīng)3 位病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)判。所用免疫組化抗體、染色條件、設(shè)備及檢測(cè)系統(tǒng)見(jiàn)表1。

表1 免疫組化檢測(cè)所用抗體、染色條件、設(shè)備及檢測(cè)系統(tǒng)

2.第一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)：采用QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，以DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及毛細(xì)管基因分析儀測(cè)序。本研究對(duì)KIT 基因第9、11、13、17 號(hào)外顯子和PDGFRA 基因第12、18 號(hào)外顯子進(jìn)行測(cè)序[15]。測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)KIT及PDGFRA 基因參考序列進(jìn)行比對(duì)。

3.第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)：采用上海真固生物科技有限公司（包括胃腸道腫瘤35 個(gè)基因）第二代測(cè)序試劑盒制備文庫(kù)，用MiSeq 4000（Illumina）平臺(tái)對(duì)基因組DNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行生物信息分析其基因組變異。

4.臨床資料及隨訪(fǎng)：復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移患者的中位隨訪(fǎng)時(shí)間為64 個(gè)月（10～172 個(gè)月），根據(jù)基因突變模式分析臨床病理特征（如年齡、性別、免疫組化結(jié)果），觀(guān)察KIT、PDGFRA 基因突變狀態(tài)與上述臨床參數(shù)間的相關(guān)性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用Graphpad prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Mann Whitney 檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析基因突變與臨床病理特征間的關(guān)系，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、臨床病理特征

167 例原發(fā)性GIST 患者中男性有79 例，女性有88 例，年齡為16～85 歲，中位年齡為61 歲。腫瘤的原發(fā)部位以胃（90/167，53.9%）為主，其次為小腸（45/167，26.9%），隨后為結(jié)腸直腸（3/167，1.8%）、胃腸道外（29/167，17.4%）。本研究活檢標(biāo)本有14 例，腫瘤切除標(biāo)本153 例；切除腫瘤最大徑為0.2～30.0 cm，中位直徑為5.5 cm。免疫組化結(jié)果包括CD117 陽(yáng)性（98.8%，163/165），DOG1 陽(yáng)性（99.4%，164/165），CD34 陽(yáng)性（88.3%，144/163），Ki-67 增殖指數(shù)范圍0～80%，22 例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者隨訪(fǎng)時(shí)間為10～172 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間64 個(gè)月。

二、原發(fā)灶基因突變特征

1.基因突變與臨床病例特征的關(guān)系：KIT、PDGFRA 基因突變患者與野生型GIST 患者之間的各臨床病理學(xué)特征均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表2）。

2.基因突變率：KIT 和PDGFRA 基因在167 例原發(fā)性GIST 患者中的突變率分別為83.8%（140/167）和3.0%（5/167）。

3.KIT 基因突變：KIT 突變分別位于外顯子11（74.9%，125/167），外顯子9（8.4%，14/167）和外顯子17（0.6%，1/167）。KIT 突變類(lèi)型主要以缺失突變?yōu)橹鳎?0.7%，57/140），其他突變類(lèi)型包括點(diǎn)突變（34.3%，48/140）、插入突變（9.3%，13/140）、重復(fù)突變（3.6%，5/140）、混合突變（插入合并缺失，12.1%，17/140）。KIT 外顯子11 突變中，以點(diǎn)突變V559D最為常見(jiàn)（11.2%，14/125），其次為W557_K558 密碼子的缺失突變（6.4%，8/125）。與攜帶KIT 外顯子11 點(diǎn)突變的GIST（n=45）相比，KIT 外顯子11非點(diǎn)突變（缺失、插入、重復(fù)突變等）類(lèi)型的GIST（n=76）組織中Ki-67 增殖指數(shù)更高（P=0.005 2）（見(jiàn)圖1）。

KIT 外顯子9 突變以Y503_F504 密碼子的插入突變?yōu)橹鳎?0%，7/14）。KIT 外顯子17 存在1 例點(diǎn)突變。

本研究中有1 例標(biāo)本采用第一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，難以解讀KIT 外顯子11 突變（見(jiàn)圖2A），故采用第二代測(cè)序檢測(cè)分析，提示KIT 外顯子11上存在2 段堿基缺失，導(dǎo)致氨基酸p.K550_Q556delinsW（見(jiàn)圖2B）。

4.PDGFRA 基因突變：5 例PDGFRA 基因突變均位于外顯子18，其中4 例為D842V 點(diǎn)突變，突變百分比為2.4%（4/167）；1 例為缺失突變。

三、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移GIST 的臨床病理和基因突變特征

22 例發(fā)生復(fù)發(fā)（n=4）或轉(zhuǎn)移（n=18）的原發(fā)GIST 病灶以小腸為主（14/22），轉(zhuǎn)移灶以肝臟及腹膜后轉(zhuǎn)移更為常見(jiàn)。19 例復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移灶存在KIT突變，以缺失突變?yōu)橹?，無(wú)PDGFRA 突變，其中9 例為KIT 雙外顯子突變；5 例為KIT 單外顯子突變。另有5 例對(duì)其原發(fā)灶及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶同時(shí)進(jìn)行了KIT 外顯子檢測(cè)，其中4 例突變模式與其原發(fā)灶一致，1 例轉(zhuǎn)移灶為KIT 外顯子11 突變類(lèi)型（p.N567_L576del），與其原發(fā)灶不同（p.E554_V560del，轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞以梭形細(xì)胞為主，而原發(fā)病灶則呈梭形細(xì)胞合并上皮樣形態(tài)的細(xì)胞）（見(jiàn)圖3）。

圖3 1 例2011年GIST 原發(fā)灶與2017年復(fù)發(fā)灶的病理圖及第一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

四、KIT 基因突變模式與臨床病理參數(shù)

檢出的9 例KIT 雙外顯子突變均見(jiàn)于復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移GIST，其中6 例為外顯子11 和17 雙突變，2 例為外顯子11 和13 雙突變，1 例為外顯子9 和13 雙突變。9 例KIT 雙外顯子突變除1 例KIT 外顯子9 和13 雙突變的GIST 患者無(wú)用藥史，其余8 例雙突變患者均有伊馬替尼用藥史，隨訪(fǎng)時(shí)間為24～172 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間108 個(gè)月。除1 例單突變患者原發(fā)時(shí)間失訪(fǎng)外，其余發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的KIT單突變患者（n=9）隨訪(fǎng)時(shí)間為10～134 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為60 個(gè)月。

野生型GIST 患者（n=3）的隨訪(fǎng)時(shí)間為19～61 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為30 個(gè)月。22 例復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者中，與KIT 單外顯子突變患者和野生型患者相比，KIT 雙外顯子突變患者的無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間較長(zhǎng)（P=0.029 9 和P=0.011 1）（見(jiàn)圖4），但Ki-67 增殖指數(shù)、腫瘤直徑及核分裂象與前二者比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 9 例KIT 基因雙外顯子突變與9 例單外顯子突變及3 例野生型GIST 患者的無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間比較

討 論

一、原發(fā)GIST 基因突變特征與臨床病理特征間的關(guān)系

本研究運(yùn)用第一代測(cè)序結(jié)合第二代測(cè)序技術(shù)回顧分析了167 例原發(fā)GIST 患者的病灶及其中22 例復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移灶，較全面反映了GIST 中KIT 和PDGFRA 基因在我國(guó)GIST 患者中的突變特征。本研究中攜帶KIT 基因突變的GIST 患者占83.8%，其突變主要位于外顯子11，突變類(lèi)型以缺失突變最為常見(jiàn)。PDGFRA 的突變頻率（3.0%）略低于既往報(bào)道的5%～7%[17]。

1.KIT 基因外顯子11 突變率高且缺失突變常見(jiàn)：既往文獻(xiàn)對(duì)GIST 中基因突變狀態(tài)的解析提示，不同KIT 突變的GIST 生物學(xué)行為的表現(xiàn)亦不同。本研究結(jié)果示，攜帶KIT 外顯子11 非點(diǎn)突變類(lèi)型的GIST，其Ki-67 增殖指數(shù)較攜帶點(diǎn)突變病例顯著增高。Wang 等[18]報(bào)道了KIT 外顯子11 缺失密碼子≥2 個(gè)的患者其無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間顯著短于攜帶KIT 缺失單個(gè)密碼子的GIST 患者。KIT 密碼子W557_K558 缺失突變是本研究中KIT 外顯子11上最為常見(jiàn)的缺失突變位點(diǎn)。既往文獻(xiàn)報(bào)道示，W557_K558 缺失突變可能與較高的腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。此外，這類(lèi)GIST 還往往具有腫瘤直徑大、核分裂數(shù)量多的特點(diǎn)[19-20]。據(jù)此，深入分析GIST中KIT 突變類(lèi)型有望為GIST 患者預(yù)后預(yù)測(cè)提供更多信息。

本研究未發(fā)現(xiàn)GIST 中2 個(gè)基因突變的特征與患者年齡、性別、腫瘤直徑、核分裂數(shù)量及危險(xiǎn)分級(jí)間有相關(guān)性，可能是受部分檢測(cè)樣本類(lèi)型為活檢組織的影響。同時(shí)，本研究觀(guān)察了GIST 基因突變類(lèi)型與腫瘤原發(fā)部位的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攜帶KIT 外顯子9 突變的GIST 更常見(jiàn)于小腸（10/14），而攜帶PDGFRA基因突變的GIST 則主要發(fā)生于胃部（4/5），與以往研究結(jié)果一致。

2.KIT 基因外顯子11 非點(diǎn)突變時(shí)伴Ki-67 增殖指數(shù)升高：Ki-67 是評(píng)判腫瘤細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，在指導(dǎo)乳腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的臨床治療中具有重要意義。盡管在中國(guó)胃腸道間質(zhì)瘤診斷治療共識(shí)中并未明確Ki-67 在GIST 診斷及治療中的價(jià)值[21]，但早在2012年Artigiani Neto 等[22]學(xué)者即提出，Ki-67≥10%的GIST 發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高。近期文獻(xiàn)顯示，Ki-67 高表達(dá)是GIST 患者無(wú)復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立預(yù)后因素[23]，進(jìn)一步證實(shí)了Ki-67 在預(yù)測(cè)GIST 生物學(xué)行為中的價(jià)值。本研究結(jié)果示，原發(fā)灶KIT 基因外顯子11 非點(diǎn)突變類(lèi)型的腫瘤患者，其Ki-67 增殖指數(shù)高于點(diǎn)突變類(lèi)型，可能提示該類(lèi)GIST 的生物學(xué)行為更差。

3.第二代測(cè)序技術(shù)輔助堿基序列判讀：目前，第一代測(cè)序技術(shù)在發(fā)現(xiàn)KIT 和PDGFRA 基因突變中具有較強(qiáng)的可操作性，但在遇到復(fù)雜突變時(shí)，第二代測(cè)序技術(shù)在輔助判讀堿基序列變化中更具優(yōu)勢(shì)。本研究報(bào)道的1 例復(fù)雜突變采用第二代測(cè)序技術(shù)精準(zhǔn)且直觀(guān)地展現(xiàn)了KIT 基因的突變形式，即氨基酸p.K550_Q556delinsW。目前第二代測(cè)序技術(shù)已被引入GIST 的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，期望挖掘出更多與靶向治療相關(guān)的基因突變[24-25]。

二、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移GIST 的基因突變特征

1.復(fù)發(fā)灶中存在KIT 基因雙外顯子突變提示預(yù)后較好：本研究的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移GIST 患者中約有86.4%攜帶KIT 基因突變（19/22），無(wú)PDGFRA 基因突變。突變模式分析提示，有9 例GIST 患者攜帶KIT 基因雙外顯子突變，其中6 例攜帶KIT 外顯子11 突變的同時(shí)還攜帶外顯子17 的820_830 密碼子位置的錯(cuò)義突變，另3 例攜帶KIT 外顯子11 突變的同時(shí)存在外顯子13 的V654A 或M651V 的錯(cuò)義突變。

盡管既往文獻(xiàn)提示，KIT 基因繼發(fā)性雙突變會(huì)造成GIST 患者靶向治療過(guò)程中的耐藥及腫瘤轉(zhuǎn)移[26]，但本研究中KIT 雙外顯子突變GIST 患者的無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間較KIT 單突變及野生型GIST 患者均顯著延長(zhǎng)，這一結(jié)果與Bosbach 等[27]所構(gòu)建的GIST 雙突變鼠（攜帶KIT V558 和T669I）較單突變（KIT V558）的小鼠模型中位生存時(shí)間延長(zhǎng)的結(jié)果相符。鑒于本研究中GIST 復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病例數(shù)較少，KIT 雙突變?cè)谠u(píng)估GIST 患者預(yù)后中的價(jià)值仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.轉(zhuǎn)移灶KIT 基因突變位點(diǎn)與原發(fā)灶不同：本研究同時(shí)關(guān)注了復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移GIST 中KIT、PDGFRA基因的突變情況，發(fā)現(xiàn)1 例GIST 肝臟轉(zhuǎn)移灶攜帶的KIT 突變不同于十二指腸原發(fā)灶。前期鑒于其部分區(qū)域相似的HE 形態(tài)和一致的免疫組化表型，本研究推測(cè)其原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟的可能性更大。目前認(rèn)為，腫瘤起源表現(xiàn)為單克隆，但亦不排除原發(fā)腫瘤存在基因變異的異質(zhì)性[28]。Xu 等[29]報(bào)道了多發(fā)性GIST 同時(shí)攜帶不同KIT 突變的病例，提示該腫瘤存在多克隆起源。此外，該研究也報(bào)道了同一病例在不同時(shí)間段診斷的GIST 攜帶的KIT 突變不同，結(jié)合形態(tài)不能排除新發(fā)的可能性。因此，對(duì)于再發(fā)病例除考慮腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)外，也需考慮二次原發(fā)的可能性。

總之，本研究運(yùn)用第一代測(cè)序技術(shù)回顧分析原發(fā)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移GIST 組織中KIT 和PDGFRA 的突變頻率和突變類(lèi)型，揭示了GIST 中基因突變與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。GIST 多存在KIT 基因或PDGFRA 基因突變，不同KIT 基因突變類(lèi)型的Ki-67 增殖指數(shù)可作為評(píng)估GIST 生物學(xué)行為的指標(biāo)之一。檢測(cè)GIST 中的基因狀態(tài)，根據(jù)基因突變特征對(duì)GIST 患者實(shí)施個(gè)體化精準(zhǔn)治療并進(jìn)行預(yù)后評(píng)估具有重要意義。