食品中PCDD/Fs和dl-PCBs的 檢測(cè)方法研究進(jìn)展

葉海云,俞國(guó)珍,張蓓蕾

(三門(mén)縣食品藥品檢測(cè)中心,浙江臺(tái)州 317199)

多氯代二苯并-對(duì)-二惡英(Polychlorinated dibenzo-p-dioxins,PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-furans,PCDFs)和二惡英樣多氯聯(lián)苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls,dl-PCBs)統(tǒng)稱(chēng)為二惡英類(lèi)化合物[1]。2001年5月,包括中國(guó)在內(nèi)的150多個(gè)國(guó)家聯(lián)合簽署了《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》(簡(jiǎn)稱(chēng)《POPs公約》),PCDD/Fs和dl-PCBs成為首批列入受控名單的持久性有機(jī)污染物[2-4]。PCDD/Fs和dl-PCBs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親油性強(qiáng)、難以降解,一旦它們進(jìn)入水生環(huán)境,極易結(jié)合沉積物,由各種途徑進(jìn)入食物鏈并會(huì)在生物體內(nèi)富積[1,5-6]。二十世紀(jì)五十年代,二惡英首次被報(bào)道為食物鏈的重要污染物,PCDD/Fs和dl-PCBs進(jìn)入人體的途徑主要有皮膚接觸、空氣吸入和食物攝入,其中,膳食攝入是最主要的進(jìn)入途徑,占90%以上[7-9]。本文綜合了二惡英類(lèi)化合物的致毒機(jī)理和幾種用于分析檢測(cè)二惡英類(lèi)化合物方法的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn),較系統(tǒng)地總結(jié)了國(guó)內(nèi)外分析檢測(cè)的最新研究進(jìn)展,并對(duì)我國(guó)開(kāi)展二惡英類(lèi)化合物的分析監(jiān)測(cè)提出了建議和展望。

1 PCDD/Fs和dl-PCBs的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)和來(lái)源

PCDDs包含75個(gè)同系物,PCDFs包含135個(gè)同系物,均為氯化合物[10],結(jié)構(gòu)式如圖1所示。其中,在2、3、7和8位具有0～3個(gè)氯原子的PCDD/Fs同系物無(wú)明顯毒性,而含有4～8個(gè)氯原子的PCDD/Fs具有顯著的毒性[11]。210個(gè)PCDD/Fs中同系物中具有毒性的同系物只有17種(PCDDs占7種,PCDFs占10 種)[12]。毒性PCDD/Fs通過(guò)機(jī)體循環(huán)進(jìn)入人們體內(nèi),常聚集在皮下、呼吸道和肝臟中,對(duì)機(jī)體的代謝產(chǎn)生巨大的影響,其中毒性最大為2,3,7,8-四氯二苯并-對(duì)-二惡英(TCDD)[10]。理論上多氯聯(lián)苯(PCBs)具有209個(gè)同系物,但只有12個(gè)PCBS在持久性和效果方面具有與PCDD/Fs相似的性質(zhì),稱(chēng)之為二惡英樣多氯聯(lián)苯(dl-PCBs),其他PCBs被稱(chēng)為非二惡英類(lèi)多氯聯(lián)苯(ndl-PCBs),dl-PCBs具有至少4個(gè)氯原子,結(jié)構(gòu)中兩個(gè)苯環(huán)可以采取共平面的位置,但被氯原子取代的臨位應(yīng)為非氯原子取代基(如圖1)[4]。PCDD/Fs主要來(lái)源于含氯化學(xué)品制造、市政垃圾焚燒、三廢排放以及廢舊電子垃圾拆解焚燒等過(guò)程;dl-PCBs主要來(lái)源于商業(yè)多氯聯(lián)苯混合物的生產(chǎn)和使用,以及工業(yè)液體的泄漏及運(yùn)輸過(guò)程中造成的滲漏,多氯聯(lián)苯混合物已經(jīng)在20世紀(jì)70年代被禁止生產(chǎn)[9]。

圖1 二惡英(PCDDs和PCDFs)和PCBs的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of PCDD/Fs and PCBs

2 PCDD/Fs和dl-PCBs的致毒機(jī)理及限量標(biāo)準(zhǔn)

PCDD/Fs和dl-PCBs的毒性大,其在低濃度下也易對(duì)機(jī)體的健康產(chǎn)生巨大的影響,引發(fā)人類(lèi)嚴(yán)重的生殖,免疫和神經(jīng)系統(tǒng)問(wèn)題,具有強(qiáng)致癌性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾毒性、生物蓄積性和胚胎毒性[13]。多年的研究發(fā)現(xiàn)PCDD/Fs和dl-PCBs的致毒機(jī)制既不是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷,也不是與蛋白質(zhì)和核酸形成加合物,更不是對(duì)細(xì)胞核中的DNA產(chǎn)生直接損害,而是通過(guò)激活細(xì)胞中的芳香烴受體(AhR)和下游一系列的信號(hào)通路從而對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用[14-16]。AhR本質(zhì)是一種高分子量的蛋白質(zhì)，生物體中一種配基依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄因子,與二惡英類(lèi)化合物具有極強(qiáng)的親和力,進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的二惡英類(lèi)化合物可以與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靜息態(tài)的AhR蛋白復(fù)合體相結(jié)合,被激活的復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核與AhR核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成二聚體(AhR-Arnt),AhR-Arnt二聚體隨后與特異基因上的增強(qiáng)子結(jié)合,從而控制下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯(如細(xì)胞色素CYP1A1、環(huán)氧酶-2等),最終導(dǎo)致廣泛的毒理和健康效應(yīng)(神經(jīng)毒性、致癌毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾等)[14-15,17]。

通常情況下,PCDD/Fs和dl-PCBs以混合物的形式存在于自然環(huán)境、食物鏈和人體組織中。因此,為對(duì)二惡英類(lèi)化合物的毒性效應(yīng)做出合適的評(píng)價(jià),世界衛(wèi)生組織(WHO)提出采用毒性當(dāng)量因子(TEF)來(lái)對(duì)PCDD/Fs和dl-PCBs的生物毒性做出估算、衡量和評(píng)價(jià)。WHO以毒性最大的TCDD的TEF值為基準(zhǔn)1,其它二惡英類(lèi)化合物以此標(biāo)準(zhǔn)折算以確定有毒同族體的毒性當(dāng)量因子,研究對(duì)象總體的的毒性當(dāng)量(toxic equivalencies,TEQ)即為所測(cè)樣品中各有毒同系物濃度與其毒性當(dāng)量因子乘積的加和[1]。PCDD/Fs和dl-PCBs具有極強(qiáng)的親脂性和穩(wěn)定性,一旦進(jìn)入人體便很難被代謝排除,因此美國(guó)環(huán)保局(USEPA)認(rèn)為不存在人類(lèi)可以接觸二惡英的“安全水平”,任何接觸都可導(dǎo)致嚴(yán)重危害。WHO為確保人類(lèi)健康安全對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)及調(diào)查報(bào)告進(jìn)行重新評(píng)估,將人體二惡英的日允許攝取量(tolerable daily intake,TDI)從1998年的0.014-0.037 pg/g體重修改為0. 001-0. 004 pg/g 體重[18]。

3 PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測(cè)方法

PCDD/Fs和dl-PCBs的定量檢測(cè)屬于多組分超痕量分析,是有機(jī)超痕量分析領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn):大多數(shù)情況下,PCDD/Fs和dl-PCBs以極微量形式存在于環(huán)境及生物體內(nèi),且其大量的同系物、異構(gòu)體使得PCDD/Fs和dl-PCBs的分離較為困難,同時(shí)由于水產(chǎn)樣品中基質(zhì)的干擾和分析時(shí)組分色譜峰交叉嚴(yán)重,使得二惡英化合物的分析過(guò)程極其復(fù)雜,對(duì)其檢測(cè)系統(tǒng)的特異性、選擇性和靈敏度要求極高[19]。目前,PCDD/Fs和dl-PCBs的主要分析方法有化學(xué)分析法(色譜分析法)和生物學(xué)分析技術(shù)(免疫學(xué)分析法和生物檢測(cè)法)。

3.1 化學(xué)分析法-色譜分析法

3.1.1 色譜分析法的基本原理及前處理技術(shù) 目前,色譜分析法是國(guó)際公認(rèn)的分析檢測(cè)PCDD/Fs和dl-PCBs的標(biāo)準(zhǔn)方法。色譜法的原理是不同物質(zhì)在不同相態(tài)具有不同的選擇性分配,由于物質(zhì)在不同相中具有不同分配系數(shù)，因此，可通過(guò)流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行分離洗脫,混合物中不同PCDD/Fs和dl-PCBs以不同的速度沿固定相移動(dòng),最終達(dá)到分離的效果。色譜法分析PCDD/Fs和dl-PCBs主要分為兩個(gè)階段:樣品前處理階段和色譜分析階段。通常情況下生物樣品中二惡英的含量均很低,實(shí)際樣品中復(fù)雜的基質(zhì)及其他干擾物質(zhì)量濃度明顯高于目標(biāo)化合物,色譜分析法中各儀器精密性較高,因此對(duì)于樣品前處理的要求相對(duì)較高,樣品前處理的結(jié)果對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大。PCDD/Fs和dl-PCBs測(cè)定樣品前處理主要分為4個(gè)步驟:樣品的采集、化合物提取、凈化及富集。樣品的提取和分離純化為最耗時(shí)也最為重要的兩個(gè)步驟。用于PCDD/Fs和dl-PCBs的提取的方法較多,主要有以下幾種:索氏提取、固相萃取、微波輔助萃取、加速溶劑提取、加壓流體萃取、超臨界流體萃取等[20-22],其中索氏提取是最為常用且提取率最高的方法,也是我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中二惡英及其類(lèi)似物毒性當(dāng)量的測(cè)定中首推提取PCDD/Fs和dl-PCBs的方法[23]。抽提后,樣品中的絕大部分PCDD/Fs和dl-PCBs進(jìn)入提取液,同時(shí)生物樣品原有的多環(huán)芳烴、有機(jī)農(nóng)藥、脂肪大分子等眾多干擾物質(zhì)也跟隨PCDD/Fs和dl-PCBs混入了提取液,為確保PCDD/Fs和dl-PCBs檢測(cè)的準(zhǔn)確性,需要通過(guò)一定的方法對(duì)提取液進(jìn)行凈化,去除提取液中的干擾物質(zhì)。目前常用的提取液凈化方法有:堿解、液-液分配、柱層析、濃硫酸磺化和氧化等[24]。經(jīng)索氏提取并凈化后的提取液再采用多個(gè)不同色譜柱的方法進(jìn)行相應(yīng)的純化,得到的洗脫液用于進(jìn)一步的色譜分離分析使用。

3.1.2 色譜分析

3.1.2.1 同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜法(HRGC/HRMS) 同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜法(Isotopedilution-HRGC/HRMS)是測(cè)定PCDD/Fs和dl-PCBs分析的“黃金標(biāo)準(zhǔn)法”[4,25],廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品、生物樣品和食品中二惡英類(lèi)化合物的檢測(cè)[26],是目前唯一具有法律效益的二惡英類(lèi)化合物檢測(cè)方法,也是對(duì)痕量及超痕量濃度水平樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs定性定量的最佳檢測(cè)方法。典型的國(guó)際和國(guó)家相關(guān)組織確定的二惡英標(biāo)準(zhǔn)分析方法[27]有:USEPA的EPA-8290、EPA-8280 和EPA-1613二惡英標(biāo)準(zhǔn)分析方法、日本的JISK-0311法以及我國(guó)環(huán)保部的HJ/T 77、HJ 650-2013二惡英標(biāo)準(zhǔn)分析方法。同位素稀釋EPA-1613法已經(jīng)成為各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)基礎(chǔ),同位素稀釋定量法是保證二惡英類(lèi)分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。在樣品提取前定量加入13C 標(biāo)記2,3,7,8-取代的二惡英毒性同類(lèi)物,由于13C 標(biāo)記物的化學(xué)性質(zhì)與被分析組分的化學(xué)性質(zhì)完全一致,因此樣品提取和凈化過(guò)程中的損失相同,樣品中二惡英含量根據(jù)13C內(nèi)標(biāo)物定量可以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。Wang等[28]利用不分流注入模式和多離子監(jiān)測(cè)(MID)方法，通過(guò)配備有DB-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)的HRGC/HRMS法分析了我國(guó)東南部舟山漁業(yè)中32種魚(yú)類(lèi)中的十七種PCDD/Fs和十二個(gè)同位素dl-PCBs中毒性較大的同系物含量,發(fā)現(xiàn)不同魚(yú)類(lèi)中PCDD/Fs和dl-PCBs的水平差異顯著在0.002～0.078 pg WHO-TEQ/g鮮重之間,分別為0.002～0.553 pg WHO-TEQ/g鮮重和0.003～2.059 pg WHO-TEQ/g鮮重。Squadrone等[12]利用HRGC/HRMS分析了來(lái)自意大利北部瓦雷澤湖鯰魚(yú)魚(yú)肌樣品中PCDD/Fs和dl-PCB含量,研究發(fā)現(xiàn)鯰魚(yú)樣品中總PCDD/Fs含量范圍為0.001～1.310 pg/g(w/w),總dl-PCBs含量范圍為0.031～21.000 pg/g(w/w)。HRGC/HRMS的優(yōu)點(diǎn)是它可以對(duì)PCDD/Fs和dl-PCBs分別進(jìn)行分離,分離效率高;并能夠?qū)Ψ蛛x出的每種成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定量,靈敏度高、分析速度快;且相對(duì)來(lái)說(shuō)樣品用量較少,因而具有極其廣泛的應(yīng)用范圍。但HRGC/HRMS法對(duì)儀器的精密性要求較高,因此樣品的前處理過(guò)程極為繁瑣,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),并且需要提供較為良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境及專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)工作,檢測(cè)成本較高。

3.1.2.2 氣相色譜-三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS) 氣相色譜-三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)相對(duì)HRGC/HRMS法而言,對(duì)樣品前處理的要求較低,為簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟GC-MS/MS法也被廣泛的應(yīng)用于對(duì)樣品PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測(cè)[29]。GC-MS/MS法由于其相對(duì)簡(jiǎn)單的樣品前處理過(guò)程,更好的選擇性和一定的靈敏度,目前已經(jīng)得到了歐盟官方的認(rèn)同[4]。代澎等[30]建立了可用于生活飲用水中20種PCBs的測(cè)定的GC-MS/MS測(cè)定方法,采用液液微萃取富集,離心分離,13C內(nèi)標(biāo)法定量,檢出限為0. 35～6.60 ng/L,定量限為1.04～19.7 ng/L,該方法優(yōu)勢(shì)在于樣品處理簡(jiǎn)單、快速、可靠,應(yīng)用7種13C同位素內(nèi)標(biāo)物對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記能夠降低基質(zhì)的干擾,使目標(biāo)物得到較好的分離,并且用GC-MS/MS檢測(cè)特征離子的二級(jí)離子,提高了靈敏度,增強(qiáng)了定性、定量的準(zhǔn)確度。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中食品樣品基質(zhì)對(duì)GC-MS/MS檢測(cè)限的干擾較大導(dǎo)致GC-MS/MS法靈敏度低于HRGC/HRMS法,所以GC-MS/MS法測(cè)定的PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測(cè)限一般高于HRGC/HRMS法[31],。雖然GC-MS/MS法靈敏度略低于HRGC/HRMS法,但其選擇性?xún)?yōu)于HRGC/HRMS法,因此GC-MS/MS法比較適用于二惡英含量較高的樣品[32]。

3.1.2.3 正交分離系統(tǒng)全二維氣相色譜法(GC×GC) PCDD/Fs單體眾多,且dl-PCBs與PCDD/Fs物理化學(xué)性質(zhì)極為相近,因此很難在一根色譜柱上實(shí)現(xiàn)所有單體的分離,單根色譜柱分離PCDD/Fs和dl-PCBs極容易出現(xiàn)各化合物共流出的現(xiàn)象。高靈敏度的正交分離系統(tǒng)全二維氣相色譜技術(shù)(GC×GC)方法分離檢測(cè)PCDD/Fs和dl-PCBs能夠在顯著提高柱效的同時(shí)防止化合物共流出現(xiàn)象的發(fā)生,它具有不同分離機(jī)制、不同極性且互相獨(dú)立的2支色譜柱,以串連的方式結(jié)合成二維氣相色譜。經(jīng)第1支色譜柱分離后的每個(gè)餾分,再經(jīng)調(diào)制器聚焦后以脈沖方式進(jìn)入第2支色譜柱中進(jìn)一步分離,通過(guò)溫度和極性的改變,實(shí)現(xiàn)氣相色譜分離特性的正交化。GC×GC方法利用多種色譜柱交叉使用的方法避免了傳統(tǒng)多維GC系統(tǒng)中復(fù)雜的色譜柱更換、重復(fù)進(jìn)樣操作等操作帶來(lái)的不便,且可以連續(xù)出峰并確保彼此之間無(wú)重疊,減少分析化合物的時(shí)間,是一種快速分離技術(shù)[33]。De Boer等人利用GC×GC聯(lián)用電子俘獲檢測(cè)器系統(tǒng)地對(duì)美國(guó)兒童膳食中多種二惡英類(lèi)化合物(90種PCBs和17種PCDD/Fs)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)可以從所得譜圖上鑒定出這些化合物中的所有同系物[34]。目前應(yīng)用較多的組合為正交分離系統(tǒng)全二維氣相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(GC×GC-TOF/MS),Hoh等通過(guò)GC×GC-TOF/MS檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)魚(yú)油中二惡英類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)分析[35],通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其分辨率穩(wěn)定性低于HRGC/HRMS法,但該方法在進(jìn)行全掃描檢測(cè)同時(shí)可啟動(dòng)選擇離子掃描檢測(cè),因此應(yīng)用前景仍然比較樂(lè)觀。

3.1.3 色譜分析檢測(cè)法優(yōu)缺點(diǎn) 色譜分析法儀器精密性較高,可分離樣品中二惡英類(lèi)物質(zhì)的每種成分,并準(zhǔn)確定量痕量毒物,是對(duì)痕量及超痕量濃度水平樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs定性定量的最佳檢測(cè)方法。但由于PCDD/Fs和dl-PCBs的同源物和異構(gòu)體作為復(fù)雜混合物存在生物樣品中,化學(xué)分析法只能識(shí)別和量化可分離并且已知的標(biāo)準(zhǔn)化合物[36],由于檢測(cè)過(guò)程中需要相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)對(duì)樣品中的二惡英類(lèi)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定性,而目前仍有部分化合物不具備相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品,因此色譜法只能對(duì)己知的二惡英類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定,無(wú)法確定樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs真實(shí)總量，而且化學(xué)分析法分析過(guò)程中不能確定復(fù)雜混合物中化學(xué)物質(zhì)之間的相互作用以及PCDD/Fs和dl-PCBs的生物效應(yīng)[25]。

表1 色譜分析檢測(cè)法優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The advantages and disadvantages of chromatographic analysis

3.2 生物學(xué)檢測(cè)法

3.2.1 生物學(xué)檢測(cè)法基本原理及分類(lèi) 生物學(xué)檢測(cè)方法是依據(jù)PCDD/Fs和dl-PCBs單體進(jìn)入生物細(xì)胞內(nèi)與AhR結(jié)合的致毒機(jī)理而開(kāi)發(fā)的靈敏度和檢出下限可達(dá)到或接近HRGC/HRMS水平的新方法,其原理是借助與二惡英具有特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體、受體、酶的識(shí)別機(jī)制,通過(guò)測(cè)定生物分子活化程度間接確定二惡英類(lèi)化合物毒性當(dāng)量。生物學(xué)檢測(cè)方法可分為免疫法(酶免疫分析法-EIA和熒光免疫分析法-DELFIA)和生物法(酶活力誘導(dǎo)法-EROD和熒光素酶報(bào)告基因法-CALUX)兩大類(lèi)[37]。

3.2.2 免疫分析法

3.2.2.1 酶免疫分析法 酶免疫分析法是以抗原和抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法,但免疫法中使用的抗體較難獲取且該法不能檢測(cè)所有的同系物。酶免疫分析法(EIA)是根據(jù)鼠單克隆抗體(DD3)與二惡英結(jié)合的特點(diǎn)而建立的競(jìng)爭(zhēng)抑制酶免疫方法,檢測(cè)的基礎(chǔ)是結(jié)合在固相載體表面且具有免疫學(xué)活性的抗原、抗體以及既具有免疫學(xué)活性又具有酶活性的酶標(biāo)記抗體。在測(cè)定過(guò)程中,以不同濃度二惡英為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作出標(biāo)準(zhǔn)樣品的劑量-效應(yīng)曲線,最終通過(guò)測(cè)定抗體與競(jìng)爭(zhēng)酶的熒光強(qiáng)度反向獲取二惡英的TEQ,熒光強(qiáng)度與TEQ為反比關(guān)系[38-39]。EIA法具有操作簡(jiǎn)便,一次可平行測(cè)定多個(gè)樣品的特點(diǎn),而且開(kāi)發(fā)出的價(jià)格低廉商品化的試劑盒可在采集樣品現(xiàn)場(chǎng)直接完成相關(guān)測(cè)定[40]。Tsutsumi等[41]利用酶免疫試劑盒與HRGC/HRMS測(cè)定魚(yú)類(lèi)樣品中dl-PCB的TEQ濃度,發(fā)現(xiàn)酶免疫試劑盒可以識(shí)別魚(yú)類(lèi)樣品中dl-PCBs的濃度臨界值為50pg TEQ/g,兩種方法所測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好(r=0.92,n=26),因此酶免疫試劑盒有助于在HRGC/HRMS分析之前對(duì)大量的魚(yú)類(lèi)樣品進(jìn)行初步的篩選。但EIA法無(wú)法確定PCDD/Fs和dl-PCBs的生物效應(yīng)且前期開(kāi)發(fā)較為繁瑣,費(fèi)用昂貴,測(cè)定PCDD/Fs和dl-PCBs時(shí)也需采取不同的EIA方法。與其他生物分析技術(shù)相比,EIA法表現(xiàn)出更大的分析特異性和對(duì)來(lái)自其他污染物的干擾的相對(duì)不敏感性[42-43]。Samara等[43]利用EIA法和HRGC/HRMS法對(duì)來(lái)自工業(yè)設(shè)施現(xiàn)場(chǎng)樣品中PCDDs/Fs及多溴二苯并對(duì)二惡英/呋喃(PBDDs/Fs)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)基于EIA法樣品中測(cè)定的PCDDs/Fs的毒性當(dāng)量高于HRGC/HRMS法0～4個(gè)數(shù)量級(jí),而PBDDs/Fs的毒性當(dāng)量高于HRGC/HRMS法0～1數(shù)量級(jí),且在EIA和HRGC/HRMS數(shù)據(jù)之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性,這可能歸因于同源物特異性交叉反應(yīng)、樣品基質(zhì)類(lèi)型的差異以及在免疫測(cè)定中競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合的其他化合物的存在的影響。

3.2.2.2 熒光免疫分析法 熒光免疫分析法(DELFIA)利用生物基因技術(shù)選擇出與樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs相互競(jìng)爭(zhēng)的單克隆抗體的抗原鍵合銪離子,反應(yīng)完全后加入熒光增強(qiáng)液解離抗原中的銪離子至增強(qiáng)液中,增強(qiáng)液中形成的膠束銪離子能夠高效地發(fā)出熒光。用時(shí)間分辨熒光法技術(shù)排除非特異性熒光干擾后對(duì)鰲合物加以分析,獲取樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs熒光值,其熒光強(qiáng)度與樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs的TEQ成反比[44]。EIA法與DELFIA法相比并不需要細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)活化過(guò)程,從而大大提高了樣品中PCDD/Fs和dl-PCBs的檢測(cè)效率,并且檢測(cè)所得的TEQ值比較一致,但EIA法靈敏度相對(duì)DELFIA法較低。DELFIA法采用時(shí)間分辨熒光技術(shù),可以消除非特異性熒光干擾,靈敏度大大提高。由于靈敏度提高,檢測(cè)所需試樣量少,因此大大降低了二惡英類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)成本。Tatsuro Endo等[45]建立了酶放大微流控?zé)晒饷庖邆鞲衅鱽?lái)檢測(cè)共平面PCBs(Co-PCBs),可以在30秒內(nèi)確定樣品中Co-PCBs衍生物的濃度,Co-PCBs檢測(cè)的線性范圍從0.1 pg/mL至1.0 μg/mL(回歸分析提供了相關(guān)性系數(shù)r=0.982～0.964),重現(xiàn)性好、精度高。

3.2.3 生物分析法 生物分析法是依據(jù)二惡英的致毒機(jī)理,根據(jù)機(jī)體細(xì)胞對(duì)二惡英專(zhuān)一性反應(yīng)或是生物分子對(duì)PCDD/Fs和dl-PCBs結(jié)構(gòu)獨(dú)特的識(shí)別能力來(lái)對(duì)其進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

3.2.3.1 酶活力誘導(dǎo)法 7-乙氧基-異吩惡哇酮-脫乙基酶(EROD)與PCDD/Fs和dl-PCBs的結(jié)合具有良好的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。PCDD/Fs和dl-PCBs與AhR結(jié)合活化后,AhR核轉(zhuǎn)位因子進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)與AhR核轉(zhuǎn)位子蛋白再度結(jié)合并識(shí)別特定DNA片段,啟動(dòng)發(fā)揮毒性的靶基因轉(zhuǎn)錄,激活EROD酶。通過(guò)測(cè)定EROD酶的活性,間接反映PCDD/Fs和dl-PCBs與AhR的結(jié)合能力,一定范圍內(nèi),EROD酶活與二惡英濃度呈線性關(guān)系[46]。相對(duì)來(lái)說(shuō),EROD法有利于篩選目的物質(zhì),得到更多關(guān)于激動(dòng)劑和拮抗劑的信息支持,從而揭示未知的活性化合物[42]。馮忠孚[47]在檢測(cè)垃圾焚燒二惡英類(lèi)化合物的檢測(cè)過(guò)程中,結(jié)合新型前處理柱對(duì)比EROD生物測(cè)試法和HRGC-HRMS法發(fā)現(xiàn)兩者檢測(cè)結(jié)果具有強(qiáng)相關(guān)性(R2=0.95),從而說(shuō)明結(jié)合新型前處理柱的EROD生物測(cè)試法能夠得到與高分辨氣質(zhì)儀器分析方法具有相近TEQ值的檢測(cè)結(jié)果,具有高靈敏度和高通量的特點(diǎn),能夠以較低的成本快速篩查大量樣品,是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ亩河㈩?lèi)化合物檢測(cè)方法。

表2 生物學(xué)分析檢測(cè)法優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 The advantages and disadvantages of biological detection

3.2.3.2 熒光素酶報(bào)告基因法 熒光素酶報(bào)告基因法(CALUX)也稱(chēng)為受體報(bào)告基因法,能夠特異性測(cè)定樣品中所有具有AhR 受體的化合物,AhR受體是TEQ的生物學(xué)基礎(chǔ),因而CALUX靈敏度更高,檢測(cè)的線性范圍更寬,檢測(cè)時(shí)間更短,因此CALUX法更適用于健康評(píng)價(jià)[48]。Samara等[38]使用化學(xué)活化的熒光素酶基因表達(dá)細(xì)胞生物測(cè)定系統(tǒng)(CALUX)和基于抗體的方法酶免疫測(cè)定(EIA)來(lái)檢測(cè)幾種多溴、多氯、多溴/氯化二苯并對(duì)二惡英/呋喃的二惡英樣反應(yīng)(PBDDs/Fs,PCDDs/Fs和PBCDDs/Fs),測(cè)試結(jié)果顯示溴化合物和混合的溴/氯化合物的生物活性類(lèi)似于它們的氯化類(lèi)似物。目前CALUX法較適合大量樣本靈敏的快速篩選,比傳統(tǒng)的HRGC/HRMS的成本低40%～70%,已被廣泛用于對(duì)多種環(huán)境介質(zhì)、生物樣品和食品中二惡英的檢測(cè)[49-52],USEPA在2008年2月將CALUX生物測(cè)定法批準(zhǔn)為二惡英檢測(cè)的替代方法[52-55]。由于CALUX法測(cè)定的是所有具有AhR受體的二惡英類(lèi)物質(zhì),因此一般情況下CALUX法樣品測(cè)定結(jié)果高于化學(xué)分析法樣品測(cè)定的結(jié)果[53]。Vromman等[54]通過(guò)CALUX和GC-HRMS(比利時(shí)境內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法)兩種方法測(cè)定比利時(shí)境內(nèi)食品基質(zhì)(乳制品、雞蛋、魚(yú)、動(dòng)物脂肪和植物油)中二惡英和二惡英樣多氯聯(lián)苯的污染數(shù)據(jù),觀察到兩種方法之間的測(cè)定結(jié)果存在顯著差異,CALUX方法測(cè)得食物基質(zhì)中的二惡英的中位數(shù)濃度約為GC-HRMS法二惡英的中位濃度的兩倍。由此可見(jiàn),在比利時(shí)官方控制計(jì)劃框架內(nèi)CALUX方法獲得的數(shù)據(jù)不能用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,特別是不能準(zhǔn)確估計(jì)二惡英和二惡英樣多氯聯(lián)苯的膳食攝入量。這可以解釋為：一方面不屬于17種二惡英/呋喃的大量不同形狀的化合物和12種二惡英樣多氯聯(lián)苯同系物也與芳基烴受體(AhR)相結(jié)合。另一方面，該測(cè)定法被用于合規(guī)監(jiān)測(cè)的篩選，其中需要通過(guò)最大水平強(qiáng)調(diào)方法性能，從而導(dǎo)致監(jiān)測(cè)濃度的準(zhǔn)確度不足。因此,實(shí)際應(yīng)用時(shí),可先用CALUX篩選檢測(cè),再將篩選出的陽(yáng)性樣品用化學(xué)分析法作進(jìn)一步定性定量檢測(cè)。籍龍杰等[55]利用HRGC/HRMS和CALUX對(duì)42個(gè)垃圾焚燒飛灰樣品進(jìn)行二惡英類(lèi)化合物的分析,發(fā)現(xiàn)CALUX結(jié)果與HRGC/HRMS結(jié)果具有很好的線性相關(guān)性(R=0.96),并計(jì)算兩者的換算系數(shù)為0.332,最終可以利用快速檢測(cè)的結(jié)果和換算系數(shù)來(lái)推算出HRGC/HRMS的結(jié)果。

3.2.4 生物學(xué)檢測(cè)法優(yōu)缺點(diǎn) 生物學(xué)檢測(cè)法是以現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究成果為基礎(chǔ)，針對(duì)傳統(tǒng)儀器分析方法的缺點(diǎn)而發(fā)展起來(lái)的二惡英類(lèi)化合物檢測(cè)技術(shù)。生物學(xué)檢測(cè)法因其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低(分析成本降低50%以上)、測(cè)試周期短、可平行測(cè)試大量樣品等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)[56]。美國(guó)、歐盟、日本等紛紛將生物學(xué)檢測(cè)方法推薦為二惡英類(lèi)化合物檢測(cè)的指導(dǎo)方法及篩選方法[46]。盡管生物學(xué)檢測(cè)法測(cè)試周期短,適于快速、大規(guī)模樣品的篩選,但其無(wú)法鑒定生物樣品中二惡英化合物的種類(lèi),只能測(cè)定出混合物的總毒性當(dāng)量。

4 展望

二惡英類(lèi)化合物進(jìn)入到機(jī)體后,可以隨著食物鏈逐步富積,對(duì)我國(guó)的食品安全及人們健康產(chǎn)生不利影響,因此，檢測(cè)食物中的二惡英類(lèi)化合物尤為重要，常用的檢測(cè)方法有化學(xué)分析法和生物法，這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，并相互補(bǔ)充。化學(xué)分析法具有準(zhǔn)確可靠,可分離測(cè)定出二惡英化合物中物質(zhì)單體,并準(zhǔn)確定量痕量毒物單體TEQ數(shù)據(jù)等特點(diǎn),但前處理過(guò)程復(fù)雜、消耗大量化學(xué)試劑和耗材,分析成本高、周期長(zhǎng)、無(wú)法同時(shí)處理大量樣品,對(duì)儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境及人員配備要求較高,不能確定復(fù)雜混合物中化學(xué)物質(zhì)之間的相互作用以及PCDD/Fs和dl-PCBs的生物效應(yīng)。生物學(xué)檢測(cè)法一般用于大量樣品的篩選或含量較高樣品的測(cè)定以及無(wú)需對(duì)單體進(jìn)行定量,檢測(cè)結(jié)果只能體現(xiàn)出總TEQ 數(shù)據(jù),屬于半定量方法。生物學(xué)檢測(cè)法具有檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)單、低成本、高通量、能反映有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體造成的生物影響的特點(diǎn),但不能了解樣品中二惡英類(lèi)化合物具體組成及單體TEQ數(shù)據(jù),因此在處理具有爭(zhēng)議的結(jié)果時(shí),仍須化學(xué)分析法進(jìn)行確證。綜上所述,為加快推進(jìn)PCDD/Fs和dl-PCBs監(jiān)測(cè)防控進(jìn)程,可通過(guò)以下幾個(gè)方面進(jìn)行切入:

為確保我國(guó)食品安全及更精確快速的檢測(cè)出食品中二惡英類(lèi)化合物含量,我國(guó)應(yīng)盡快構(gòu)建快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的二惡英毒性檢測(cè)方法和制定食品中允許限量標(biāo)準(zhǔn),并同步建立食品行業(yè)體系中獨(dú)立的二惡英類(lèi)污染物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。

由于食品樣品基質(zhì)較為復(fù)雜,應(yīng)根據(jù)檢測(cè)樣品及檢測(cè)目的的不同,充分利用化學(xué)、生物學(xué)檢測(cè)法各自的優(yōu)勢(shì),構(gòu)建適合于我國(guó)食品行業(yè)的二惡英污染物檢測(cè)評(píng)價(jià)體系。例如，低成本和高通量的生物檢測(cè)法可作為農(nóng)畜及水產(chǎn)品中二惡英類(lèi)化合物的檢測(cè)工具,精確的化學(xué)分析法則可用于對(duì)準(zhǔn)確定量痕量二惡英類(lèi)污染物的認(rèn)證分析。

PCDD/Fs和dl-PCBs類(lèi)物質(zhì)的異構(gòu)體和同類(lèi)物種類(lèi)繁多,檢測(cè)時(shí)結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近使得部分色譜峰出現(xiàn)不可避免的重疊現(xiàn)象,盡管高分辨質(zhì)譜可以很好的識(shí)別不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PCDD/Fs和dl-PCBs化合物,但對(duì)相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的異構(gòu)體和化合物并不能進(jìn)行很好的區(qū)分,因此想要更精確的測(cè)定食品中PCDD/Fs和dl-PCBs類(lèi)化合物的含量,需要提升色譜分析技術(shù)或加快構(gòu)建合理的多維色譜及高分辨率質(zhì)譜儀聯(lián)用體系。

生物學(xué)檢測(cè)方法(特別是CALUX)雖然不能代替化學(xué)分析法,但因?yàn)槠淇焖?、?jiǎn)單、低成本以及在研究化學(xué)物質(zhì)的生物及毒性效應(yīng)方面的巨大優(yōu)勢(shì),使得其能作為化學(xué)分析的補(bǔ)充，廣泛用于PCDD/Fs和dl-PCBs類(lèi)物質(zhì)的初步篩選性分析檢測(cè)。因此,應(yīng)該對(duì)生物學(xué)檢測(cè)法進(jìn)行明確的定義,從而使其真正意義上應(yīng)用于食品中二惡英類(lèi)化合物的快速篩選,并制定出適合我國(guó)國(guó)情的可接受的操作標(biāo)準(zhǔn);同時(shí)需要提升檢測(cè)人員對(duì)生物方法篩選策略的理解和知識(shí)的豐富度,并根據(jù)不同生物檢測(cè)法的局限性對(duì)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分別分析,更合理的評(píng)估食品樣品中二惡英化合物的影響;注重開(kāi)發(fā)成本相對(duì)低廉但具有高分辨質(zhì)譜相似靈敏度與分辨率的儀器，以促進(jìn)食品中二惡英污染物的快速檢測(cè)的進(jìn)程。

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