基于高通量測序的殼寡糖-Zn2+配合物 對衰老模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

湯 賀,張 賓,*,史周榮,徐君輝,曹慧娟

(1.浙江海洋大學(xué),浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316022;2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江舟山 316021)

高通量測序技術(shù)已成為了現(xiàn)代生命科學(xué)研究的常用技術(shù),其實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對幾百萬DNA分子的測序,達(dá)到了鑒定微生物單一基因或全基因組的目的。高通量測序主要有454焦磷酸測序平臺(Roche公司)、Hiseq和Miseq測序平臺(Illumina公司)以及Solid 測序平臺(ABI公司)。近年來,隨著現(xiàn)代測序技術(shù)快速發(fā)展,研究者將高通量測序技術(shù)已成功應(yīng)用于多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域,如土壤多樣化、海洋和腸道環(huán)境、發(fā)酵食品、人類健康與疾病等方面[1]。

研究表明,腸道菌群作為“微生物器官”對機(jī)體的健康具有重要影響。腸道正常菌群在營養(yǎng)消化與吸收、抵御外來病原菌入侵和產(chǎn)生重要代謝產(chǎn)物等方面,起到不可替代的作用。腸道菌群的變化,對機(jī)體代謝產(chǎn)生較大影響,同時(shí)機(jī)體代謝也會引起腸道菌群的變化[6]。殼寡糖作為重要的海洋生物功能性低聚糖,其具有較好的體內(nèi)外抗氧化活性,而殼寡糖對機(jī)體起到抗氧化作用的同時(shí),對機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能也具有重要調(diào)節(jié)作用。此外,殼寡糖分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基、氨基和酰胺基,其可結(jié)合Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+等諸多金屬離子,形成具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的殼寡糖金屬配合物,從而表現(xiàn)出機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抑菌活性增強(qiáng)等多種功能。目前,關(guān)于殼寡糖金屬配合物對生物體內(nèi)腸道菌群的影響情況還尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠為對象,評價(jià)制備的殼寡糖-Zn2+配合物對模型小鼠腸道菌群的影響情況,為殼寡糖及其金屬修飾物的活性開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級健康昆明種小鼠 雄性,160只,體質(zhì)量(25±2) g，小鼠飼養(yǎng)溫度22～25 ℃,濕度50%～55%,每日光照12 h,實(shí)驗(yàn)期間自由飲水,飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料(由浙江海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自制) 由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;殼寡糖-Zn2+配合物(殼寡糖聚合度為3～6,Zn2+含量為(26.2±0.2) mg/g配合物,純度>95%) 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)品加工及貯藏研究室制備;D-半乳糖、戊巴比妥納 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;TransStart FastPfu DNA Polymerase、TruSeqTMDNA Sample Prep Kit等 Illumina公司;AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 AXYGEN公司;丙二醛(MDA)含量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

ABIGeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司;QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) Promega公司;MDF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氧化衰老小鼠模型的建立 實(shí)驗(yàn)小鼠的管理及實(shí)驗(yàn)過程,依據(jù)GB14925-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物》管理規(guī)范進(jìn)行。以常規(guī)飼料(營養(yǎng)成分依據(jù)GB 14924.3-2010)對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用頸背部皮下注射法制備氧化衰老模型小鼠。D-半乳糖溶液注射量120 mg/(kg·d),每日1次,連續(xù)造模6周,定期尾靜脈取血測丙二醛(MDA)含量,依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行測定。選取氧化衰老模型小鼠,共隨機(jī)分為以下7組,21只/組(7只/籠,每組3個(gè)平行籠)。

實(shí)驗(yàn)分組:空白對照(N)、模型對照(M)、陽性對照(Y,15 mg/(kg·d)VC)、殼寡糖灌胃組(CH,500 mg/(kg·d))、ZnSO4灌胃組(Zn,40 mg/(kg·d))、殼寡糖+ZnSO4灌胃組(CO,500 mg/(kg·d)殼寡糖+40 mg/(kg·d)ZnSO4)和殼寡糖-Zn2+配合物灌胃組(CZ,500 mg/(kg·d))。

處理過程:除去空白組外,其余各組均以每日繼續(xù)給予120 mg/(kg·d)D-半乳糖頸背部皮下注射,同時(shí)進(jìn)行灌胃(1 mL)。其中,空白組與模型組采用生理鹽水灌胃,其余各組采用等體積的對應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行灌胃。持續(xù)30 d后,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h,40 mg/kg的2%戊巴比妥納腹腔注射麻醉后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,解剖取盲腸部分,進(jìn)行腸道菌群組成分析。

1.2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 將獲取的小鼠盲腸內(nèi)容物,凍藏于-80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行貯藏。樣品解凍后,對腸道菌群采用DNA提取試劑盒法抽提基因組DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA;按指定測序區(qū)域,合成帶有barcode特異引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對16S rRNA基因V3/V4區(qū)合成特異引物,利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收,QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量,而后進(jìn)行Illumina Miseq 2x300 bp高通量測序及生物信息學(xué)分析。

1.3 軟件數(shù)據(jù)分析

Miseq測序得到PE reads,首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾,區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果,進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析以及對測序深度進(jìn)行檢測;基于分類學(xué)信息,在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析(由微基生物科技(上海)有限公司協(xié)助完成)。

2 結(jié)果與分析

2.1 衰老小鼠模型的制備

頸背部皮下注射D-半乳糖造模過程中,小鼠體質(zhì)量逐漸增加但增加速率較為緩慢,造模后期小鼠毛發(fā)失去光澤,并開始出現(xiàn)少量脫落現(xiàn)象。連續(xù)造模6周后,模型組小鼠血清、腎臟及肝臟中丙二醛含量增加顯著(p<0.01),其含量分別達(dá)到(39.45±4.19) nmol/mg、(9.96±0.42) nmol/mg和(7.02±0.83) nmol/mg,而空白組小鼠丙二醛含量僅為(22.57±2.80) nmol/mg、(6.20±0.23) nmol/mg和(1.69±0.24) nmol/mg。由此表明,通過D-半乳糖誘導(dǎo),已成功制備出衰老小鼠模型。

2.2 腸道菌群物種注釋與評估

2.2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Illumina高通量測序獲得小鼠腸道樣本原始序列數(shù)據(jù)后,采用Trimmomatic軟件進(jìn)行序列質(zhì)控,Flash軟件進(jìn)行序列拼接,再經(jīng)序列優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)后得到各實(shí)驗(yàn)組有效序列范圍為31727～36486條,其平均長度范圍為434.69～439.82 bp。進(jìn)而對樣品序列進(jìn)行聚類分析,在97%相似水平下的OTU(operational taxonomic unit)生物信息統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),各處理組得到的OTU個(gè)數(shù)范圍為255～376,其中空白對照組OTU數(shù)量最低為255,而殼寡糖-Zn2+配合物和殼寡糖組OTU數(shù)量較高,分別為377和376(表1)。

表1 各組樣品有效序列與OTU數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Observed valid sequence and OTU number in different groups

2.2.2 不同分類水平上的物種注釋 為獲得每個(gè)OTU對應(yīng)物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并分別在門(Phylum)和科(Family)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本群落組成(圖1)。在門分類水平上,不同給藥后小鼠腸道菌群主要由放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、脫鐵桿菌、厚壁菌門、變形菌門、Saccharibacteria、軟壁菌門、疣微菌門等9個(gè)門組成,其中厚壁菌門和擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌門,該結(jié)果與王雪等[7]報(bào)道結(jié)果一致。對于空白對照組(N),擬桿菌門所占比例為10.46%。經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)后,各組擬桿菌門所占比例均明顯升高,其中以模型組(M)中增加幅度最高達(dá)41.42%(p<0.05)。殼寡糖(CH)、ZnSO4、殼寡糖-Zn2+配合物(CZ)及陽性對照(VC)給藥處理,相比于模型對照組,對擬桿菌門豐度的升高均具有明顯緩解作用。對于厚壁菌門,空白對照組(N)中所占比例為79.79%,經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)后,各組樣本中厚壁菌門所占比例均顯著降低(p<0.05),其中模型組、ZnSO4和殼寡糖+ZnSO4處理組降低幅度較大,分別至50.32%、36.63%和43.71%。研究表明,D-半乳糖誘導(dǎo)可使小鼠體內(nèi)類似半乳糖血癥的代謝功能紊亂,致使氧化應(yīng)激效應(yīng)增強(qiáng),造成體內(nèi)線粒體及神經(jīng)損傷,氧化衰老進(jìn)程加速。厚壁菌門在腸道中主要功能是對碳水化合物和蛋白質(zhì)進(jìn)行水解,而擬桿菌門主要作用于類固醇、多糖和膽汁酸,其有助于機(jī)體對多糖的吸收以及蛋白質(zhì)的合成[8-9]。Larsen等[10]發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道內(nèi),擬桿菌門和厚壁菌門占整體菌群總含量90%以上,二者比例與血糖濃度成正比;同時(shí),變形菌門在腸道內(nèi)大量富集現(xiàn)象,并伴隨著血糖濃度升高,其含量也顯著增加(p<0.05)。本研究中,D-半乳糖誘導(dǎo)顯著影響了正常小鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度及相互間的比例關(guān)系,陽性對照、殼寡糖和殼寡糖-Zn2+配合物對這兩個(gè)菌門表現(xiàn)出一定調(diào)節(jié)作用,而ZnSO4和殼寡糖+ZnSO4處理的調(diào)節(jié)作用相對較弱。

圖1 不同給藥后小鼠腸道菌群組成(門水平)Fig.1 Bacterial community composition at phylum level in different groups

圖2 不同給藥后小鼠腸道菌群組成(科水平)Fig.2 Bacterial community composition at family level in different groups

在科分類水平上(圖2),空白小鼠(N)腸道中乳桿菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)所占比例相對較高,三者相對豐度之和達(dá)到66.87%。經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)后,小鼠腸道中BacteroidalesS24-7 group所占比例大幅增加,其中以模型組(M)豐度值最高達(dá)31.60%,殼寡糖-Zn2+配合物給藥組(CZ)豐度值較低為16.69%,而其他各組均顯著高于殼寡糖-Zn2+配合物組(p<0.05)。研究表明,在腸炎模型及高脂飼喂小鼠腸道菌群組成中,BacteroidalesS24-7 group豐度均顯著增加,其含量變化與諸多外界環(huán)境及誘導(dǎo)脅迫因素有關(guān)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中,空白組小鼠腸道樣本中BacteroidalesS24-7 group含量較低,殼寡糖-Zn2+配合物和VC(陽性對照)給藥對BacteroidalesS24-7 group調(diào)節(jié)作用顯著,且顯著高于其他各組和模型組(p<0.05),表明殼寡糖-Zn2+配合物可通過調(diào)控BacteroidalesS24-7 group含量而減弱氧化脅迫對小鼠的影響作用。另一方面,乳桿菌科(Lactobacillaceae)所占比例顯著降低,除殼寡糖+ZnSO4組外其它各給藥組間無顯著性差異(p>0.05)。VC和殼寡糖-Zn2+配合物給藥對小鼠腸道內(nèi)消化球菌科(Peptococcaceae)豐度有增加效果,顯著高于其他各組(p<0.05)。消化球菌科細(xì)菌為動(dòng)物腸道常駐細(xì)菌,相關(guān)研究表明動(dòng)物體內(nèi)多種內(nèi)毒素含量與該科細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即體內(nèi)消化球菌科一定程度上表明該給藥組體內(nèi)相關(guān)內(nèi)毒素含量較少[13],進(jìn)一步說明VC和殼寡糖-Zn2+配合物可有效減少小鼠體內(nèi)氧化炎癥反應(yīng)程度。此外,VC和殼寡糖-Zn2+配合物對小鼠腸道內(nèi)瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)含量具有一定升高作用。Suchodolski等[14]認(rèn)為瘤胃菌科和毛螺菌科在機(jī)體內(nèi)具有一定的腸道保護(hù)作用,其在胃腸道炎癥誘導(dǎo)模型小鼠中含量變化顯著。從科水平綜合分析來看,與空白組(N)和模型組(M)相比,陽性對照(Y)、殼寡糖(CH)和殼寡糖-Zn2+配合物(CZ)對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠腸道內(nèi)菌群組成具有一定的恢復(fù)作用。

2.3 腸道菌群多樣性指數(shù)分析

樣本微生物多樣性,可通過單樣本多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性。表征樣品菌群豐度(Community richness)主要有Ace和Chao指數(shù),表征菌群多樣性(Community diversity)主要有Shannon和Simpson指數(shù)[15]。此外,Coverage代表各樣本文庫覆蓋率,其數(shù)值越高,則樣本中序列被測出的概率越高,而沒有被測出的概率越低,直接反映測序結(jié)果是否代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

由表2結(jié)果可知,所有樣本測序覆蓋率(Coverage)均在0.998以上,說明測序?qū)颖局屑?xì)菌的覆蓋率很高、測序深度適合,可滿足樣品中細(xì)菌多樣性分析的需要[16]。各組Chao和Ace指數(shù)數(shù)值近似,表明各樣本中物種數(shù)均較為豐富。此外,由稀釋曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3),當(dāng)樣品測序數(shù)量超過20000時(shí),稀釋曲線趨向飽和,表明樣品序數(shù)據(jù)量合理,更多數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新OTU[17]。Shannon-Wiener曲線趨向平坦,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,可反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。上述現(xiàn)象表明,隨著測序量增加新的菌系不會被發(fā)現(xiàn),微生物多樣性也不會發(fā)生變化。相比于其他組,空白組小鼠腸道菌群樣品Ace、Chao和Shannon指數(shù)值最低、Simpson指數(shù)最高,表明其菌群豐度及多樣性較低。經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)后,各組樣品Ace、Chao和Shannon指數(shù)升高、Simpson指數(shù)降低,由此可說明D-半乳糖誘導(dǎo)致使小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,致使菌群多樣性增加。在各給藥組中,以殼寡糖、殼寡糖-Zn2+配合物對小鼠腸道菌群多樣性增加幅度較大,該結(jié)果與以上的菌群組成分析結(jié)果相一致(圖1和圖2)。

表2 各組樣品的多樣性指數(shù)分析Table 2 Diversity of bacterial community in different groups

圖3 稀釋曲線(A)和Shannon-Wiener曲線(B)分析Fig.3 Results of the Rarefaction curves(A) and Shannon-Wiener curves(B)

2.4 腸道菌群樣本組成分析

Heatmap用顏色變化來反映二維矩陣或表格中數(shù)據(jù)信息,可直觀的將數(shù)據(jù)值大小以定義顏色深淺表示出來。在Heatmap圖上,將高豐度和低豐度物種分塊聚集,通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣本群落組成相似性和差異性[18]。從物種和樣本兩個(gè)層面對OTU進(jìn)行聚類,繪制物種豐度熱圖,結(jié)果如圖4所示。由樣本間菌群結(jié)構(gòu)相似度分析發(fā)現(xiàn),空白小鼠組(N)單獨(dú)聚為一類,而經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)后小鼠聚為另一大類,表明D-半乳糖誘導(dǎo)對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響。在模型組及各給藥組中,又可分為三個(gè)分支:模型組(M);殼寡糖組(CH)和ZnSO4組(ZN);陽性對照(Y)、殼寡糖+ZnSO4(CO)和殼寡糖-Zn2+配合物(CZ)。以上結(jié)果表明,相比于模型組,各給藥處理對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了顯著影響,尤其殼寡糖+ZnSO4(CO)和殼寡糖-Zn2+配合物(CZ)處理效果較好。

對于菌門豐度聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖4),對空白組樣本相比,各樣本中厚壁菌門豐度顯著減少(顏色變淺)、擬桿菌門和變性菌門豐度顯著增加(顏色加深),該結(jié)果與不同分類水平上的物種注釋結(jié)果相一致。以空白、模型、陽性對照和殼寡糖-Zn2+配合物組樣本的物種比例和分布分析發(fā)現(xiàn)(結(jié)果圖略),在界、門、綱、目、科等水平上,D-半乳糖誘導(dǎo)后小鼠腸道樣本菌群結(jié)構(gòu)、豐度及相互比例,均發(fā)生了顯著性變化,表明D-半乳糖在誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激效應(yīng)同時(shí),對其腸道菌群也產(chǎn)生了較大影響,或D-半乳糖通過改變小鼠腸道菌結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生了較強(qiáng)的氧化應(yīng)激效應(yīng)。相比于模型對照組,殼寡糖-Zn2+配合物和VC給藥處理,表現(xiàn)出對氧化衰老小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的逆向恢復(fù)作用,使其腸道菌群比例和分布更加接近于空白組樣本。

2.5 腸道菌群樣本PCA比較分析

PCA分析(Principal Component Analysis),即主成分分析,其通過分析不同樣本OTU(97%相似性)組成,可反映樣本間的差異和距離。PCA運(yùn)用方差分解,將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上[19]。不同樣本可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況,樣本組成越相似,其反映在PCA圖中的距離越近。小鼠腸道樣本PCA分析結(jié)果,如圖6所示。對于主成分PC1-2分析,空白組(N)與其他誘導(dǎo)組樣本相聚較遠(yuǎn),說明D-半乳糖誘導(dǎo)對小鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)影響顯著;陽性對照(Y)、殼寡糖-Zn2+配合物組(CZ)樣本菌落組成最相近,通過PCA分析無法區(qū)分,即殼寡糖-Zn2+配合物與VC給藥,對于小鼠腸道菌群的影響作用較為相近。對于主成分PC1-3分析,在PC3軸上,陽性對照(Y)、殼寡糖-Zn2+配合物(CZ)和殼寡糖+ZnSO4組(CO)本菌落組成最相近,且在PC1軸上無法區(qū)分,也說明該三組在優(yōu)微生物組成中無顯著性差異。對于主成分PC2-3分析,空白組(N)、陽性對照(Y)、殼寡糖-Zn2+配合物(CZ)和殼寡糖+ZnSO4組(CO)距離相對較為接近,從某種程度上,其樣本菌群組成及結(jié)構(gòu)具有一定相似性。

圖6 小鼠腸道樣本PCA分析Fig.6 PCA of intestinal microbiota for different samples注:PC1-2、PC1-3、PC2-3分別是 用前三個(gè)主要成分兩兩組合作圖。

3 討論

4 結(jié)論

以D-半乳糖注射法構(gòu)建氧化衰老小鼠模型,以VC給藥為陽性對照,探究殼寡糖、殼寡糖-Zn2+配合物對模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于正常組,D-半乳糖誘導(dǎo)造成小鼠腸道微生物豐度增加,菌群Alpha多樣性升高,表明氧化誘導(dǎo)造成了機(jī)體代謝紊亂、腸道菌群發(fā)生顯著性變化。相比于模型組,殼寡糖、殼寡糖-Zn2+配合物給藥處理,對氧化衰老小鼠腸道中部分微生物具有一定逆向恢復(fù)作用。研究表明,小鼠腸道菌群關(guān)系與機(jī)體的氧化衰老之間具有一定相關(guān)性,殼寡糖及其Zn2+配合物可作為一種體內(nèi)功能型抗氧化劑,調(diào)控機(jī)體生理功能及腸道菌群結(jié)構(gòu)。

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