環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)植物油中 摻假地溝油方法的建立

趙彩紅,蔡 勇,曹 忻,楊具田,伍欣然,臧榮鑫,*,徐紅偉,*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,甘肅蘭州 730030)

近年來(lái),諸多不法企業(yè)將動(dòng)物油脂或者地溝油按比例勾兌成食用植物油,從中謀取暴利。地溝油主要是由各種潲水、用于油炸食品的油、劣質(zhì)動(dòng)物肉、內(nèi)臟、毛皮等加工及提煉后產(chǎn)出的油煉制而成。其色澤、氣味、滋味等感官指標(biāo),以及酸價(jià)和過(guò)氧化值等理化指標(biāo)接近或完全符合國(guó)家《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2716-2005),摻混后與正常食用植物油難以區(qū)分[1]。植物油中摻假地溝油,使得大量地溝油重回餐桌,危害人們的健康。因此,建立一種快速、高效、準(zhǔn)確、適應(yīng)性強(qiáng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法具有重要的意義。

2011年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部組織全國(guó)相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)家、學(xué)者和技術(shù)人員開(kāi)展了大規(guī)模的地溝油檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)合攻關(guān)研究,先后征集和驗(yàn)證的地溝油檢測(cè)方法達(dá)到300多種,包含光譜法、色譜法、核磁共振及電子鼻、電子舌等氣滋味譜方法。2012年初步確定了4個(gè)檢測(cè)方法以及3個(gè)篩查方法,其中含三種辣椒堿殘留量的液相色譜-質(zhì)譜法[2-4]、特征奇數(shù)碳脂肪酸的多維氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、高場(chǎng)核磁共振法[6-8]等。但是由于地溝油來(lái)源及成分的復(fù)雜性和精煉工藝的差異性,迄今為止未得出任何公認(rèn)的鑒別檢測(cè)方法,而篩選出的7種方法還需進(jìn)一步驗(yàn)證和完善,確定其有效性和準(zhǔn)確性。地溝油在收集過(guò)程中會(huì)不可避免地混入動(dòng)物源性成分,因此,新發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)地溝油的方法值得深究。

目前,分子生物學(xué)方法包括普通PCR法[9],單一熒光PCR法[10],多重?zé)晒釶CR法及實(shí)時(shí)熒光PCR[11-12]等。楊冬燕等利用多重實(shí)時(shí)熒光PCR法鑒別牛肉[13]、羊肉[14]的摻假,候東軍等[15]也利用三重?zé)晒釶CR技術(shù)鑒定食品中的牛、豬、鴨源性成分,王立平等[16]利用PCR法檢測(cè)食用植物油中動(dòng)物源性成分,黃治國(guó)等[17]應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)食用油中雞和牛源成分,探討了PCR技術(shù)在食用油中檢測(cè)動(dòng)物源性成分的可行性。由 Notomi等[18]人發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)克服了PCR技術(shù)的某些不足,針對(duì)靶基因的6個(gè)特異區(qū)域,設(shè)計(jì)4條特異性引物,具有特異靈敏、簡(jiǎn)單易學(xué)等特征,尤其適合一些場(chǎng)所的快速檢測(cè)。譚貴良等[1]根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中豬、牛、雞、鴨的線(xiàn)粒體基因序列設(shè)計(jì)了四組引物,首次采用LAMP方法對(duì)食用植物油和地溝油中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行了檢測(cè),但此方法需通過(guò)四次擴(kuò)增反應(yīng),才僅能檢測(cè)四種動(dòng)物源性DNA,不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本研究依據(jù)脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組中的超級(jí)保守DNA序列[19]為靶標(biāo),以植物油中不應(yīng)該存在動(dòng)物源性成分為鑒定依據(jù),以期建立一種能一次反應(yīng)同時(shí)特異性擴(kuò)增出牛、羊、豬和雞等所有脊椎動(dòng)物源性DNA的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)LAMP技術(shù),為油脂的摻假鑒偽提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛油、羊油、豬油以及雞油 自制,從本地市場(chǎng)分別采購(gòu)牛板油、羊板油、豬板油以及雞板油,切成約1 cm3熬制1 h左右,棄油渣,將油儲(chǔ)于陶瓷容器中,待冷卻凝固后室溫放置備用;陽(yáng)性對(duì)照(豬質(zhì)粒) 根據(jù)陳正芳[20]方法制備;大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和兩種不同品牌的植物調(diào)和油 購(gòu)自本地超市;Bst DNA聚合酶、甜菜堿、dNTP、熒光染料SYBR Green I、SDS、Tris、NaCl、Na2EDTA、巰基乙醇、TE緩沖液等 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

超速低溫離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;超純水系統(tǒng) 購(gòu)自德國(guó);FTC-3000+實(shí)時(shí)熒光PCR儀 產(chǎn)自加拿大Funglyn Biotech。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì) 涂四利等[19]在比較所有細(xì)菌、古細(xì)菌及所有線(xiàn)粒體全基因組數(shù)據(jù)后,發(fā)現(xiàn)僅在脊椎動(dòng)物的線(xiàn)粒體基因組有4段獨(dú)有的最長(zhǎng)或次長(zhǎng)的22～30 bp的超級(jí)保守子序列,經(jīng)BLAST在線(xiàn)比對(duì)進(jìn)行分析,這4段保守子序列集中在一段259 bp的保守序列中。本研究根據(jù)這段259 bp的保守序列為目標(biāo)序列,利用引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.heml設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物,即兩條外引物(F3、B3)和兩條內(nèi)引物(FIP、BIP)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,PAGE純化。引物序列見(jiàn)表1。

表1 LAMP反應(yīng)引物 Table 1 Primer used in LAMP

1.2.2 基因組DNA的提取 采用SDS堿裂解法[21]提取植物油以及65 ℃水浴成液態(tài)后的動(dòng)物油脂的總DNA。在2 mL離心管中加入400 μL TE(Tris-HCl)緩沖液,然后加入食用油1 mL,漩渦振蕩混勻約5 min,室溫下13000 r/min離心5 min,小心去除上層油脂,留下層水相,在同一支EP管中再次加入食用油1 mL,渦旋振蕩混勻,離心共重復(fù)20次后,轉(zhuǎn)移水相至另一新的EP管中,加入100 μL 20% SDS 混勻,65 ℃水浴10 min,期間顛倒數(shù)次。加入200 μL 3 mol/L NaAc,混勻,置于冰上20～30 min后,4 ℃、13000 r/min 離心10 min,取上清液至一新的EP管中,再加入等體積的Tris苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻,靜置10 min,離心。取上清液至一新的EP管中,加0.7倍體積的異丙醇,顛倒混勻后于-20 ℃冰箱靜置過(guò)夜沉淀DNA,再4 ℃ 13000 r/min離心10 min,去除上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,反復(fù)2次,自然晾干,加50 μL TE溶解,-20 ℃保存。

1.2.3 LAMP反應(yīng)及反應(yīng)體系的優(yōu)化 LAMP反應(yīng)體系(25 μL)含有1.2～2.4 μmol/L FIP、1.2～2.4 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8～1.6 mol/L 甜菜堿、4～10 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、8 U BstDNA聚合酶及2 μL DNA模板。反應(yīng)條件為65 ℃,擴(kuò)增1 h。以雙蒸水作為陰性對(duì)照。

LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物采用恒溫實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)以及加入SYBR Green I熒光染料,肉眼觀(guān)察反應(yīng)結(jié)果。方法一:反應(yīng)體系配制完成后加入0.2 mL的離心管,在體系中加入0.2 μmol/L的SYBR Green I熒光染料,并加入50 μL的穩(wěn)定液以避免反應(yīng)體系的揮發(fā)和污染。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀設(shè)定 Holding Stage為 65 ℃ 30 s,1 個(gè)循環(huán);Cycling Stage為 65 ℃ 15 s,65 ℃ 45 s,60個(gè)循環(huán),于65 ℃ 45 s處收集熒光信號(hào),熒光通道為FAM。

方法二:反應(yīng)體系配制完成后加入0.2 mL的HF管的大隔室,再加入50 μL的穩(wěn)定液,最后向小隔室加入1～2 μL的100×SYBR Green I顯色液進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀設(shè)定Holding Stage為65 ℃ 30 s,1個(gè)循環(huán);Cycling Stage為65 ℃ 15 s,65 ℃ 45 s,60個(gè)循環(huán),當(dāng)反應(yīng)程序結(jié)束后,將HF反應(yīng)管倒置甩動(dòng)2次,在正置甩動(dòng)2次,使工作液與顯色液充分混合,冷卻至室溫后,肉眼觀(guān)察,顏色變綠表明發(fā)生了擴(kuò)增,橙色表明未發(fā)生擴(kuò)增。

1.2.4 LAMP特異性實(shí)驗(yàn) 采用優(yōu)化好的LAMP方法對(duì)牛油、羊油、豬油、雞油及六種植物油樣品DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,以驗(yàn)證特異性引物對(duì)牛、羊、豬和雞源性成分檢測(cè)的特異性,設(shè)置程序,65 ℃ 1 h,擴(kuò)增產(chǎn)物采用實(shí)時(shí)熒光法，加入SYBR Green I熒光染料進(jìn)行觀(guān)察。

1.2.5 LAMP靈敏性實(shí)驗(yàn) 分別提取牛油、羊油、豬油和大豆油中的總DNA,測(cè)定DNA濃度,將牛油、羊油、豬油用大豆油梯度稀釋至含0.10、0.01、0.001 ng/μL三個(gè)濃度梯度的樣品作為DNA模板。采用優(yōu)化好的LAMP方法對(duì)牛油、羊油、豬油三種混合樣品的三個(gè)稀釋梯度進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,設(shè)置1.2.3中方法二的程序,65 ℃ 1 h,擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I熒光染料進(jìn)行觀(guān)察。當(dāng)反應(yīng)程序結(jié)束后,將HF反應(yīng)管倒置甩動(dòng)2次,在正置甩動(dòng)2次,使工作液與顯色液充分混合,冷卻至室溫后,肉眼觀(guān)察,顏色變綠表明發(fā)生了擴(kuò)增,橙色表明未發(fā)生擴(kuò)增。

1.2.6 LAMP穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采用優(yōu)化好的LAMP方法,將牛、羊、豬和雞四種不同DNA濃度的油脂,每個(gè)樣品設(shè)置4管平行,同時(shí)設(shè)置1管陰性對(duì)照和大豆油、花生油以及玉米油三種植物油對(duì)照,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,設(shè)置1.2.3中方法二的程序,65 ℃ 1 h,擴(kuò)增產(chǎn)物是加入SYBR Green I熒光染料進(jìn)行觀(guān)察。當(dāng)反應(yīng)程序結(jié)束后,將HF反應(yīng)管倒置甩動(dòng)2次,在正置甩動(dòng)2次,使工作液與顯色液充分混合,冷卻至室溫后,肉眼觀(guān)察,顏色變綠表明發(fā)生了擴(kuò)增,橙色表明未發(fā)生擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

本研究采用SDS堿裂解法提取植物油和動(dòng)物油脂中的總DNA,獲得牛、羊、豬和雞四個(gè)物種DNA模板的純度260/280比值在1.8～2.0之間,濃度在16.0～30.0 ng/μL。大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調(diào)和油的DNA模板純度260/280比值在1.8～2.0之間,濃度在2.0～10.0 ng/μL之間。樣品DNA的濃度及純度適合后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng),且符合后續(xù)擴(kuò)增曲線(xiàn)的結(jié)果。

2.2 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),選定羊DNA作為標(biāo)準(zhǔn)體系,測(cè)定DNA濃度,并梯度稀釋至0.10、0.01、0.001 ng/μL三個(gè)濃度梯度作為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn),對(duì)甜菜堿、Bst DNA聚合酶等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后,最終確定LAMP(25 μL)反應(yīng)體系為:1.6 μmol/L內(nèi)引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgS04,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U BstDNA聚合酶,在65 ℃條件下擴(kuò)增1 h。在該反應(yīng)體系下,羊DNA的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光LAMP優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Real-time fluorescence LAMP reaction under the optimized condition注:1:陽(yáng)性對(duì)照(豬質(zhì)粒);2:羊DNA模板濃度0.1 ng/μL;3:羊DNA模板濃度0.01 ng/μL;4:羊DNA模板濃度0.001 ng/μL;5:陰性對(duì)照(雙蒸水)。

2.3 LAMP特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

本研究選取生活中常用的大豆油、花生油等六種植物油以及常見(jiàn)的牛、羊、豬和雞四種動(dòng)物油脂作為研究對(duì)象。實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)和LAMP染色法結(jié)果見(jiàn)圖2。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光曲線(xiàn)圖表明,該法僅對(duì)牛油、羊油、豬油、雞油這四種樣品油脂發(fā)生了特異性擴(kuò)增,其他油脂和陰性對(duì)照均未起峰。擴(kuò)增產(chǎn)物的LAMP肉眼觀(guān)察法結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光LAMP法相一致,均是牛油、羊油、豬油和雞油為陽(yáng)性,其余油脂以及陰性對(duì)照為正常陰性。這表明上述LAMP引物在DNA模板純度合適的情況下,對(duì)油脂中動(dòng)物源性成分檢測(cè)具有很好的特異性。

圖2 LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specificity detection by LAMP注:1:陰性對(duì)照(雙蒸水);2:陽(yáng)性對(duì)照(豬質(zhì)粒);3:牛油DNA;4:豬油DNA;5:雞油DNA;6:羊油DNA;a:大豆油;b:花生油;c:玉米油;d:橄欖油;e:植物調(diào)和油1;f:植物調(diào)和油2。

2.4 LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果

采用熒光染色法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定,其擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,牛油、羊油及豬油三種動(dòng)物油脂DNA樣品與大豆油DNA混合后,被稀釋成0.01 ng/μL時(shí)能檢測(cè)出動(dòng)物源性,但當(dāng)稀釋成0.001 ng/μL后HF管內(nèi)呈現(xiàn)橙色,即未發(fā)生擴(kuò)增。由此表明,LAMP方法可以檢測(cè)出大豆油中含有0.01 ng/μL的動(dòng)物源性成分,即植物油中摻入動(dòng)物油脂的最低檢出限度是0.01 ng/μL。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度低時(shí),肉眼觀(guān)察結(jié)果易產(chǎn)生誤差[22]。根據(jù)專(zhuān)利[21]報(bào)道,采用LAMP技術(shù)鑒別地溝油時(shí),當(dāng)LAMP檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí),該待檢樣品為地溝油。當(dāng)LAMP檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí),且待檢測(cè)樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標(biāo)準(zhǔn)油脂樣品處理后的濃度的1%時(shí),則應(yīng)判斷樣品為地溝油。

圖3 LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Sensitivity detectionby LAMP注:N:陰性對(duì)照(雙蒸水);A-1:混合樣品含豬油DNA濃度0.001 ng/μL;A-2:混合樣品含豬油DNA濃度0.01 ng/μL;A-3:混合樣品含豬油DNA濃度0.1 ng/μL;B-1:混合樣品含牛油DNA濃度0.001 ng/μL;B-2:混合樣品含牛油DNA濃度0.01 ng/μL;B-3:混合樣品含牛油DNA濃度0.1 ng/μL;C-1:混合樣品含羊油DNA濃度0.001 ng/μL;C-2:混合樣品含羊油DNA濃度0.01 ng/μL;C-3:混合樣品含羊油DNA濃度0.1 ng/μL。

2.5 LAMP穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

由于地溝油成分的復(fù)雜性,單一指標(biāo)難以涵蓋所有種類(lèi)的地溝油,且檢測(cè)指標(biāo)易受精煉程度和人為勾兌的影響。因此,在研究地溝油檢測(cè)指標(biāo)特點(diǎn)的同時(shí),還需對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。其擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4,結(jié)果表明,牛、羊、豬和雞四種不同DNA濃度的油脂均發(fā)生擴(kuò)增,陰性對(duì)照和大豆油、花生油以及玉米油均未發(fā)生擴(kuò)增,說(shuō)明LAMP擴(kuò)增技術(shù)具有很好的穩(wěn)定性,適合做快速檢測(cè),同時(shí)他對(duì)儀器設(shè)備的要求不高,表明在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有很高的適應(yīng)性。

圖4 LAMP穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Stability detection by LAMP注:N:陰性對(duì)照(雙蒸水);1:大豆油;2:花生油;3:玉米油;A:雞油DNA;B:豬油DNA;C:牛油DNA;D:羊油DNA。

3 討論與結(jié)論

地溝油的來(lái)源多樣、加工工藝不同,有的地溝油經(jīng)過(guò)高溫、粉碎、攪拌等生產(chǎn)處理,細(xì)胞核基因組往往被破壞,石亞新[23]以雞油和豬油為代表的動(dòng)物油脂進(jìn)行脫膠、脫色、脫臭處理,模擬油脂精煉工藝,研究其 DNA 信息衰減變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雞油精煉處理后 DNA 含量下降了9.5%,豬油下降了11%,因此證實(shí)了油脂精煉工藝會(huì)對(duì)動(dòng)物基因信息造成部分損失。楊冬燕等[24]以動(dòng)物源性HOXC6基因?yàn)樘禺愋詸z測(cè)指標(biāo),采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)食用油中摻假地溝油時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著地溝油含量的降低其檢測(cè)準(zhǔn)確率也隨之降低。因此,在檢測(cè)地溝油時(shí),檢測(cè)靶標(biāo)DNA是分子生物學(xué)技術(shù)能否成功檢驗(yàn)地溝油的關(guān)鍵因素。線(xiàn)粒體DNA具有穩(wěn)定性好、分子量小、拷貝數(shù)多等特點(diǎn),在地溝油的反復(fù)精煉過(guò)程中,具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性,可作為動(dòng)物性外源成分鑒定和物種分類(lèi)等技術(shù)的理想靶基因[25]。

LAMP技術(shù)的發(fā)展十分迅速,已成功的應(yīng)用于致病菌[26-28]、轉(zhuǎn)基因成分[29-31]的檢測(cè)等方面,而且其靈敏度高,檢測(cè)極限能達(dá)到10拷貝[32-33]。本研究建立的LAMP法檢測(cè)植物油中摻假地溝油,在1.6 μmol/L內(nèi)引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgS04,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U Bst DNA聚合酶,擴(kuò)增溫度為65 ℃,擴(kuò)增時(shí)間為1 h的優(yōu)化條件下,能檢出模擬地溝油樣品中0.01 ng/μL的動(dòng)物源性DNA成分。但因地溝油樣品來(lái)源的限制,下一步還需擴(kuò)大樣品量,以提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法的適用性。

本研究以植物油中不應(yīng)該存在動(dòng)物源性成分為鑒定依據(jù),以動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA為檢測(cè)靶標(biāo),針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域,設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物,建立了利用LAMP法檢測(cè)食用植物油和地溝油中動(dòng)物源性成分的新方法。該方法不需要特殊試劑與設(shè)備,檢測(cè)成本低,且重復(fù)性好、穩(wěn)定性高,能夠特異性擴(kuò)增出牛、羊、豬和雞等脊椎動(dòng)物的動(dòng)物源性基因。為油脂鑒偽和地溝油的鑒別提供一種穩(wěn)定、高效、適應(yīng)性強(qiáng)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。

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