甜柿果實多酚類物質(zhì)提取工藝的 優(yōu)化及其抗肺癌細胞生長的活性研究

楊谷良,李士明,鄧 昆,潘敏雄,*

(1.經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,湖北黃岡 438000;2.黃岡師范學院生命科學學院,湖北黃岡 438000)

甜柿(DiospyruskakiThunb.)原產(chǎn)地在我國長江流域及其以南地區(qū),是一種柿屬柿科的落葉果樹[1],在我國從南到北都有分布。由于柿果含有豐富的糖分、維生素、類胡蘿卜素、總膳食纖維和微量元素,果實風味獨特,深受人們的喜愛[2]。在我國,羅田甜柿主要起源于大別山區(qū),因為最先在黃岡市羅田縣被發(fā)現(xiàn),而被命名為羅田甜柿(DiospyroskakiThunb.‘Luotian-tianshi’)[3-4]。柿果實中的多酚類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降血脂、降膽固醇、抗氧化、清除自由基等生物活性[5-7]。

植物多酚是植物體內(nèi)合成的一類復雜的次生代謝物,在植物受到損傷或感染時,可以增強植物的自身防御能力。植物中多酚類物質(zhì)的提取方法主要有有機溶劑萃取法[8]、超聲波法[9]、微波法[10]、酶解法[11]等。其中,有機溶劑萃取法需要對有機溶劑的極性、萃取時間和溫度等進行優(yōu)化;超聲波法和微波法都是在溶劑萃取法的基礎(chǔ)上,利用超聲波或微波等的作用,破碎細胞,通過溶劑的極性來選擇提取目的產(chǎn)物;酶法提取效率高,但是后續(xù)分離純化過程中,要增加去除酶的實驗步驟[12]。目前,已經(jīng)從植物中分離鑒定了幾百種多酚類物質(zhì)。本研究利用乙醇溶液提取羅田甜柿果實中的多酚類化合物,對提取過程中的浸提時間、浸提溫度和乙醇體積分數(shù)等因素進行優(yōu)化,確定羅田甜柿果實多酚類化合物提取的最佳條件,并研究了所提取多酚類物質(zhì)抑制腫瘤細胞生長的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BPN-150RHP型CO2細胞培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;KHB-ST-360全自動酶標儀 上海華科生物工程股份有限公司;PB2002-10電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司;GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司;722S可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HH-8電子恒溫水浴鍋 深圳國華儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 柿果多酚的提取工藝 將甜柿果實清洗干凈后,去除果核后切片,65 ℃烘干至恒重[13],粉碎機粉碎,過60目篩,乙醇溶液浸泡提取柿果多酚,過濾,經(jīng)減壓蒸餾后得柿果多酚提取物,每個處理重復3次。

1.2.2 多酚提取率的測定 以沒食子酸為標準品,參照文獻[11,14]的方法繪制沒食子酸標準曲線,每個樣品平行測定三次。

準確稱取5.000 g的甜柿果實粉碎物若干份,按實驗設(shè)計提取得到多酚提取液,減壓蒸餾直至形成膏狀提取物,刮取膏狀提取物并稱重(w)。用體積分數(shù)為50%的乙醇將上述膏狀提取物溶解后,繼續(xù)加入50%的乙醇,至總體積為100 mL。移取5 mL用乙醇稀釋的溶液,用體積分數(shù)為50%的乙醇稀釋至50 mL。在25 mL棕色容量瓶中分別加入0.5 mL上述乙醇稀釋液、1.0 mL福林酚試劑、15.0 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的Na2CO3溶液,攪拌均勻后,加水定容到25 mL,在室溫條件下靜置2 h后,用分光光度計測定760 nm處的吸光值。多酚提取率按公式(1)計算:

多酚提取率(mg/100 g鮮果重)=y×20×100×N÷w

式(1)

式中:y為根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算得到的多酚含量值,mg;20和100為提取物的稀釋倍數(shù);N為每100 g甜柿鮮果經(jīng)去核和烘干等處理后得到干粉的質(zhì)量,mg/100 g鮮果重;w為甜柿干粉的質(zhì)量,mg。

1.2.3 柿果多酚提取的單因素實驗 固定液料比為13∶1 mL∶g,提取液中NaHCO3的質(zhì)量濃度為0.15%,提取時間為3 h,提取溫度為 70 ℃,乙醇體積分數(shù)為70%的條件下,分別考察提取時間:1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h,提取溫度:60、65、70、75、80 ℃,乙醇體積分數(shù):65%、70%、75%、80%、85%對多酚提取率的影響。

1.2.4 柿果多酚提取工藝的優(yōu)化 采用Box-Behnken方法,以提取時間(A)、提取溫度(B)和乙醇體積分數(shù)(C)三個因素為自變量,根據(jù)單因素實驗結(jié)果,進行響應面優(yōu)化(表1)。

這位醫(yī)生解釋道，醫(yī)生的水平有高有低，但都有共同的職業(yè)操守，絕不會刻意貽誤病情，置病人安危于不顧，可能是因為每位醫(yī)生的性格、用藥習慣、診斷方式等差異，在病人眼中造成了“不說話不搭理我”、“開藥和別的醫(yī)生不同，恐怕是亂開”、“診斷過程很簡單，看不出花了心思”等等誤解。

表1 響應面實驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 柿果總酚對CL1-5細胞的生長抑制作用 以多西他賽為陽性對照,采用MTT法測定柿果多酚抗人肺癌細胞CL1-5生長活性[15]。人肺癌細胞系CL1-5生長于RPMI 1640培養(yǎng)基中(添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素),在95%的相對濕度、5% CO2濃度和37 ℃的溫度條件下,培養(yǎng)CL1-5細胞。當細胞在培養(yǎng)瓶的生長面積達到80%以上時,棄去舊的培養(yǎng)基,用胰酶消化細胞,用新鮮培養(yǎng)基稀釋至每毫升含1×105個細胞,在96 孔板中接種100 μL稀釋細胞液,空白組加入100 μL培養(yǎng)基,37 ℃條件下培養(yǎng)12 h后,吸去舊培養(yǎng)液,在每孔中分別加入質(zhì)量濃度12.5、25、50、100、200、400 μg/mL多酚提取液和12.5、25、50、100、200、400 ng/mL的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液,每個質(zhì)量濃度重復5孔。對照組加入等體積的乙醇溶液,空白組加入等體積的培養(yǎng)基后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,在所有的孔中均加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液,將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,4000 r/min離心5 min,棄上清液,在每孔中加入100 μL DMSO,振蕩15 min后,用酶標儀檢測570 nm波長處各孔的OD值。按公式(2)計算柿果多酚對CL1-5細胞的增殖抑制率。

細胞增殖抑制率(%)=[(OD正常組-OD處理組)/(OD正常組-OD空白組)]×100

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel軟件整理實驗數(shù)據(jù),以SAS(statistical analysis system)統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果,并以Microsoft Excel軟件繪圖。實驗結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

以不同質(zhì)量濃度(x)的沒食子酸為橫坐標、760 nm波長處的吸光度值(y)為縱坐標,繪制出了如圖1的沒食子酸標準曲線。所得標準曲線的線性回歸方程為y=39.39x+0.030,相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取時間對柿果多酚提取率的影響 由圖2可知,當提取時間小于3 h時,柿果多酚的提取率隨提取時間的延長而不斷增加,這是因為隨著提取時間的延長,柿果多酚被不斷從甜柿果實粉碎物中浸提出來,同時,隨著提取時間的繼續(xù)延長，浸提液中溶解的淀粉和蛋白質(zhì)等也不斷增加,提取液的黏度逐漸增大[16],在后續(xù)離心、濃縮和過濾等操作中,柿果多酚的分離效率降低,總酚提取率下降。所以,提取時間不宜超過3 h。

圖2 提取時間對柿果多酚提取效果的影響Fig.2 The influence of extraction time on the extration of persimmon polyphenol

圖3 提取溫度對柿果多酚提取效果的影響Fig.3 The influence of extraction temperature on the extration of persimmon polyphenol

2.2.2 提取溫度對柿果多酚提取率的影響 由圖3可以看出,柿果多酚的提取率隨著提取溫度的升高而不斷增加,當提取溫度超過70 ℃時,隨著提取溫度的升高,多酚的提取效率不斷降低。其原因可能是提取溫度過高,多酚類物質(zhì)會受到破壞,且會加快提取溶劑乙醇的揮發(fā),另外,隨著提取溫度的升高,甜柿果實中其它物質(zhì)的溶出率增加,提取液粘度增大,影響后續(xù)的多酚分離純化,導致多酚提取率降低[17]。所以,柿果多酚的提取溫度不宜超過70 ℃。

2.2.3 乙醇體積分數(shù)對柿果多酚提取率的影響 由圖4可以看出,當乙醇體積分數(shù)小于75%時,柿果多酚的提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加逐漸升高;當乙醇體積分數(shù)大于75%時,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,柿果多酚的提取率逐漸降低。這可能是因為,不同體積分數(shù)的乙醇在極性上存在著差異,體積分數(shù)為75%的乙醇與甜柿多酚類化合物極性相近,多酚類物質(zhì)的溶解度最大;而在其它體積分數(shù)的乙醇中,多酚類物質(zhì)的溶解性降低,其它物質(zhì)的溶解度增加,柿果多酚的提取率降低[18]。所以,柿果多酚提取的適宜乙醇體積分數(shù)為75%。

圖4 乙醇體積分數(shù)對柿果多酚提取效果的影響Fig.4 The influence of ethanol concentration on the extration of persimmon polyphenol

2.3 響應面實驗結(jié)果與分析

以柿果多酚的提取率為響應值Y,通過Design-ExPert軟件,對柿果多酚的提取溫度(A)、提取時間(B)和乙醇體積分數(shù)(C)3個因素進行了響應面分析。對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合后,得到甜柿果實多酚提取率Y對提取溫度A、提取時間B和乙醇體積分數(shù)C的二次多項回歸方程:

Y=3.14+0.24A-0.019B+0.016C-0.040AB-4.500E-3AC+0.021BC-0.32A2-0.57B2-0.22C2

表2 柿果多酚提取工藝優(yōu)化響應面實驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface analysis for persimmon polyphenol extraction process optimization

表3 響應面實驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

注:**為極顯著,p<0.01;*為顯著,p<0.05;-為不顯著,p>0.05。

從表3可知,該回歸模型具有極顯著性(p<0.0001);模型的失擬項p>0.05,決定系數(shù)R2=0.9991,說明該模型擬合結(jié)果良好,可信度高。由各因素p值可知,提取時間(p<0.0001)、提取時間二次項、提取溫度二次項和乙醇體積分數(shù)二次項對柿果多酚提取率都有極顯著影響(p<0.01),提取溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間和提取溫度的交互項對柿果多酚有顯著影響(p<0.05)。對交互項顯著的因素進行分析,得到響應曲面圖和等高線圖(圖5)。從圖5可以看出,A、B的交互作用最為顯著。

圖5 提取時間、溫度、乙醇體積分數(shù)對柿果多酚提取率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of extraction time,temperature and ethanol concentration on persimmon polyphenol extraction rate

根據(jù)響應面分析結(jié)果,得到乙醇浸提法提取柿果多酚的最佳提取參數(shù)為提取時間2.88 h,提取溫度69.70 ℃,乙醇體積分數(shù)75.31%。在此最佳參數(shù)條件下,求得柿果多酚的最佳得率為3.186 mg/100 g鮮果重。

2.4 驗證實驗

為了驗證響應面優(yōu)化所得的結(jié)果是否可靠,根據(jù)優(yōu)化后的提取條件,考慮到實際操作的需要,將優(yōu)化后的提取條件修正為提取時間2.9 h,提取溫度70 ℃,乙醇體積分數(shù)75%。在此條件下重復提取3次,得到柿果多酚的提取率為3.184 mg/100 g鮮果重,RSD值為0.58%,說明所建立的模型是可靠的。

2.5 柿果多酚對CL1-5細胞生長的抑制作用

甜柿果實的多酚主要成分為縮合單寧和沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等化合物,具有抑制腫瘤細胞生長、降血壓、預防動脈粥狀硬化等多種生物活性[19]。從圖6可以看出,在細胞培養(yǎng)液中添加柿果多酚并培養(yǎng)48 h后,CL1-5細胞的半抑制濃度(IC50)值為73.8 μg/mL,對照多西他賽的半抑制濃度為36.7 ng/mL。柿果多酚具有抑制CL1-5細胞增殖的生物活性。

圖6 柿果多酚對CL1-5細胞生長的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of persimmon polyphenol on the growth of CL1-5 cells

3 結(jié)論

在液料比為13∶1 (mL∶g)、提取液中NaHCO3的質(zhì)量濃度為0.15%的條件下,對柿果多酚的提取時間、溫度和乙醇體積分數(shù)進行單因素實驗,根據(jù)單因素實驗結(jié)果,通過響應面優(yōu)化分析和驗證,柿果多酚的最佳提取參數(shù)為:提取時間2.9 h、溫度70 ℃、乙醇體積分數(shù)75%。在此條件下,從100 g甜柿鮮果中提取到了3.184 mg的多酚。本實驗所得回歸方程擬合度良好,預測最佳柿果多酚提取率和驗證實驗結(jié)果基本一致。體外抑制肺癌細胞CL1-5的IC50值為73.8 μg/mL,說明柿果多酚具有一定的抗肺癌細胞增殖的生物活性。

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