雙孢菇廢棄菇柄多糖的 超聲波提取及其體外抗氧化活性

李順峰,趙蒙姣,王安建,田廣瑞,劉麗娜

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450002)

雙孢蘑菇肉質(zhì)肥嫩、風(fēng)味鮮美,是典型的高蛋白低脂肪食材之一,深受消費(fèi)者喜愛。近年來的研究表明,雙孢蘑菇還具有抗氧化的功效,這與其含有的多糖等功能成分密不可分[1]。然而,這些研究都是基于整個(gè)蘑菇或者菇蓋為原料的[1-3]。菇柄作為雙孢蘑菇加工中的廢棄物,約占其總產(chǎn)量的1/10～1/8,直接拋棄既污染環(huán)境又造成資源浪費(fèi)[4-5],前期研究發(fā)現(xiàn),雙孢蘑菇的菇柄與菇蓋的內(nèi)容物含量差別不大[6-8]。

目前,已有研究者針對(duì)葡萄牙東北部地區(qū)盛產(chǎn)的4種野生食用蘑菇的菇蓋和菇柄成分進(jìn)行了比較,表明野生蘑菇菇蓋的抗氧化能力要略高于菇柄,猜測(cè)主要?dú)w因于菇蓋中有機(jī)酸含量較高[9]。然而,菇蓋和菇柄中的多酚和生物堿等成分的含量也有差別[9-10]。因此,僅僅采用有機(jī)酸、多酚和生物堿的含量差別衡量其抗氧化能力的差異是不全面的[3,9-10]。近年來,多糖作為具有抗氧化活性的功能成分,其賦予蘑菇較高抗氧化活性的報(bào)道不斷被發(fā)現(xiàn)[1-2,11-14]。為了提高蘑菇多糖的提取率,相繼有熱水提取[4,11-12]、酶法提取[15-16]、堿液提取[17]、微波輔助提取[18]等方法。已有研究者采用超聲波輔助提取的技術(shù)獲得了較高的雙孢蘑菇多糖得率[1,19]。本文以雙孢蘑菇加工中的廢棄菇柄為原料,采用超聲波提取菇柄中的多糖,并評(píng)價(jià)其抗氧化能力,為開發(fā)和提升雙孢菇加工產(chǎn)業(yè)的附加值提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇菇柄 洛陽奧達(dá)特食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司;葡萄糖、濃硫酸、重蒸酚、無水乙醇、抗壞血酸(VC)、鐵氰化鉀、氯化鐵等 分析純;二苯代苦味?；杂苫?DPPH·) Sigma公司。

HN-1000Y超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海汗諾儀器有限公司;GM-1.0A隔膜真空泵 天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TDL-5A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;VORTEX-5振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;RE-5003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海予華儀器設(shè)備有限公司;UV-1800紫外分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;WT1000KF精密電子天平 常州萬泰天平儀器有限公司;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菇柄多糖的提取 雙孢菇菇柄經(jīng)微波真空干燥(微波功率1000 W、溫度60 ℃、真空度-98 kPa)后粉粹過40目篩,取菇柄粉5.0 g于燒杯中,以蒸餾水為浸提溶劑,經(jīng)超聲波提取后在4 ℃下沉淀多糖,經(jīng)4000 r·min-1離心10 min后,所得沉淀即為菇柄多糖,將其用無水乙醇洗滌3次后用適量蒸餾水溶解,采用苯酚-硫酸法[20]測(cè)定多糖含量并計(jì)算多糖得率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取菇柄粉5.0 g于燒杯中,液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL·g-1),超聲功率560 W,超聲提取時(shí)間30 min下提取1次,2倍乙醇沉淀多糖;在液固比20∶1,超聲功率分別為420、490、560、630、700、770 W,超聲提取時(shí)間30 min下提取1次,2倍乙醇沉淀多糖;在液固比20∶1 (mL·g-1),超聲功率630 W,超聲提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70 min下提取1次,2倍乙醇沉淀多糖;在液固比20∶1 (mL·g-1),超聲功率630 W,超聲提取時(shí)間50 min下提取1次,分別在乙醇用量為1、2、3、4、5倍提取液體積下沉淀多糖;在液固比20∶1,超聲功率630 W,超聲提取時(shí)間50 min下分別提取1、2、3次,4倍乙醇沉淀多糖,考察不同條件對(duì)菇柄多糖得率的影響。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇對(duì)菇柄多糖得率影響較大的超聲功率、超聲提取時(shí)間、液固比進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,以確定較佳的提取條件。正交實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 菇柄多糖抗氧化活性評(píng)價(jià) 依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得最佳提取條件制備菇柄多糖,并將其配制成不同濃度多糖溶液,采用羥自由基(·OH)清除率[14]、DPPH·清除能力和還原能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性[9,21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±SE表示,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA分析(顯著性水平p<0.05),采用Origin 9.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液固比對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響 從圖1可以看出,隨著液固比的增加,菇柄多糖得率顯著升高,并在液固比為20∶1 (mL·g-1)時(shí)多糖得率達(dá)到較高水平(3.49 g·100 g-1);當(dāng)液固比超過20∶1 (mL·g-1)時(shí),繼續(xù)增大料液比,多糖得率升高趨于平緩,可能是由于反應(yīng)體系中水越多,物料與超聲波的接觸機(jī)會(huì)就越多,有利于破壁,從而使糖分更易從細(xì)胞內(nèi)釋放出來[15]。在液固比為50∶1 (mL·g-1)時(shí),其多糖得率(3.63 g·100 g-1)僅比液固比為20∶1 (mL·g-1)時(shí)提高了4個(gè)百分點(diǎn),綜合考慮后續(xù)濃縮成本,選擇20∶1為較佳液固比。

圖1 液固比對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratio of liquid to solid on the yield of polysaccharides from A. bisporus stipe

2.1.2 超聲功率對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響 由圖2可知,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),隨著超聲功率的增大,雙孢菇菇柄多糖得率迅速增加,并在超聲功率為630 W時(shí)達(dá)到較高水平,此時(shí)多糖得率為3.55 g·100 g-1,此后繼續(xù)增大超聲功率,多糖得率增加趨于平緩,且與超聲功率為630 W時(shí)無顯著差異(p>0.05)。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是超聲功率越大,其空化和機(jī)械剪切作用越強(qiáng),分子擴(kuò)散速度也越快,細(xì)胞壁破壞程度越大,得到內(nèi)容物就越多[19]。綜合考慮,選擇超聲功率為630 W作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的較佳條件。

圖2 超聲功率對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides from A. bisporus stipe

2.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響 在超聲提取時(shí)間為10～50 min時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),雙孢菇菇柄多糖得率逐漸增大,并在提取時(shí)間為50 min時(shí),雙孢菇菇柄多糖得率達(dá)到最大值(3.89 g·100 g-1),此后繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,多糖得率又呈下降趨勢(shì)(圖3)。這可能是由于隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng),在50 min左右達(dá)到了平衡,而后繼續(xù)延長(zhǎng)超聲提取時(shí)間,由于超聲波的機(jī)械剪切作用導(dǎo)致部分多糖發(fā)生降解,從而使多糖得率下降[19]。為了提高雙孢菇菇柄多糖得率,縮短提取時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時(shí)間50 min作為較佳時(shí)間。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on the yield of polysaccharides from A. bisporus stipe

2.1.4 醇析乙醇用量對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響 當(dāng)乙醇體積1～4倍于多糖提取液時(shí),隨著乙醇體積的增大,雙孢菇菇柄多糖得率逐漸增大;并在4倍體積時(shí),多糖得率達(dá)到最大(4.35 g·100 g-1),繼續(xù)增大乙醇用量至5倍體積時(shí),多糖得率略有下降(圖4),這可能是由于在乙醇用量為4倍體積時(shí)大部分的多糖已沉淀析出,繼續(xù)增大乙醇用量為5倍體積時(shí)由于乙醇用量較大且醇析時(shí)間較長(zhǎng)而使部分多糖復(fù)溶[22-23]。故宜選擇4倍體積的乙醇用量為最佳的醇析用量。

圖4 醇析乙醇用量對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響Fig.4 Effect of ethanol content on the yield of polysaccharides from A. bisporus stipe

2.1.5 超聲提取次數(shù)對(duì)雙孢菇多糖得率的影響 由表2可知,隨著超聲提取次數(shù)的增加,雙孢菇菇柄多糖得率也逐漸增加,在提取次數(shù)為2次時(shí),多糖得率達(dá)到較高水平,繼續(xù)增加提取次數(shù),多糖得率隨有所增加,但未達(dá)到顯著水平,故考慮提取得率、能耗等,選擇提取次數(shù)2次為宜。

表2 超聲提取次數(shù)對(duì)雙孢菇菇柄多糖得率的影響Table 2 Effect of extraction times on the yield of polysaccharides from A. bisporus stipe

注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

以多糖得率為指標(biāo),對(duì)雙孢菇菇柄多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表3、表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results of orthogonal test

從表3的極差R可看出,各因素對(duì)多糖得率的影響依次為B>A>C,即影響多糖得率的因素依次為超聲提取時(shí)間>超聲功率>液固比,此結(jié)果與表4方差分析結(jié)果相一致。由表3中的k值可以看出,超聲波提取雙孢菇菇柄多糖的最佳工藝組合為A3B2C2,即超聲功率700 W、超聲提取時(shí)間50 min、液固比20∶1。為了驗(yàn)證所得結(jié)論的正確性,在此最優(yōu)條件下測(cè)得雙孢菇菇柄多糖得率為(5.35±0.13) g·100 g-1,高于9號(hào)實(shí)驗(yàn)條件下的雙孢菇菇柄多糖得率,說明通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的超聲波提取條件是可行的。這一結(jié)果與Tian等[1]采用超聲波輔助提取整菇多糖的結(jié)果相差不大,在超聲功率230 W,提取溫度70 ℃,提取時(shí)間62 min和液固比30 g·mL-1的條件下,整菇多糖提取率為6.02%。這一結(jié)果雖然高于本研究的結(jié)果,但是菇柄的多糖得率僅低于整菇約11%,因此,菇柄的多糖含量還是非?？捎^的。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 雙孢菇菇柄多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除效果 由圖5可以看出,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),隨著濃度的升高,雙孢菇菇柄多糖對(duì)·OH清除率呈上升趨勢(shì),在多糖濃度為12 mg·mL-1時(shí)對(duì)·OH的清除率達(dá)89.24%。而VC在0.6 mg·mL-1時(shí)對(duì)·OH的清除率即達(dá)到了99.52%,說明雖然雙孢菇菇柄多糖對(duì)·OH具有一定的清除效果,但仍弱于VC。

圖5 雙孢菇菇柄粗多糖及VC對(duì)·OH的清除效果Fig.5 Scavenging ability on ·OH of VC and the polysaccharides extracted from A.bisporus stipe

圖6 雙孢菇菇柄粗多糖及VC對(duì)DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging ability on DPPH· of VC and the polysaccharides extracted from A.bisporus stipe

2.3.2 雙孢菇菇柄多糖對(duì)DPPH·的清除作用 在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),隨著雙孢菇菇柄多糖和VC濃度的增大,二者對(duì)DPPH·清除率均呈逐漸增大的趨勢(shì)(圖6),這一結(jié)果與Tian等[1]所報(bào)道的雙孢菇多糖對(duì)DPPH·清除效果相似,但清除能力弱于Tian等[1]的結(jié)果,可能是由于雙孢菇品種或其子實(shí)體和菇柄所含多糖組分不一致所造成。雙孢菇菇柄多糖在濃度由0.6 mg·mL-1增加到12 mg·mL-1時(shí),其對(duì)DPPH·清除率增大了45.87%。而VC在0.6～3 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH·清除率迅速升高,達(dá)到26.78%,之后繼續(xù)提高VC濃度至12 mg·mL-1時(shí)對(duì)DPPH·的清除率僅比3 mg·mL-1時(shí)增加了1.5個(gè)百分點(diǎn),僅達(dá)到雙孢菇菇柄多糖在0.6 mg·mL-1時(shí)的清除率。以上結(jié)果說明,雙孢菇菇柄多糖對(duì)DPPH·的清除能力要高于VC。

2.3.3 雙孢菇菇柄多糖的還原能力 樣品的還原能力越強(qiáng),在波長(zhǎng)700 nm測(cè)定的吸光值越大。由圖7可知,在實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的濃度范圍內(nèi),雙孢菇菇柄多糖具有一定的還原能力,且其還原能力與多糖濃度呈正相關(guān),即隨著樣品濃度的增大,還原能力也逐漸增強(qiáng),但其還原能力遠(yuǎn)低于VC。這一結(jié)果與王婭玲等[18]對(duì)菱紅菇多糖的還原能力相類似。

圖7 雙孢菇菇柄粗多糖及VC的還原能力Fig.7 Reducing power of VC and the polysaccharides extracted from A.bisporus stipe

3 結(jié)論

在提取次數(shù)為2次、乙醇用量為4倍體積時(shí),最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率700 W、超聲提取時(shí)間50 min、液固比為20∶1 (mL·g-1),此時(shí)雙孢菇菇柄多糖得率可達(dá)5.35 g·100 g-1。

雙孢菇菇柄多糖對(duì)DPPH·的清除效果較強(qiáng),且其清除能力高于VC;雖然其對(duì)·OH清除率和還原能力低于VC,但仍有一定的作用效果。結(jié)果表明,雙孢菇菇柄多糖具有一定的抗氧化能力,可作為多糖類產(chǎn)品開發(fā)的原料。

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