培養(yǎng)條件和果汁種類 對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

白 淼,張 燦,*,張明露,史 云,王莉莉,戚麗華

(1.中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所,北京 100071;2.北京工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,北京 100048;3.中國(guó)人民解放軍陸軍總醫(yī)院,北京 100700)

脂環(huán)酸芽孢桿菌是造成巴氏滅菌果汁腐敗的重要細(xì)菌之一,具有嗜酸、耐熱、產(chǎn)芽孢等特征。脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢具有很強(qiáng)的抗逆性,常用的果汁滅菌措施如巴氏滅菌難以將其有效滅活。1984年Cerny首次從腐敗果汁中分離出脂環(huán)酸芽孢桿菌[1],此后國(guó)內(nèi)外有關(guān)脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究逐年增多,目前已經(jīng)受到果汁飲品行業(yè)的重點(diǎn)關(guān)注。脂環(huán)酸芽孢桿菌屬于非致病菌[2],但是其具有“煙熏味”和“藥味”的代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚,在極低濃度條件下就會(huì)嚴(yán)重影響果汁風(fēng)味[3]。近年來(lái),多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)生脂環(huán)酸芽孢桿菌引發(fā)的巴氏滅菌果汁腐敗事件。Oteiza報(bào)道阿根廷采集到的果蔬汁樣品中,脂環(huán)酸芽孢桿菌陽(yáng)性樣品檢出率為24%～100%[4]。加納和尼日利亞的225份果汁樣品中,有26份(11.6%)樣品脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性[5]。從脂環(huán)酸芽孢桿菌污染途徑來(lái)看,土壤是其主要來(lái)源,生產(chǎn)果汁所用的原料果表面一旦被污染,在后續(xù)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中難以將其徹底去除,容易引發(fā)果汁腐敗[6]。

表1 培養(yǎng)基成分[8-9]Table 1 Ingredients of different media[8-9]

注:*微量元素溶液:CaCl2·2H2O 0.66 g/L,ZnSO4·7H2O 0.18 g/L,CuSO4·5H2O 0.16 g/L,MnSO4·4H2O 0.15 g/L,CoCl2·6H2O 0.18 g/L,H3BO30.10 g/L,NaMoO4·2H2O 0.30 g/L。

目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有確定脂環(huán)酸芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件也沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)定。此外,脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同種類果汁中的生長(zhǎng)情況和代謝產(chǎn)物的釋放特征也不明確。本文研究pH以及不同種類的培養(yǎng)基和果汁對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響,旨在進(jìn)一步優(yōu)化脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測(cè)方法,為果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的防控和果汁品質(zhì)質(zhì)量的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂環(huán)酸芽孢桿菌 從市售橙汁產(chǎn)品中分離得到,采用通用引物27F/1492R進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列為27F:AGAGTTTGATYMTGGCTCAG;1492R:GGTTACC TTGTTACGACTT[7]，通過(guò)16S rDNA序列分析及BLAST比對(duì),該菌與A.acidocaldariusATCC 43030的相似度達(dá)99%,確定分離菌株屬于Alicyclobacillus屬;菠蘿汁、橙汁、番茄汁、梨汁、蘋果-葡萄汁、蘋果汁、葡萄汁、桃汁和西柚汁 均為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口的市售果汁產(chǎn)品,處于保質(zhì)期內(nèi)的100%純果汁,不含任何防腐劑;Yeast Starch Glucose(YSG)培養(yǎng)基、Bacillusacidoterrestristhermophilic(BAT)培養(yǎng)基、Alicyclobacillusacidoterrestrismedium(AAM)培養(yǎng)基、K氏培養(yǎng)基和SK培養(yǎng)基的成分見(jiàn)表1;馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 購(gòu)買自當(dāng)?shù)卦噭┕?愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)品 純度為99.9%,TRC公司,加拿大;2,6-二溴苯酚標(biāo)準(zhǔn)品 純度為99.9%,SUPELCO公司,美國(guó)。

7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent公司,美國(guó);50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、萃取瓶和固相微萃取裝置 SUPELCO公司,美國(guó);純水儀 Thermo公司,美國(guó);數(shù)顯恒溫磁力攪拌器、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式pH計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、渦旋振蕩器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂環(huán)酸芽孢桿菌計(jì)數(shù) 采用無(wú)菌生理鹽水將待測(cè)菌液按1∶10進(jìn)行梯度稀釋,涂布于BAT固體培養(yǎng)基,置于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后計(jì)數(shù)。

1.2.2 愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚的檢測(cè) 采用固相微萃取(SPME)和氣相色譜(GC)-質(zhì)譜(MS)技術(shù)檢測(cè)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚,具體方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.2.3 pH對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響 將濃度為2.2×103CFU/mL的脂環(huán)酸芽孢桿菌新鮮菌液接種到pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的100 mL BAT液體培養(yǎng)基中,置于45 ℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)2 d后計(jì)數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)基種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響 將濃度為1.7×102CFU/mL的脂環(huán)酸芽孢桿菌新鮮菌液分別接種到100 mL的BAT培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、AAM培養(yǎng)基、K氏培養(yǎng)基、SK培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,根據(jù)1.2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定培養(yǎng)基的pH為4.0,置于45 ℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)2 d后計(jì)數(shù)。

1.2.5 果汁種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響 將濃度為4.5×102CFU/mL的脂環(huán)酸芽孢桿菌新鮮菌液分別接種到100 mL的9種果汁中,分別為菠蘿汁(pH3.5)、橙汁(pH3.7)、番茄汁(pH4.3)、梨汁(pH3.3)、蘋果-葡萄汁(pH3.4)、蘋果汁(pH3.6)、葡萄汁(pH3.1)、桃汁(pH4.0)和西柚汁(pH3.0),置于45 ℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)20 d后,對(duì)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù),并采用SPME-GC-MS檢測(cè)脂環(huán)酸芽孢桿菌代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

圖1為脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同pH(BAT液體培養(yǎng)基)下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明脂環(huán)酸芽孢桿菌具有嗜酸性,在pH4.0時(shí)生長(zhǎng)情況最好,細(xì)菌數(shù)量達(dá)到7.9×104CFU/mL。在強(qiáng)酸性(pH2.5)條件下生長(zhǎng)較差,細(xì)菌數(shù)量為9.5×103CFU/mL,偏中性條件(pH6.0～7.0)下生長(zhǎng)情況最差,細(xì)菌數(shù)量級(jí)僅在102CFU/mL左右。因此,脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的pH應(yīng)該控制在pH3.0～5.0之間,最好是pH4.0左右。脂環(huán)酸芽孢桿菌能夠在pH較低的環(huán)境下生存,可能與其細(xì)胞膜上特有的ω-環(huán)狀脂肪酸有關(guān)[11]。ω-環(huán)狀脂肪酸相當(dāng)于一個(gè)保護(hù)層,能夠幫助它抵抗高溫和酸性的惡劣環(huán)境。袁亞宏等[12]對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其在pH2.0～7.0的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)pH為4.0,這與本文的結(jié)果基本一致。

圖1 不同pH對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of pH on the growth characteristics of Alicyclobacillus

2.2 培養(yǎng)基種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

由圖2可知,培養(yǎng)基種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)影響較大。其中脂環(huán)酸芽孢桿菌在AAM培養(yǎng)基和BAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況最好,K氏培養(yǎng)基、SK培養(yǎng)基和YSG培養(yǎng)基次之,PDB培養(yǎng)基較差,營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基最差。脂環(huán)酸芽孢桿菌在AAM培養(yǎng)基中的數(shù)量達(dá)到3.1×105CFU/mL,在BAT培養(yǎng)基中略少,為1.8×105CFU/mL。脂環(huán)酸芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢(4.2×103CFU/mL),與AAM培養(yǎng)基和BAT培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量相比,相差了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。圖2表明,AAM培養(yǎng)基和BAT培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基相比,更適合用來(lái)培養(yǎng)脂環(huán)酸芽孢桿菌。目前用于培養(yǎng)脂環(huán)酸芽孢桿菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件尚未統(tǒng)一規(guī)定。Goto比較脂環(huán)酸芽孢桿菌在BAT培養(yǎng)基和YSG培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞沒(méi)有任何明顯區(qū)別,但芽孢在YSG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況要明顯強(qiáng)于BAT培養(yǎng)基[13]。Walls報(bào)道脂環(huán)酸芽孢桿菌在K氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況要好于PDA培養(yǎng)基,這與本文的結(jié)果相同[14]。Chang認(rèn)為相對(duì)于K氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基來(lái)說(shuō),SK培養(yǎng)基更適合脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng),效果由好到差依次是SK培養(yǎng)基>PDA培養(yǎng)基>K氏培養(yǎng)基[15]。Baumgart建議使用PDA培養(yǎng)基(pH3.5)培養(yǎng)脂環(huán)酸芽孢桿菌[16]。目前各個(gè)機(jī)構(gòu)組織也給出了不同建議,如美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)(APHA)建議采用K氏培養(yǎng)基[17];日本果汁協(xié)會(huì)(JFJA)建議使用YSG培養(yǎng)基用于該菌的分離[18];國(guó)際果汁生產(chǎn)商聯(lián)合會(huì)(IFU)在2007年對(duì)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行了重新修訂,建議將K氏培養(yǎng)基(pH3.7)與BAT培養(yǎng)基(pH4.0)或YSG培養(yǎng)基(pH3.7)結(jié)合使用[19]。

圖2 培養(yǎng)基種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of media on the growth characteristics of Alicyclobacillus

2.3 果汁種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的影響

圖3表明脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同種類的果汁中生長(zhǎng)差異明顯,在葡萄汁中的生長(zhǎng)情況最好,細(xì)菌數(shù)量為1.5×104CFU/mL;其次是橙汁,細(xì)菌數(shù)量為8.5×103CFU/mL。在番茄汁、蘋果汁、蘋果-葡萄汁、桃汁和梨汁中的生長(zhǎng)情況相近(103CFU/mL)。但是,在菠蘿汁和西柚汁中生長(zhǎng)緩慢,細(xì)菌數(shù)量分別為4.4×102CFU/mL和1.9×102CFU/mL。Spllttstoesser[20]報(bào)道橙汁和梨汁最有利于脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng),其次是蘋果汁、桃汁和白葡萄汁,柚子汁中生長(zhǎng)最慢,這與本文的結(jié)果基本一致。果汁中的主要營(yíng)養(yǎng)成分如礦質(zhì)元素(鉀、鎂和鈣等)、蔗糖以及檸檬酸等會(huì)對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響。不同種類果汁中的各營(yíng)養(yǎng)成分含量有所差別,這很可能是造成脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同果汁中的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯差異的原因之一。

圖3 果汁種類對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響 Fig.3 Effects of different juices on the growth characteristics of Alicyclobacillus

本研究同時(shí)檢測(cè)了果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚,結(jié)果見(jiàn)圖3。在未接種脂環(huán)酸芽孢桿菌的空白對(duì)照組中,9種果汁均未檢測(cè)出愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚。接種脂環(huán)酸芽孢桿菌的9種果汁培養(yǎng)20 d后均未檢測(cè)出2,6-二溴苯酚;除葡萄汁外,其他8種果汁均檢測(cè)出愈創(chuàng)木酚(8.6～23.9 μg/L)。這表明脂環(huán)酸芽孢桿菌污染過(guò)的果汁,愈創(chuàng)木酚可能是影響果汁風(fēng)味更常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物。據(jù)前期報(bào)道[21],在24份市售果汁產(chǎn)品中愈創(chuàng)木酚檢出率為33.3%(8/24),濃度最高可達(dá)26.9 μg/L,而2,6-二溴苯酚檢出率為0%(0/24),這與本文的結(jié)果基本一致。

對(duì)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的數(shù)量和愈創(chuàng)木酚的濃度進(jìn)行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果表明r=-0.496,p=0.175>0.05，相關(guān)性不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此尚不能認(rèn)為二者存在相關(guān)性。如圖3所示,葡萄汁中并未檢測(cè)出愈創(chuàng)木酚,但是細(xì)菌數(shù)量卻高達(dá)1.5×104CFU/mL;菠蘿汁中檢測(cè)出的愈創(chuàng)木酚濃度最高(23.9 μg/L),但是細(xì)菌數(shù)量卻僅有4.4×102CFU/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他幾種果汁。據(jù)報(bào)道,果汁中愈創(chuàng)木酚的釋放量除了與脂環(huán)酸芽孢桿菌初始數(shù)量有關(guān)外,也與培養(yǎng)溫度、熱沖擊條件、果汁類型、頂部可利用空間、氧氣等多種因素相關(guān)[22]。此外,香草醛、香草酸和阿魏酸是微生物代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的前體物質(zhì),它們?cè)诠械暮恳矔?huì)影響愈創(chuàng)木酚的釋放。

3 結(jié)論

脂環(huán)酸芽孢桿菌在pH4.0時(shí)生長(zhǎng)情況最好,7種常見(jiàn)培養(yǎng)基中AAM培養(yǎng)基和BAT培養(yǎng)基更適合用來(lái)培養(yǎng)該細(xì)菌。脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同種類果汁中生長(zhǎng)差異明顯,在葡萄汁和橙汁中的生長(zhǎng)情況最好,菠蘿汁和西柚汁中較差。接種了脂環(huán)酸芽孢桿菌的9種果汁中均未檢測(cè)出2,6-二溴苯酚;除葡萄汁外,其他8種果汁中均檢測(cè)出愈創(chuàng)木酚,濃度范圍在8.6～23.9 μg/L之間。這說(shuō)明脂環(huán)酸芽孢桿菌污染過(guò)的果汁中,較2,6-二溴苯酚而言,愈創(chuàng)木酚檢出率高,因此對(duì)果汁風(fēng)味的影響更大。在今后的研究中,需要進(jìn)一步完善和優(yōu)化脂環(huán)酸芽孢桿菌的培養(yǎng)條件和方法,探索高效準(zhǔn)確的檢測(cè)手段及控制方法,為提高果汁品質(zhì)提供參考。

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