菌酶協(xié)同下的低溫壓榨菜籽粕 抗氧化肽制備工藝研究

葉國棟,潘婉蓮,柯 婉,余海忠

(湖北文理學院化學工程與食品科學學院,湖北襄陽 441053)

我國油菜籽產(chǎn)量居世界首位,每年的制油副產(chǎn)物——菜籽粕多達600～700萬噸,其中含35%～45%的粗蛋白[1],還含有硫甙、單寧、植酸等多種抗營養(yǎng)因子[2],因此,物理、化學、生物學等脫毒方法[3]被用于去除這些有害物質(zhì)。菜籽多肽,則是菜籽粕粗蛋白水解之后的多肽混合物,具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓和促進動物細胞生長等活性,相較粗蛋白它具有更優(yōu)的溶解性、凝膠性、吸水性等加工特性[4],可用于營養(yǎng)飲品、酸性飲料和高蛋白食品的生產(chǎn)。

目前,關(guān)于抗氧化多肽的制備工藝,國內(nèi)外開展了一些研究。Wendee[5]用酶膜反應器連續(xù)生產(chǎn)大豆多肽,由于它能及時分離酶解生產(chǎn)的多肽并且除去了產(chǎn)物反饋干擾,從而使得酶解效率得到提高。雷鳴[6]以FRAP法測定的大豆多肽總抗氧化活性為評價指標,獲得最佳木瓜蛋白酶水解條件:溫度50 ℃,pH7.0,底物濃度5%,加酶量4%,水解時間4 h。武萬興[7]固態(tài)發(fā)酵制備核桃粕多肽,篩選出枯草芽孢桿菌為最佳菌株,且發(fā)現(xiàn)分子量小于5000 Da的多肽抗氧化活性最強。郭濤[8]用中性蛋白酶AS1.398水解菜籽蛋白,確定了溫度45 ℃,pH7.2,酶解時間2 h、加酶量5%的最佳酶解條件,約有75%的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化為可溶性肽。劉大川[9]發(fā)明了一套菜籽粕直接酶水解制備菜籽多肽的工藝,縮短了工藝過程,降低了生產(chǎn)成本。何榮[10]利用枯草芽孢桿菌進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽多肽,獲得最佳工藝條件:葡萄糖濃度0.26%,料液比1∶2.35 (W/V),培養(yǎng)基初始pH6.5,KH2PO4濃度0.26%,發(fā)酵溫度31.2 ℃,接種量3.37×107個/mL,時間100 h。姚曉紅[11]用枯草芽孢桿菌和酶共同發(fā)酵處理菜籽粕,使得多肽含量提高幾倍,且硫甙降解率較高。

盡管已有菌酶協(xié)同制備菜籽多肽的相關(guān)研究,但尚未見以組合菌種與堿性蛋白酶共同作用、液體發(fā)酵制備抗氧化菜籽多肽的報道。為此,本實驗以發(fā)酵菌種組合、菌酶比、接種量、料液比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH、轉(zhuǎn)速等參數(shù)為考察指標,通過單因素實驗與響應面法優(yōu)化,以獲取最優(yōu)的菜籽抗氧化多肽制備工藝,并對最優(yōu)工藝條件下制備的菜籽多肽抗氧化能力進行考察,以期能為菜籽粕的綜合開發(fā)利用、產(chǎn)品附加值的提高提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽粕 干燥、粉碎,過50目篩,密封后置-20 ℃保存待用,湖北奧星糧油工業(yè)有限公司;枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、黑曲霉、米曲霉、堿性蛋白酶(≥20萬U/g) 北京科博匯智生物科技(發(fā)展)有限公司;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0～25.0 g,自來水1000 mL,pH7.4～7.6)、PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂15.0～20.0 g,自來水1000 mL,自然PH)、PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,自來水1000 mL,自然PH) 實驗室自配;無水乙醇、Tris堿、鄰苯三酚、HCl、鐵氰化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、三氯乙酸、醋酸、正丁醇、氨水、NaOH、CuSO4、生育酚等 上海國藥集團公司;TBA、DPPH、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

FZ-102微型植物粉碎機 天津泰斯特設(shè)備公司;YSQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊設(shè)備公司;HZ-9211K恒溫振蕩器 常州恒隆儀器有限公司;DKB-501A超級恒溫水槽 上海精宏儀器公司;UV-2550型可見-紫外分光光度計 日本島津公司;AL204電子分析天平 上海梅特勒公司;Finnpipette可調(diào)式微量移液器 Finnpipette公司;KQ-250DA超聲波清洗機 昆山超聲儀器公司;BCD-208K冰箱 青島海爾公司;GZX-9240MBE鼓風干燥箱 上海博訊設(shè)備公司;SIGMA 3K15低溫冷凍離心機 Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試菌株的活化與酶液的配制 枯草芽孢桿菌劃線轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,37 ℃活化培養(yǎng)12 h;釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉分別劃線轉(zhuǎn)接到PDA斜面上,28 ℃活化培養(yǎng)24 h?；罨蟮木攴謩e用PDB培養(yǎng)基進行150 r/min振蕩培養(yǎng),16 h后對菌液進行無菌分裝,4 ℃保存,待用。此外,稱取一定質(zhì)量的堿性蛋白酶,按2.5%的比例(W/V=g/mL)加入無菌水,配制酶液,待用。

1.2.2 菜籽多肽的制備與含量測定

1.2.2.1 菜籽多肽的制備 稱取一定質(zhì)量的菜籽粕粉碎物,按一定的料液比(W/V=g/mL)加入無菌水,充分振蕩,置121 ℃濕熱滅菌30 min,待其冷卻至室溫后,將等體積混合的組合菌液按一定的菌酶比(V/V=mL/mL)與堿性蛋白酶液混合,得到菌酶混合液。最后,根據(jù)文獻[12],按10%的接種量(V/V=mL/mL)將混合液接種于菜籽粕,設(shè)置一定的pH和發(fā)酵溫度,150 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵一定的時間后取出,4 ℃ 5000 r/min離心20 min,取上清液,即得水溶性菜籽多肽[13]。

1.2.2.2 菜籽多肽含量的測定 參照魯偉等[14]的方法。首先,用5%的三氯乙酸依次配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液,分別取3 mL標準溶液與2 mL的雙縮脲試劑充分混勻,靜置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液于540 nm下測定OD值。以四肽的濃度為橫坐標X,OD值為縱坐標Y,制作標準曲線,得到回歸方程Y=0.372X+0.0164,R2=0.998。然后,將上述制備的上清液全部轉(zhuǎn)進25 mL容量瓶中,并用5%的三氯乙酸定容,搖勻。然后從中取3 mL溶液與2 mL的雙縮脲試劑充分混勻,靜置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液于540 nm下測定OD值,對照標準曲線即可求得菜籽多肽濃度(mg/mL)。

1.2.3 菜籽多肽的抗氧化活性測定 工藝參數(shù)優(yōu)化階段的菜籽多肽抗氧化活性測定,采用鐵氰化鉀還原法[15]:取1 mL樣品溶液與2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)及2.5 mL 1.0%鐵氰化鉀溶液混合,50 ℃保溫20 min,加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻,靜置10 min于700 nm處測吸光值。以吸光值大小表示還原能力大小,測得的吸光值越大,表明菜籽多肽的還原能力也就越強,即它的抗氧化活性就越大。

最優(yōu)發(fā)酵工藝下制備的菜籽多肽抗氧化活性測定,采用以下三種方法:

DPPH法[16]。取3.9 mL DPPH甲醇溶液(25 mg/L)于具塞試管中,與0.1 mL樣品甲醇溶液充分振蕩混合。暗處反應30 min后,在515 nm波長處測定吸光值,空白管用甲醇溶液代替樣品溶液。清除率(%)=[(A0-A)/A0]×l00。其中,A0為空白吸光值,A為樣品吸光值。

抗脂質(zhì)過氧化法[15]?？怪|(zhì)過氧化作用采用卵黃過氧化體系,在具塞試管中加入0.5 mL 10%的卵黃懸浮液和0.1 mL不同濃度樣品溶液,用蒸餾水補至1 mL,再加入1.5 mL 20%的醋酸溶液,1.5 mL 0.8% TBA溶液,振蕩混勻,加塞于95 ℃恒溫水浴中加熱60 min,流水冷卻至室溫,加入5.0 mL正丁醇,振蕩后,3000 r/min離心10 min,取上層清液,以正丁醇為空白管調(diào)零,用紫外分光光度計測定532 nm處的吸光度A1。不加提取物的對照體系吸光度為A0,平行測定5次。按下式計算提取物對卵黃脂蛋白過氧化作用:清除率(%)=(A0-A1)/A0×100。

對獲得的水溶性菜籽多肽分別進行0、10、100、1000倍的梯度稀釋,獲得供試樣品(濃度分別為0.7648、0.07648、0.007648、0.007648 mg/mL)同時,配制相同梯度濃度的生育酚作為陽性對照。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 菌種組合對菜籽多肽的抗氧化性的影響 取等體積的菌液相互混合進行菌種組合,設(shè)置如下:Ⅰ-枯草芽孢桿菌;Ⅱ-釀酒酵母;Ⅲ-黑曲霉;Ⅳ-米曲霉;Ⅴ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母;Ⅵ-枯草芽孢桿菌、黑曲霉;Ⅶ-枯草芽孢桿菌、米曲霉;Ⅷ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉;Ⅸ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉;Ⅹ-枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉;Ⅺ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉。設(shè)置菌酶比為1∶1,在自然pH、料液比為1∶15的條件下,分別接種上述組合菌種,150 r/min振蕩,30 ℃發(fā)酵24 h,測定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.2 菌酶比對菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,分別按1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2的菌酶比,對菜籽粕進行接種,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比為1∶15 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.3 時間對菜籽粕多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比1∶15 (W/V)的條件下,發(fā)酵12、24、28、36、40、48、60、72 h,測定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.4 溫度對菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,分別在溫度27、30、33、36、39 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比為1∶15 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.5 pH對菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,pH為6、7、8、9、10、11,料液比為1∶15 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.6 料液比對菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.5 響應面實驗 本實驗用Design-expert軟件以發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、pH(C)、料液比(D)進行響應面實驗設(shè)計,確定最優(yōu)組合,實驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計的因素水平表Table 1 The level table of factors of Box-Behnken central composite design

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro軟件(版本8.5)對單因素實驗及抗氧化活性測定的數(shù)據(jù)進行分析處理;響應面實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理采用Design-expert軟件(版本8.0.6)進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對菜籽多肽抗氧化能力的影響

2.1.1 菌種組合對菜籽多肽的抗氧化性的影響 不同菌種組合發(fā)酵對制備的菜籽多肽抗氧化活性影響見圖1。從圖1中可以看出,單株菌種發(fā)酵制備的菜籽多肽中,枯草芽孢桿菌和米曲霉的還原能力較強,而釀酒酵母和黑曲霉則很弱。猜測這可能與釀酒酵母、黑曲霉單獨發(fā)酵時代謝產(chǎn)生的蛋白酶水解菜籽粕蛋白程度不夠、產(chǎn)生的肽鏈過長有關(guān)。此外,當使用Ⅹ菌種組合,即枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉,對菜籽粕進行液體發(fā)酵時,制備的菜籽多肽還原能力最強。因此,確定枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為最佳菌種組合。

圖1 不同菌種組合對菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of different strains combination on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.2 菌酶比對菜籽多肽的抗氧化性的影響 按不同體積比混合組合菌種與堿性蛋白酶,接種菜籽粕后進行液體發(fā)酵,考察其對制備的菜籽多肽抗氧化活性的影響。由圖2可知,在設(shè)置的菌酶比范圍內(nèi),菜籽多肽的還原能力呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢,菌酶比為1∶1時抗氧化活性最強。因此,確定最佳菌酶比為1∶1。

圖2 不同菌酶比對菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of different microorganism-enzyme ratio on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.3 發(fā)酵時間對菜籽多肽的抗氧化性的影響 不同發(fā)酵時間對菜籽多肽的抗氧化性的影響見圖3。在設(shè)置的發(fā)酵時間范圍內(nèi),發(fā)酵36 h后菜籽多肽的還原能力最強。因此,選擇最佳發(fā)酵時間為36 h。

圖3 不同發(fā)酵時間對菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.4 發(fā)酵溫度對菜籽多肽的抗氧化性的影響 圖4顯示的是發(fā)酵溫度對菜籽多肽抗氧化性的影響。當發(fā)酵溫度設(shè)置為36 ℃時,菜籽多肽的還原能力最強,因此,確定36 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 不同發(fā)酵溫度對菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.5 pH對菜籽多肽的抗氧化性的影響 pH對菜籽多肽的抗氧化性的影響見圖5。由圖5可知,當pH為7和8時,二者對制備的菜籽多肽的還原能力影響效果差異不大。但考慮到堿性蛋白酶的活性pH范圍,所以選擇8作為最佳pH。

圖5 不同pH對菜籽多肽的抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of different pH on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.6 料液比對菜籽多肽的抗氧化性的影響 菜籽粕粉碎物與無菌水按一定的質(zhì)量體積比進行混合,接入菌酶后進行液體發(fā)酵制備菜籽多肽。圖6顯示了不同的料液比對菜籽多肽抗氧化活性的影響。由圖6可知,當料液比在1∶20時,制備的菜籽多肽還原能力最強。因此,確定1∶20為最佳料液比。

圖6 不同料液比對菜籽多肽的抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of different solid-liquid ratio on antioxidant activity of rapeseed peptides

表2 Box-Behnken中心組合的實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken center composite

表3 響應面試驗的方差分析Table 3 Variance analysis results

注:*:p<0.05,顯著;**:p<0.01,極顯著。

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面法實驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇菜籽多肽抗氧化性最強的因子:溫度(A)、時間(B)、pH(C)、料液比(D)做響應面實驗,分析各種因素間對菜籽多肽抗氧化性強弱的影響,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.2 方差分析 利用軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸比擬,得出菜籽多肽抗氧化活性(吸光值)對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、料液比和pH的二次多項回歸方程為:抗氧化活性(吸光值)=1.00+0.052A+0.068B-0.056C+0.075D+0.058AB-0.012AC-0.073AD-0.014BC+8.500E-003BD-0.011CD+0.060A2-0.071B2-0.040C2+0.048D2。對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果見表3。由表3可以看出,模型p=0.0216<0.05,說明此回歸模型顯著;而失擬誤差p=0.2483>0.05,說明檢驗結(jié)果與模型計算結(jié)果不存在顯著差異；相關(guān)系數(shù)R2=0.912，說明91.2%的實驗數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型解釋，和實際情況擬合程度較好。因此,可用于分析和預測抗氧化菜籽多肽的制備工藝條件研究。

圖7 兩因素間的交互效應分析Fig.7 Surface figure analysis of interaction between two factors

根據(jù)各因素變量的顯著性檢驗,可以看出:D因素、B因素、C因素、A因素的p<0.05,說明料液比、發(fā)酵時間、pH、發(fā)酵溫度對響應值吸光值的影響顯著。其中,料液比對響應值(吸光值)的影響最大,發(fā)酵時間次之,pH則影響更小;而A因素的p>0.05,即發(fā)酵溫度的影響不顯著。各因素對菜籽多肽抗氧化活性影響的主次順序為:D>B>C>A。

2.2.3 兩因素間的交互效應分析 本實驗使用Design-Expert軟件分析因素間的交互效應影響,在保持2個因素均為最優(yōu)條件下,來分析其它2個因素間的交互效應,它們與響應值的關(guān)系用三維空間響應面圖表示,具體見圖7。

圖7a顯示的是發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對菜籽多肽抗氧化活性影響。隨著溫度和時間的增加,菜籽多肽的抗氧化性均逐漸升高,但當它們增加到一定程度時,抗氧化性的增加趨勢平緩。圖7b顯示的是發(fā)酵溫度和pH對菜籽多肽抗氧化活性影響。當固定pH在某一值時,隨著溫度的升高,菜籽多肽抗氧化活性逐漸升高;當固定發(fā)酵溫度在某一值時,隨著pH的升高,菜籽多肽抗氧化活性先增加后減少。圖7c顯示的是發(fā)酵溫度和料液比對菜籽多肽抗氧化活性影響:在發(fā)酵溫度固定在某一值時,隨著料液比的增大,菜籽多肽抗氧化活性逐漸減小;而固定料液比值,抗氧化性隨著發(fā)酵溫度的升高而增強。圖7d顯示的是發(fā)酵時間和pH對菜籽多肽抗氧化活性的影響。當固定發(fā)酵時間在某一定值時,隨著pH的升高,菜籽多肽抗氧化活性逐漸減小;反之,固定pH時,抗氧化活性隨著發(fā)酵時間的延長而增強。圖7e顯示的是發(fā)酵時間和料液比對菜籽多肽抗氧化活性的影響。當固定料液比在某一定值時,隨著時間的延長,菜籽多肽抗氧化活性逐漸升高。圖7f顯示的是pH和料液比對菜籽多肽抗氧化活性的影響。當固定料液比在某一定值時,隨著pH的升高,菜籽多肽抗氧化活性逐漸升高。

2.2.4 響應面最佳條件選擇 利用軟件對菜籽多肽抗氧化活性響應面的分析,得出最佳條件為:用枯草芽孢桿菌、黒曲霉、米曲霉為最佳菌種組合(V/V/V=1∶1∶1),菌酶比1∶1 (V/V),菌酶混合物的接種量為10%(V/V),發(fā)酵溫度為36.13 ℃、發(fā)酵時間為36.43 h、pH為8.32、料液比為1∶20.13 (W/V)。此時,菜籽多肽的抗氧化活性最強,吸光值為1.28。

2.3 驗證實驗

為了驗證預測值是否準確,同時考慮到實際操作的便利,將優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)調(diào)整為:最佳菌種組合為枯草芽孢桿菌、黒曲霉、米曲霉為(V/V/V=1∶1∶1),菌酶比為1∶1 (V/V),接種量為10%(V/V),發(fā)酵溫度為36 ℃,發(fā)酵時間為36 h,pH為8,料液比為1∶20 (W/V),在此條件下進行三次平行實驗,結(jié)果測得的吸光值為1.26,與預測值相差0.02,非常接近。這證明由響應面分析得到的實際值與二次多元回歸模型預測值吻合良好,因此,優(yōu)化后的菜籽多肽制備工藝有較高的可信度和實用價值。

2.4 最優(yōu)工藝條件下制備的菜籽多肽抗氧化性測試

對最優(yōu)工藝下制備的菜籽多肽含量進行測定,結(jié)果為0.7648 mg/mL,梯度稀釋后,分別測定其清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基以及抗脂質(zhì)過氧化能力,其抗氧化活性隨濃度的變化情況見圖8。由圖8可知,不同濃度的菜籽多肽對上述3種作用對象均具有較好的清除活性,在設(shè)置的最高濃度0.7648 mg/mL,對超氧陰離子的清除率達到67.4%(圖8A),對DPPH自由基清除能力達到76.78%(圖8B),抗脂質(zhì)過氧化作用能力達到61.5%(圖8C)。其中,菜籽多肽對DPPH的抗氧化活性最強,超氧陰離子次之,抗脂質(zhì)過氧化能力最低,最高濃度下3種抗氧化活性均低于陽性對照生育酚,但是三者的清除率都超過了60%。上述實驗結(jié)果,進一步印證了本工藝所制備的菜籽多肽具有良好的抗氧化活性。

圖8 不同濃度的菜籽多肽清除自由基活性。Fig.8 Free radicals scavenging activity of different concentrations rapeseed peptides注:A:超氧陰離子;B:DPPH自由基;C:抗脂質(zhì)過氧化。

3 結(jié)論

本實驗采用液態(tài)發(fā)酵方法制備具有抗氧化活性的菜籽多肽,確定枯草芽孢桿菌、黒曲霉、米曲霉為最佳菌種組合(V/V/V=1∶1∶1),菌酶比為1∶1 (V/V),菌酶混合物的接種量為10%(V/V),在此條件下,接

種菜籽粕水溶液,通過響應面實驗,得出最優(yōu)工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度為36 ℃,發(fā)酵時間為36 h,pH為8,料液比為1∶20 (W/V)。此時,菜籽多肽的抗氧化活性(吸光值)達到1.26。通過三次平行實驗驗證,表明采用響應面法優(yōu)化得到的發(fā)酵參數(shù)準確、可靠,具有實用價值。同時,本實驗對最優(yōu)工藝下制備的菜籽多肽的抗氧化活性也進行了測試,在設(shè)定的最大濃度0.7648 mg/mL處,菜籽多肽對超氧陰離子和DPPH自由基的清除率分別達到67.4%和76.78%,抗脂質(zhì)過氧化活性達到61.5%,結(jié)果進一步印證了菜籽多肽具有良好的抗氧化能力。

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