低頻靜電場輻射對釀酒酵母生長代謝的影響

蔡杏華,任浩鋒,蒙永雙,鐘 娟,唐乾玉,黃婧婕,林日輝,,3,*

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,生物轉(zhuǎn)化與過程反應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530006;3.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣西南寧 530006)

低頻靜電場(LFEF)是指頻率在0～300 Hz之間的靜電場,主要由家用電器、輸電線路和電子設(shè)備等產(chǎn)生,是日常生活中接觸最多的一類低頻靜電場[1]。自1980年Miller等[2]發(fā)現(xiàn)低頻靜電場的感應(yīng)強(qiáng)度與兒童的癌癥發(fā)病率有關(guān)后,電場輻射導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)受到了廣泛的關(guān)注,此后低頻靜電場在2002年被國際癌癥研究所列為可疑致癌物之一[3]。

目前對于低頻靜電場的研究已從簡單的流行病學(xué)調(diào)查轉(zhuǎn)向了細(xì)胞和分子水平。Ghodbane S[4]和Amara S等[5]的研究發(fā)現(xiàn)低頻電場輻射可改變小鼠大腦中谷胱甘肽水平并影響著超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶的活性,同時引起一定程度的基因損傷。李思思等[6]研究發(fā)現(xiàn),低頻靜電場輻射可降低果蠅的生殖能力和壽命,影響子代性別決定。但也有研究發(fā)現(xiàn),低頻靜電場輻射對單核巨噬細(xì)胞(THP-1)內(nèi)活性氧水平并沒有顯著影響,也沒有檢測到DNA損傷的發(fā)生[7]。

迄今為止,電場輻射作用引起的生物學(xué)效應(yīng)尚缺乏令人信服的依據(jù),其作用機(jī)理和量效關(guān)系仍缺乏系統(tǒng)的研究,因此,繼續(xù)深入研究低頻電場輻射對細(xì)胞的影響機(jī)制,對低頻靜電場輻射的風(fēng)險評估與開發(fā)應(yīng)用有著十分重要的意義。

為了進(jìn)一步研究低頻靜電場輻射對細(xì)胞本身以及胞內(nèi)外代謝的影響,本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母為實(shí)驗(yàn)對象,采用低頻靜電場對其進(jìn)行輻射處理,通過掃描電鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、分光光度計等手段對細(xì)胞的形狀、生長趨勢、葡萄糖代謝速率、胞內(nèi)外蛋白的表達(dá)量以及胞內(nèi)酶的活性進(jìn)行測定分析,對比輻射生長與自然生長的差異,為低頻靜電場輻射導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng),以及低頻靜電場在實(shí)際生活中的應(yīng)用提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

釀酒酵母 河北馬利食品;YEPD培養(yǎng)基(1%酵母粉,2%葡萄糖,2%蛋白胨) 北京索萊寶;M5酵母蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京聚合美;乙醇脫氫酶(ADH)、牛血清蛋白biosharp、β-NAD 上海楷洋;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)AR級。

電場發(fā)生裝置 DENBA-08,功率為3.3 W,頻率為60 Hz,電場強(qiáng)度為2.5 mV/m,有效輻射范圍8 m3，日本株式會社;BD Accuri C6型流式細(xì)胞儀 BD公司;SUPRA 55 Sapphire型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司;TU-1901型紫外分光光度計 北京普析儀器;HZ250LBG型恒溫?fù)u床 武漢瑞華儀器;L400型高速冷凍離心機(jī) 日本日立;EPS301型電泳系統(tǒng) Amershan Biosciences;GI54D型高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器;BS-1101酶標(biāo)儀 南京德鐵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母的形態(tài)觀察 在YEPD培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉制成固體培養(yǎng)基,然后涂布接種釀酒酵母,隨機(jī)將培養(yǎng)皿分成兩組,輻射組靜置于輻射板上進(jìn)行持續(xù)輻射生長(如圖1a所示),自然組則放置于桌面進(jìn)行自然生長(如圖1b所示),平板培養(yǎng)72 h(可觀察到明顯的釀酒酵母菌落),挑取適量菌落,無菌水沖洗,取50 μL菌液滴于載玻片上,加入等體積的美藍(lán)染液進(jìn)行染色30 min,制成玻片,在熒光拍照顯微鏡下觀察其形態(tài)。

挑取上述培養(yǎng)平板的菌體適量,制成電鏡觀察樣品,不經(jīng)過任何化學(xué)處理,然后采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡對菌體的表面形態(tài)進(jìn)行觀察和對比。

圖1 釀酒酵母的生長環(huán)境Fig.1 The growth environment of S. cerevisiae注:a、c:輻射生長;b、d:自然生長。

1.2.2 釀酒酵母的生長趨勢對比 釀酒酵母的發(fā)酵培養(yǎng)選用YEPD液體培養(yǎng)基,在250 mL的三角瓶中,裝液量為100 mL,接種量為2%。將釀酒酵母隨機(jī)分成兩組(每組3個平行),一組進(jìn)行靜置持續(xù)輻射生長,另一組自然靜置生長(輻射處理環(huán)境如圖1c、d所示),培養(yǎng)溫度控制在24～26 ℃之間,每隔2 h取樣并采用比濁法[8]測定OD600 nm,以橫坐標(biāo)為時間,縱坐標(biāo)為吸光值,繪制釀酒酵母的生長曲線,并計算各自的比生長速率。

比生長速率的計算式為:

式中,μ:比生長速率;n:經(jīng)過時間t后增加的世代數(shù);N0:開始時培養(yǎng)液OD600 nm值;Nt:經(jīng)過時間t后培養(yǎng)液的OD600 nm值;Tt與T0分別代表t時刻的時間和初始時間。

1.2.3 流式細(xì)胞儀對釀酒酵母的檢測分析 以YEPD液體培養(yǎng)基對釀酒酵母進(jìn)行培養(yǎng),每隔4 h取1 mL培養(yǎng)液用無菌水稀釋,隨后用尼龍網(wǎng)(孔徑為33 μm)濾去大顆粒物質(zhì),然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析和計數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用BD Accuri C6軟件進(jìn)行分析。其原理為:將細(xì)胞顆粒列隊通過激光檢測,由光信號轉(zhuǎn)化為電脈沖信號,接著轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號,因此可檢測出細(xì)胞的大小和數(shù)量[9]。

1.3 葡萄糖的代謝分析

采用DNS法[10]測定葡萄糖的濃度,每隔4 h取樣1 mL,采用0.22 μm的微孔濾膜濾去菌體和不溶物,樣品經(jīng)無菌水稀釋50倍,然后按照1∶1的體積之比與DNS試劑充分混勻,100 ℃水浴加熱5 min,冷卻至室溫后,在540 nm波長下檢測。葡萄糖的濃度計算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.456x-0.3676(R2=0.9995),其中y為540 nm下的吸光值,x表示葡萄糖的濃度。

1.4 蛋白質(zhì)分析

1.4.1 胞內(nèi)可溶性蛋白的提取與濃度測定 可溶性蛋白的提取按照M5酵母蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行。釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)16 h后(對數(shù)生長期末期),經(jīng)過冷凍離心收集菌體(8000 r/min,20 min,4 ℃)。將菌體按照0.5 g濕重加入2 mL蛋白抽提液(試劑盒成分之一),采用漩渦振蕩器(1000 r/min,4 ℃)進(jìn)行振蕩抽提30 min,然后在14000 r/min,4 ℃條件下離心收集上清液即為粗蛋白液[11]。蛋白濃度的測定采用Bradford法[12],利用BCA蛋白濃度測定試劑盒,在96微孔板中制備樣品,通過酶標(biāo)儀進(jìn)行快速檢測。

1.4.2 蛋白質(zhì)的電泳分析 將上述粗蛋白液統(tǒng)一稀釋至相同濃度(2 mg/mL),通過SDS-PAGE電泳[13]分析,分離膠濃度為12%(分離范圍12～150 kDa),上樣量為10 μL,電泳的結(jié)果采用凝膠成像儀進(jìn)行拍照和分析。

1.4.3 胞內(nèi)乙醇脫氫酶(ADH)的活性分析 乙醇脫氫酶(ADH)的活性測定參考文獻(xiàn)方法[14],在1 mL的反應(yīng)體系中,加入0.7 mL濃度為50 mmol/L、pH=8.8的Tris-HCl緩沖液,0.1 mL乙醇(1 mol/L),0.1 mLβ-NAD(0.2 mol/L),最后加入0.1 mL的粗蛋白液(培養(yǎng)16 h后提取)充分混勻,采用紫外分光光度計在340 nm波長下迅速進(jìn)行時間掃描,分別記錄30、60、90、120 s的吸光值,并計算單位時間內(nèi)的吸光值變化量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0999x+0.0045(R2=0.9999)計算乙醇脫氫酶(ADH)的活性。式中y為酶在單位時間內(nèi)的吸光值變化量,x為酶的活力(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察

圖2 釀酒酵母的光學(xué)顯微鏡觀察(1000×)Fig.2 Optical microscopic observation of S. cerevisiae(1000×)注:a：自然生長;b：輻射生長。

光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果如圖2所示,酵母細(xì)胞的形態(tài)、大小從整體來看并無顯著差異,但經(jīng)過輻射處理的釀酒酵母在顯微鏡下可觀察到染色程度更深,菌體更為密集。此外,通過圖3的掃描電鏡觀察結(jié)果可知,經(jīng)過輻射生長的釀酒酵母出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凹陷,而自然生長的釀酒酵母仍然呈現(xiàn)表面光滑,無明顯形狀變異或畸形的現(xiàn)象,且經(jīng)過輻射生長的釀酒酵母芽體數(shù)量明顯較多,這表明輻射生長的釀酒酵母出芽生殖頻繁,這與生長趨勢中所呈現(xiàn)的結(jié)果一致。所以推測認(rèn)為,低頻靜電場的輻射作用一定程度上改變了細(xì)胞原有的代謝水平,加快了其生長代謝過程,使胞內(nèi)外的物質(zhì)交流加快,導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性加大,細(xì)胞壁的保護(hù)功能相對變得脆弱,因此容易受到電場的輻射作用影響，致使細(xì)胞凹陷甚至被擊穿[15]。

圖3 釀酒酵母的電鏡圖(5000×)Fig.3 Electron microscopy of S.cerevisiae(5000×)注:a：自然生長;b：輻射生長。

2.2 生長趨勢

如圖4所示,靜電場輻射生長的釀酒酵母自2 h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期,而自然生長的釀酒酵母則在4 h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期。比較對數(shù)生長期兩者的比生長速率可知,輻射生長的最大比生長速率為0.276,自然生長的最大比生長速率為0.241,前者比后者提高了14.5%。這說明低頻靜電場輻射對釀酒酵母的生長過程具有顯著的促進(jìn)效應(yīng)(p<0.05)。

圖4 釀酒酵母的生長曲線Fig.4 Growth curve of S. cerevisiae

2.3 流式細(xì)胞儀分析

流式細(xì)胞儀對釀酒酵母細(xì)胞生長過程的檢測結(jié)果如圖5所示。當(dāng)時間為4 h時,兩種條件下生長的釀酒酵母在菌體數(shù)量和大小上無明顯差異。當(dāng)時間達(dá)到8 h時,經(jīng)過輻射生長的釀酒酵母最先出現(xiàn)了“二次峰”,這表明輻射生長的釀酒酵母已經(jīng)開始大量進(jìn)行出芽生殖,產(chǎn)生了芽體,而此時自然生長的釀酒酵母卻無明顯變化,直到16 h時自然生長的釀酒酵母才出現(xiàn)“二次峰”。這說明低頻靜電場輻射明顯促進(jìn)了釀酒酵母的生長、繁殖速度,這與生長曲線的結(jié)果一致。

圖5 釀酒酵母的流式細(xì)胞儀分析Fig.5 Flow cytometry analysis of S. cerevisiae注:a:自然生長,b:輻射生長；橫坐標(biāo)代表細(xì)胞大小的分布情況，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量。

2.4 葡萄糖消耗速率對比

釀酒酵母對葡萄糖的消耗曲線如圖6所示,兩種條件下生長的釀酒酵母在時間達(dá)到36 h時,葡萄糖的剩余量均已逐漸耗盡,然而在時間為4～24 h之間,輻射生長的釀酒酵母對葡萄糖的消耗速率更快,在16 h時比自然生長提高了15.64%，這與釀酒酵母生長曲線中所表現(xiàn)的結(jié)果一致,由此可知,低頻靜電場輻射可以顯著加快釀酒酵母的生長、代謝速率,對其生長代謝表現(xiàn)出了正向的促進(jìn)效應(yīng),這與林康偉等[1]的研究結(jié)果相類似。

圖6 葡萄糖的消耗曲線Fig.6 Consumption curve of dextrose

2.5 蛋白質(zhì)的分析結(jié)果

采用Bradford法經(jīng)過酶標(biāo)儀快速檢測得到自然生長的釀酒酵母胞內(nèi)可溶性蛋白濃度為(10.71±0.017) mg/mL,輻射生長測得的胞內(nèi)可溶性蛋白濃度為(10.52±0.005) mg/mL,由此可知,兩者的胞內(nèi)可溶性蛋白總量相差很小(1.81%),低頻靜電場的輻射作用對其胞內(nèi)總可溶性蛋白的表達(dá)量沒有顯著影響(p>0.05)。

然而,從圖7的電泳分析結(jié)果可知,兩種條件生長的釀酒酵母盡管從電泳條帶的整體分布來看十分相似,但分子量在12～20、20～30、50～80 kDa之間時，兩種條件下的電泳條帶分布存在一定差異(如圖7所圈出位置)。這些結(jié)果表明,經(jīng)過低頻靜電場輻射的釀酒酵母,其胞內(nèi)可溶性蛋白的種類可能發(fā)生了一定的變化,這可能是由于低頻靜電場的持續(xù)輻射作用,影響了釀酒酵母蛋白質(zhì)的正常調(diào)控與表達(dá)[16]。

圖7 胞內(nèi)可溶性蛋白的電泳分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of the intracellular soluble protein注:M:標(biāo)準(zhǔn)品;1、2:輻射生長;3、4:自然生長。

2.6 胞內(nèi)乙醇脫氫酶(ADH)的活性分析

對釀酒酵母胞內(nèi)乙醇脫氫酶(ADH)的活性進(jìn)行測定分析的結(jié)果表明,自然生長條件下測得胞內(nèi)乙醇脫氫酶比活力為9.66 U/mg,輻射生長時測得胞內(nèi)乙醇脫氫酶比活力為10.36 U/mg,后者相比自然生長提高了7.25%。這說明低頻靜電場輻射對釀酒酵母胞內(nèi)酶的活性或酶的合成具有一定的促進(jìn)作用。這與楊生等[17]采用電場輻射對檸條種子的萌發(fā)和胞內(nèi)酶活性研究結(jié)果相類似。

3 結(jié)論

由掃描電子顯微鏡所觀察到的結(jié)果可知,低頻靜電場輻射可使釀酒酵母的細(xì)胞表面發(fā)生不同程度的凹陷現(xiàn)象。此外,低頻靜電場輻射還可以促進(jìn)釀酒酵母的生長和葡萄糖代謝速率,對其生長和代謝過程具有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。

蛋白質(zhì)電泳分析的結(jié)果表明,輻射生長與自然生長條件提取的可溶性蛋白,在分子量為12～20、20～30、50～80 kDa之間時,兩種條件下的電泳條帶分布存在一定差異,這表明低頻靜電場輻射可影響釀酒酵母胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的合成或表達(dá)。此外,低頻靜電場對釀酒酵母胞內(nèi)乙醇脫氫酶的活性或合成量具有一定的促進(jìn)作用。

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