晚熟桃采后褐腐病致病菌的分離鑒定 及拮抗菌對(duì)其防治效果的研究

張 娜,鄭香香,于晉澤,閻瑞香,關(guān)文強(qiáng),*

(1.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心,天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300384;2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué),生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134)

映霜紅桃(Prunuspersica(L.)Batsch)原名冬雪王桃,是晚熟桃中具有代表性的品種之一,具有晚熟、耐貯藏、個(gè)大、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)等特點(diǎn)[1]。但在采后貯藏過程中易受到褐腐病的侵害,導(dǎo)致桃果實(shí)軟化腐爛,褐腐病是危害晚熟桃果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一。褐腐病又名菌核病,是由核盤菌屬(Sclerotinia)、鏈核盤菌屬(Monilinia)、絲核屬(Rhizoctonia)和小菌核屬(Sclerotium)等真菌引起的,多在桃、杏、李、櫻桃、梅等核果類果樹上發(fā)作[2],可危害花、葉及枝梢,但主要危害果實(shí),具有潛伏感染性;受潛伏侵染的果實(shí)可以不表現(xiàn)癥狀,也可以在表面出現(xiàn)暗色或褐色的小瘢痕,部分受潛伏侵染的果實(shí)在開始成熟時(shí)會(huì)腐爛[3],或者在果實(shí)采后運(yùn)輸、存儲(chǔ)期間由于環(huán)境溫度波動(dòng)、機(jī)械損傷等原因?qū)е虏『Φ陌l(fā)生,果實(shí)大面積腐爛。不同地區(qū)、不同果園導(dǎo)致病害發(fā)生的病原菌并不一致,因此有必要對(duì)已經(jīng)發(fā)生病害果園的致病微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的病原菌分離鑒定,以利于控制病原菌的危害。

目前關(guān)于晚熟桃褐腐病的病原菌鑒定、病害發(fā)生流行規(guī)律及防治措施等均未見報(bào)道,為病害的防治帶來了較大的困難,該病害已經(jīng)成為制約晚熟桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙。晚熟桃果實(shí)一旦發(fā)生褐腐病往往在冷庫(kù)貯藏期間腐爛率就能達(dá)到15%,而出庫(kù)后由于溫度升高,5 d內(nèi)平均腐爛率就高達(dá)60%。目前真菌病害的控制主要通過使用殺真菌劑(如苯菌靈、異菌脲等)來控制采后病害的發(fā)生,減少果實(shí)的腐爛和延長(zhǎng)貯藏期[4]。然而,消費(fèi)者越來越關(guān)注化學(xué)殘留物帶來的健康問題,以及殺菌劑的濫用造成許多真菌對(duì)常用殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性,因此,綠色安全的生物防治作為一種有效的替代方案受到越來越多的關(guān)注。大量的研究表明,芽孢桿菌能夠較好的控制采后水果的多種疫病,如蘋果霉心病[5]、柑橘青霉病[6]、香蕉炭疽病[7]、蘋果梨青霉病、黑斑病[8],金花梨果腐病[9]等,但對(duì)于晚熟桃的采后褐腐病的研究相對(duì)較少,因此研究利用芽孢桿菌來控制褐腐病對(duì)晚熟桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本文針對(duì)“映霜紅”晚熟桃褐腐病的發(fā)生,采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類法和18S-rDNA分子生物學(xué)方法對(duì)晚熟桃褐腐病的病原菌進(jìn)行分離鑒定,并利用篩選出的四種對(duì)采后蒜薹灰霉病具有顯著抑制效果[10]的芽孢桿菌(HB-2、B001、B579、B1)，采用有傷接種法在不同時(shí)間段對(duì)晚熟桃褐腐病進(jìn)行預(yù)防,以期為晚熟桃褐腐病的采后生物防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐,促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晚熟桃 品種“映霜紅”,采收后立即運(yùn)往國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)實(shí)驗(yàn)庫(kù)中,采用0.03 mm PE保鮮袋包裝,采摘于山東省濟(jì)寧京信農(nóng)產(chǎn)品專業(yè)合作社聯(lián)合社;拮抗芽孢桿菌:菌種HB-2(Bacillusamyloliquefaciens)、B001(Bacillussubtilis)、B579(Bacillussubtilis) 天津市植物保護(hù)研究所;芽孢桿菌B1(Bacillusamyloliquefaciens) 本實(shí)驗(yàn)室保存菌種;肉汁胨培養(yǎng)基(NA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;SK8259真菌提取試劑盒、NS1、NS6 生工生物工程(上海)有限公司;無水乙醇、生理鹽水、打孔器(直徑6 mm)、干燥器 天津市江天統(tǒng)一科技有限公司。

SW-CJ.1BV微生物操作臺(tái) 上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;BX51顯微鏡 OLYMPUS;SPX-250-C智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海瑯宣實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DYY-5穩(wěn)壓電泳儀 北京六一儀器廠;3730XL測(cè)序儀 Applied Biosystem,2720 thermal cycler PCR儀 Applied Biosyetems;FR980凝膠成像儀 上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桃果實(shí)褐腐病病原菌的分離純化 參考文獻(xiàn)[11]分離甜櫻桃致病菌的方法,將晚熟桃放在恒溫高濕條件下(20 ℃,95% RH)加快其發(fā)病。用接種針直接挑取桃果實(shí)表面菌絲(分生孢子堆),將其接種到PDA培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(26 ℃)。依據(jù)常規(guī)組織分離法獲得感病組織,即從發(fā)病果實(shí)的病健交界處果肉組織進(jìn)行分離,切取距果實(shí)病斑5 mm處的組織,依次采用70%的乙醇、1.0%的次氯酸鈉浸泡30 s,再用滅菌水清洗3次,濾紙吸干,植入PDA培養(yǎng)基中,26 ℃下培養(yǎng)。當(dāng)上述菌落直徑生長(zhǎng)至1 cm時(shí),用接種針挑取菌絲尖端植入另一PDA培養(yǎng)基中。重復(fù)上述操作2～3次即可作為純化菌種轉(zhuǎn)入凍存管中,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察及初步鑒定 將病原菌移接于PDA平板上,26 ℃條件下,12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)。記錄菌落形態(tài)特征,并測(cè)量其大小。在光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)病原菌的分生孢子和分生孢子梗形態(tài)。并根據(jù)病原菌的產(chǎn)孢特征及其在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征,參照《真菌鑒定手冊(cè)》[12]、《真菌分類學(xué)》[13]方法進(jìn)行病原菌鑒定。

1.2.3 病原菌致病性的測(cè)定 將已經(jīng)純化后的病原菌菌餅(直徑6 mm)回接晚熟桃果實(shí)表面和果蒂處,分別采用有傷和無傷兩種方式接種病原菌,通過觀察病斑發(fā)展速度和發(fā)病程度,判斷菌種致病能力。有傷接種采用接種針在桃果實(shí)的兩側(cè)各集中刺破5個(gè)孔(傷口直徑約5 mm),傷口處接種病原菌菌餅;無傷接種時(shí)直接將病原菌菌餅接種在桃果實(shí)表面。每個(gè)處理10個(gè)果實(shí),置于干燥器中,室溫下培養(yǎng)(18～25 ℃)。記錄病斑發(fā)病個(gè)數(shù)和直徑,并計(jì)算發(fā)病率,發(fā)病率(%)=(接種菌餅總個(gè)數(shù)-未發(fā)病個(gè)數(shù))/接種菌餅總個(gè)數(shù)×100。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1 基因組DNA提取 從已經(jīng)純化好的培養(yǎng)基上直接刮取菌絲放入1.5 mL滅菌離心管中,按照SK8259(真菌)試劑盒的操作步驟進(jìn)行基因組DNA的提取,利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA。提取的DNA定量后稀釋,作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.4.2 PCR擴(kuò)增 采用真菌通用引物NS1和NS6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系包括NS1和NS6引物各0.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1 μL,模板DNA溶液0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,酶0.2 μL,超純水19.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,在1.0%瓊脂糖凝膠上(150 V、100 mA)電泳20 min,用凝膠成像儀進(jìn)行拍照。PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶,PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測(cè)序。

1.2.4.3 序列比對(duì) 將測(cè)定的基因序列運(yùn)用GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST 工具軟件,在DNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源DNA 序列并進(jìn)行比較分析,根據(jù)BLAST 搜索和比較的結(jié)果,判斷所獲菌株的種類或其近緣的物種。

1.2.5 四種芽孢桿菌對(duì)病原菌的體內(nèi)抑制 用70%乙醇對(duì)晚熟桃表面進(jìn)行消毒,無菌水沖洗,自然干燥。分別在桃果實(shí)陽(yáng)面、陰面用無菌牙簽刺破傷口,每個(gè)傷口直徑3～4 mm,深2～3 mm,用滅菌濾紙將傷口處的多余的果實(shí)汁液吸干,然后滴加30 μL拮抗菌發(fā)酵液(2.5×109cfu/mL),對(duì)照組滴加無菌水。分別于第0、1、2 d在已加完拮抗菌發(fā)酵液的傷口處接種病原菌菌餅(由打孔器獲得的菌餅直徑即為接種量，26 ℃培養(yǎng)3 d;直徑6 mm),同期以加完無菌水的傷口接種病原菌菌餅做對(duì)照。處理后的桃果實(shí)置于15 ℃下貯藏。分別在接種病原菌3、6 d后用游標(biāo)卡尺測(cè)量病斑的橫徑和縱徑,按照橢圓形的面積公式計(jì)算病斑面積,并計(jì)算抑制率。病斑抑制率(%)=(S對(duì)照組-S處理組)/S對(duì)照組×100。每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù),每個(gè)重復(fù)有15個(gè)桃。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定 分別在接種病原菌6 d后測(cè)量晚熟桃部分營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo),取樣時(shí),避開傷口部位。硬度采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定,對(duì)桃果實(shí)沿果實(shí)縫合線兩側(cè)果面帶皮穿刺,探頭直徑為2 mm,探頭下壓距離為10 mm,測(cè)試速度為2 mm/s;可溶性固形物含量采用手持糖度計(jì)測(cè)定;可滴定酸含量采用國(guó)標(biāo)GB/T1245690的NaOH滴定法測(cè)定;維生素C含量采用碘量法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel 2003軟件處理并繪圖,SPSS Statistics 17.0軟件采用Duncan多重比較用于數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果實(shí)褐腐病病原菌的形態(tài)學(xué)觀察及初步鑒定

桃果實(shí)褐腐病在發(fā)病初期,果實(shí)表面產(chǎn)生小的水浸狀褐色圓形病斑,病斑部果肉變褐腐爛,恒溫高濕條件下(20 ℃,95% RH)病斑擴(kuò)散迅速,數(shù)日內(nèi)病斑即可蔓延擴(kuò)展至全果,使果肉褐變軟腐,隨后病部表面產(chǎn)生灰白色絨狀霉叢(分生孢子梗和分生孢子)。采用接種針直接挑取桃果實(shí)表面菌絲分離得到的病原菌與通過常規(guī)組織分離法得到的病原菌是同一種病原菌。該病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度很快,一般5 d菌落就可以布滿整個(gè)培養(yǎng)皿。菌落產(chǎn)孢豐富,菌落初期為灰白色,生長(zhǎng)后期形成白色絨球狀物,氣生菌絲發(fā)達(dá)。但是在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),該病原菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)特征不穩(wěn)定,如圖1a和圖1b所示,在完全一樣的培養(yǎng)條件下,有的菌落邊緣不平整,淺裂狀,有的菌落則邊緣平整,質(zhì)地均勻;有的菌落同心輪紋較明顯,有的菌落同心輪紋則不明顯。在顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)如圖1c、圖1d所示,分生孢子梗叢生,性孢子串生,球形,直徑3～4 μm。這與魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》和邵力平的《真菌分類學(xué)》中關(guān)于真菌界子囊菌門(Ascomycota)柔膜菌目(Helotiales)核盤菌科(Sclerotiniaceae)核盤菌屬(Sclerotinia)的描述相似。

圖1 病原菌在PDA上的生長(zhǎng)形態(tài) 和顯微鏡下菌絲及孢子形態(tài)Fig.1 The growth-morphology and micro-morphology of pathogenic bacteria

2.2 病原菌致病性的測(cè)定

取分離純化后的病原菌菌餅接種到表面經(jīng)過消毒的桃果實(shí)上,20 ℃條件下培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)桃果實(shí)接種處2 d即會(huì)發(fā)病,開始時(shí)傷口接種處形成淺褐色病斑,病斑處果肉變軟,沿傷口處凹陷發(fā)黃,表面有少量菌絲生長(zhǎng),5 d時(shí),約有1/2的果面變褐、發(fā)軟,并長(zhǎng)有灰白色絨狀菌絲。該癥狀與桃褐腐病的自然發(fā)病癥狀一致,通過對(duì)發(fā)病率和病斑直徑的調(diào)查表明,該病原菌具有較強(qiáng)的致病性,在20 ℃條件下,5 d時(shí)病斑直徑擴(kuò)展6.05～10.69 cm,并且無論在果面還是果蒂有傷接種發(fā)病率均為100%,無傷接種果面的發(fā)病率高于果蒂發(fā)病率。整體來說,有傷接種致病性高于無傷接種。

2.3 貯藏期病原菌的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增 褐腐病病原菌菌株的DNA提取采用SK8259(真菌)試劑盒操作,通過瓊脂糖凝膠電泳分析,試劑盒提取的樣品菌株的基因組DNA條帶清晰,可以用于下一步的PCR。以NS1、NS6為引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,得到的產(chǎn)物條帶特異性好,擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約為1300～1500 bp之間(圖2)。

表1 病原菌擴(kuò)增序列結(jié)果對(duì)比表Table 1 The contrast table of pathogen amplification sequences

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoregram of PCR products

圖3 拮抗菌B001、B1、B579、HB-2對(duì)桃褐腐病的預(yù)防效果Fig.3 The prevention effect of antagonistic Bacillus B001,B1,B579,HB-2 on peach brown rot注：不同小寫字母表示同一貯藏天數(shù)下，不同組間差異顯著(p<0.05)。

2.3.2 rDNA-ITS序列測(cè)定與比對(duì) 將擴(kuò)增得到的褐腐病病原菌菌株的ITS PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和測(cè)序,得到的序列與GenBank上的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。具體結(jié)果如表1所示,通過將該病原菌的ITS序列與GenBank中已有的相關(guān)菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比較,表明該病原菌序列分別與核盤菌(CP017820.1)和核盤菌D2(KT454401.1)的同源性均達(dá)到99%,也就是說晚熟桃上分離的褐腐病病原菌屬于真菌界子囊菌門(Ascomycota),柔膜菌目(Helotiales),核盤菌科(Sclerotiniaceae),核盤菌屬(Sclerotinia)。

2.4 四種芽孢桿菌不同時(shí)間預(yù)防處理對(duì)褐腐病病原菌的體內(nèi)抑制作用

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在,其營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快,能忍受極端的外部環(huán)境而長(zhǎng)期存活,是一種理想的生防微生物[14-15],并且在水稻[16]、小麥[17]、黃瓜[18]、辣椒[19]等農(nóng)作物的采前病害的防治上顯現(xiàn)出很好的效果。本文中分離得到的晚熟桃褐腐病病原菌的致病性很強(qiáng),常溫下5～7 d就能夠造成果實(shí)大部分腐爛,因此本文采用四種芽孢桿菌對(duì)其進(jìn)行生物防治,以期為晚熟桃采前采后病害防治提供技術(shù)支撐。

桃果實(shí)接種褐腐病病原菌之后,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),病斑逐漸增大。使用四種芽孢桿菌對(duì)其進(jìn)行預(yù)防實(shí)驗(yàn)時(shí),大部分處理均能夠抑制褐腐病病斑擴(kuò)展,具體結(jié)果如圖3所示。貯藏3 d時(shí),拮抗菌B001提前預(yù)防天數(shù)對(duì)褐腐病病斑擴(kuò)展的抑制率具有顯著性差異(p<0.05),貯藏6 d時(shí),提前1 d和2 d預(yù)防顯著好于0 d預(yù)防(p<0.05),與對(duì)照相比0 d預(yù)防加速了褐腐病病斑的擴(kuò)展;拮抗菌B1所有預(yù)防處理對(duì)褐腐病病斑擴(kuò)展都有很好的抑制作用,其中提前1 d預(yù)防處理對(duì)褐腐病病斑擴(kuò)展的抑制率顯著好于其他兩組(p<0.05);拮抗菌B579與B1一樣,所有預(yù)防處理對(duì)褐腐病病斑擴(kuò)展都有很好的抑制作用,但平均抑制率高于B1菌,從貯藏3 d時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,提前0、1、2 d預(yù)防處理這三組之間差異顯著,貯藏6 d時(shí)提前1、2 d預(yù)防處理之間差異不顯著但抑制率顯著高于0 d預(yù)防處理;拮抗菌HB-2提前1、2 d預(yù)防處理顯著好于提前0 d預(yù)防處理,提前0 d預(yù)防處理對(duì)晚熟桃褐腐病病斑的擴(kuò)展沒有抑制作用,甚至在貯藏前期加速了病斑的擴(kuò)展(p<0.05)。綜上所述,四種芽孢桿菌除了個(gè)別處理均能夠顯著抑制晚熟桃采后褐腐病病斑的擴(kuò)展速度,其中提前1、2 d預(yù)防處理好于提前0 d預(yù)防處理,這說明四種芽孢桿菌對(duì)晚熟桃核盤菌病原菌具有較強(qiáng)的活體抑制作用。

芽孢桿菌抑菌的作用機(jī)制多種多樣,主要包括競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用、溶菌作用、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性及促進(jìn)植物生長(zhǎng)5個(gè)方面[20-22]。分析本文中芽孢桿菌抑制機(jī)理可能是由于預(yù)防處理接種的芽孢桿菌能在晚熟桃上提前繁衍和定殖,形成競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),從而抑制了后來接種的褐腐病病原菌的生長(zhǎng)。不過實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同的芽孢桿菌提前預(yù)防天數(shù)對(duì)褐腐病的抑制效果也具有一定的差異性,這可能與不同芽孢桿菌在果實(shí)活體上的生長(zhǎng)特點(diǎn),以及對(duì)褐腐病的抑制能力不同所致,具體原因還需進(jìn)一步的研究及驗(yàn)證。

2.5 四種芽孢桿菌不同時(shí)間預(yù)防處理對(duì)晚熟桃品質(zhì)的影響

晚熟桃貯藏過程中品質(zhì)逐漸下降,尤其是感染褐腐病之后品質(zhì)下降更為明顯。接種病原菌后貯藏6 d時(shí)對(duì)晚熟桃品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定結(jié)果如表2～表5所示,四種芽孢桿菌提前1、2 d預(yù)防處理組的晚熟桃VC含量,除了B1提前2 d預(yù)防處理組,均顯著高于對(duì)照組(p<0.05),尤其是提前2 d預(yù)防時(shí),對(duì)照組VC含量下降到(2.64±0.22) mg/100 g,而B579處理組VC含量為(4.10±0.34) mg/100 g;四種芽孢桿菌提前1、2 d預(yù)防處理組的晚熟桃可溶性固形物含量,均顯著高于對(duì)照組(p<0.05),HB-2提前2 d預(yù)防可溶性固形物含量為(13.17±0.11) mg/100 g,對(duì)照組可溶性固形物含量為(8.46±0.71) mg/100 g;四種芽孢桿菌提前2 d預(yù)防處理有利于抑制晚熟桃可滴定酸含量的下降,其他兩組處理對(duì)可滴定酸含量的影響與對(duì)照相比沒有顯著性差異,提前2 d預(yù)防時(shí),B579處理組可滴定酸含量是對(duì)照組的1.40倍;四種芽孢桿菌,除了HB-2同時(shí)接種褐腐病提前0 d處理外,預(yù)防處理組都能夠顯著抑制晚熟桃硬度的降低(p<0.05),B579提前0、1、2 d預(yù)防處理組晚熟桃的硬度分別是對(duì)照組的1.33、1.49、1.76倍。四種芽孢桿菌提前預(yù)防處理對(duì)晚熟桃品質(zhì)保持產(chǎn)生一定的積極作用,這主要是由于提前預(yù)防處理能夠有效抑制褐腐病病斑的擴(kuò)展,進(jìn)而保證了晚熟桃的品質(zhì)。這與劉璐[23]、肖嫩群[24]等的研究認(rèn)為芽孢桿菌能夠提高果蔬的產(chǎn)量和品質(zhì)的研究相一致。

表2 四種芽孢桿菌不同時(shí)間預(yù)防處理 對(duì)晚熟桃VC含量的影響Table 2 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on VC content of peach

注:同列中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);表3～表5同。

表3 四種芽孢桿菌不同時(shí)間預(yù)防處理 對(duì)晚熟桃可溶性固形物含量的影響Table 3 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on soluble solids content of peach

表4 四種芽孢桿菌不同時(shí)間預(yù)防處理 對(duì)晚熟桃可滴定酸含量的影響Table 4 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on titratable acid content of peach

表5 四種芽孢桿菌不同時(shí)間預(yù)防處理對(duì)晚熟桃硬度的影響Table 5 Effect of four species of Bacillus prevention deals time on hardness of peach

3 結(jié)論

通過對(duì)晚熟桃果實(shí)貯藏期褐腐病病原菌的分離、鑒定,首次發(fā)現(xiàn)核盤菌屬(Sclerotinia)病原菌能夠?qū)е峦硎焯夜麑?shí)貯藏期的腐爛。在實(shí)驗(yàn)中多次重復(fù)回接過程中發(fā)現(xiàn),該病原菌對(duì)晚熟桃的侵染力很強(qiáng),有傷和無傷接種,均可侵染,且傷口越大侵染發(fā)病越快,越重;通過病原菌形態(tài)學(xué)鑒定和18S-rDNA相結(jié)合的手段,明確了晚熟桃采后褐腐病病原菌為子囊菌門(Ascomycota),柔膜菌目(Helotiales),核盤菌科(Sclerotiniaceae),核盤菌屬(Sclerotinia),這為進(jìn)一步研究該病害的流行和防治提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究中所采用的四種芽孢桿菌B001、B1、HB-2、B579在晚熟桃活體接種實(shí)驗(yàn)中對(duì)褐腐病均具有較好的抑菌效果,B579所有處理整體上對(duì)晚熟桃褐腐病病斑擴(kuò)展的抑制率最大,抑制效果最為明顯,其中B001提前1 d和2 d預(yù)防顯著好于0 d預(yù)防(p<0.05);B1提前1 d預(yù)防處理對(duì)褐腐病病斑擴(kuò)展的抑制率顯著好于其他兩組(p<0.05);B579提前1、2 d預(yù)防處理對(duì)褐腐病的抑制率顯著高于0 d預(yù)防處理;HB-2提前1 d預(yù)防顯著好于其他兩組(p<0.05)。同時(shí)四種拮抗菌對(duì)于晚熟桃的VC含量、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、硬度的降低均表現(xiàn)出較好的抑制作用。本研究能夠?yàn)橥硎焯也珊蟛『Φ纳锓乐翁峁┘夹g(shù)支撐,促進(jìn)晚熟桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究是在外部環(huán)境穩(wěn)定的條件下,通過接種病原菌的方式來研究拮抗菌對(duì)少量單個(gè)晚熟桃褐腐病的抑制作用,但是對(duì)于在自然環(huán)境下,受外部環(huán)境的影響,能夠?qū)е峦硎焯也珊蟾癄€的病原菌并不是唯一的,同時(shí)拮抗菌的處理方式也要有所不同,那么這些因素是否會(huì)對(duì)拮抗菌的抑菌能力產(chǎn)生影響,都仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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