雙歧桿菌與乳酸克魯維酵母共發(fā)酵 對(duì)酸奶品質(zhì)及風(fēng)味的影響

貢佳欣,李思寧,唐善虎

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

雙歧桿菌是健康人體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌,具有緩解人體乳糖不耐受癥,抑制病原微生物生長(zhǎng),刺激免疫系統(tǒng)反應(yīng),產(chǎn)生維生素,降低膽固醇等作用[1]。基于雙歧桿菌的保健功效,國內(nèi)外形成了雙歧桿菌乳制品研究開發(fā)的熱潮。普遍意義的酸奶是由乳酸菌發(fā)酵完成,然而隨著研究領(lǐng)域的擴(kuò)展,酵母菌作為一種新型的益生菌在干酪[2]和發(fā)酵乳制品等行業(yè)[3]開始發(fā)揮重要作用,主要表現(xiàn)為參與乳制品中碳水化合物的發(fā)酵,生產(chǎn)芳香族化合物,同時(shí)還可能會(huì)刺激乳酸菌的生長(zhǎng)。乳酸克魯維酵母作為一種乳糖發(fā)酵型酵母[4-7],營(yíng)養(yǎng)要求極其簡(jiǎn)單,生長(zhǎng)旺盛,分泌蛋白能力強(qiáng)[8],其代謝乳糖的機(jī)理是乳糖通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞膜誘導(dǎo)該酵母菌產(chǎn)生乳糖酶[9],參與發(fā)酵過程中乳糖的分解代謝。目前,已有乳酸克魯維酵母用于酸奶發(fā)酵的研究。梁龍等[10]研究并優(yōu)化了乳酸克魯維酵母與乳酸菌混菌發(fā)酵對(duì)乳糖的降解條件。Jakobsen M等[11]研究了開菲爾粒中的酵母菌與副干酪乳桿菌之間的共生關(guān)系,發(fā)現(xiàn)酵母菌的存在對(duì)副干酪乳桿菌在腸道內(nèi)的定殖有著促進(jìn)作用。關(guān)于乳酸克魯維酵母與雙歧桿菌共發(fā)酵酸奶的研究尚未見報(bào)道。本文探討了改變?nèi)樗峥唆斁S酵母添加量與雙歧桿菌共發(fā)酵對(duì)酸奶在儲(chǔ)藏期間感官品質(zhì)、理化性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)及揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響,以期為開發(fā)新型酸奶,豐富酸奶市場(chǎng)產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛乳 新希望乳業(yè)股份有限公司;蔗糖 太古糖業(yè);復(fù)合發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌) 上海昊岳實(shí)業(yè)有限公司;乳酸克魯維酵母CICC 1777 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;氫氧化鈉、百里香酚酞、氯化鈉 均為分析純,成都科龍化工試劑公司。

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;NS1001L型高壓均質(zhì)機(jī) 意大利NiroSoavi公司;TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;PL303分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;MP511 pH計(jì) 上海三信儀表廠;Trace DSQ型GC-MS聯(lián)用儀(配Tripplus自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸克魯維酵母活化 在35 ℃培養(yǎng)溫度下,接種0.1%乳酸克魯維酵母于新鮮牛乳中,培養(yǎng)至凝乳。

表1 酸奶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory score standard for yogurt

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將鮮牛乳加熱到65 ℃,加入5%蔗糖使之充分溶解,于25 MPa壓力下均質(zhì),均質(zhì)后將牛乳加熱到90 ℃,保持10 min殺菌,立即冷卻到42 ℃左右,均接種0.1%的混合發(fā)酵劑,并加入活化后的乳酸克魯維酵母,酵母添加量分別為0.0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,攪拌均勻后于40 ℃下發(fā)酵6 h至凝固,置于4 ℃冰箱后熟24 h后測(cè)定酸奶的感官、滴定酸度、pH、持水力及質(zhì)構(gòu)指標(biāo),選擇品質(zhì)較好的酸奶,并對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 感官評(píng)價(jià) 參照GB 19302-2010發(fā)酵乳感官要求[12]制定酸奶評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),組織食品專業(yè)10人對(duì)酸奶的色澤、氣味、滋味及組織狀態(tài)進(jìn)行感官評(píng)定,逐項(xiàng)評(píng)分并記錄,評(píng)定要求見表1。

1.2.3.2 酸度 采用滴定法測(cè)定發(fā)酵乳的酸度[12]。取經(jīng)后熟的發(fā)酵乳樣品5.0 g,加入5 mL蒸餾水,混合均勻,加入2滴0.5%的酚酞指示劑,用0.1 mol/L NaOH滴定至淡粉色,1 min內(nèi)不褪色,同時(shí)以空白作為對(duì)照,根據(jù)所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的量計(jì)算出滴定酸度(°T)。

1.2.3.3 pH 采用pH計(jì)測(cè)定共發(fā)酵酸奶的pH。

1.2.3.4 持水力 參考Guzmán-González M[13]的方法測(cè)定。取酸奶10 g,室溫下5000 r/min離心30 min后,棄上清液,離心管倒置10 min后立即稱重,計(jì)算持水力。持水力(%)=離心沉淀物重量/樣品重量×100。

1.2.3.5 質(zhì)構(gòu) 參考李春紅[14]的方法測(cè)定。測(cè)定參數(shù):測(cè)前速:1.0 mm/s;測(cè)試速:1.0 mm/s;測(cè)后速:10 mm/s;下壓距離:15 mm;負(fù)載類型:Auto-10 g;探頭:A/BE-d35探頭;數(shù)據(jù)獲得率:200 pps。

1.2.3.6 風(fēng)味成分 a.風(fēng)味物質(zhì)萃取:吸取酸奶5 mL轉(zhuǎn)入20 mL頂空進(jìn)樣瓶?jī)?nèi),加入2 g氯化鈉,加蓋密封,加熱至45 ℃,鹽析30 min。用已老化的固相微萃取頭旋轉(zhuǎn)頂空吸附,富集酸奶風(fēng)味物質(zhì)30 min,260 ℃解吸附3 min,進(jìn)行GC-MS分析。

b.檢測(cè)條件參考郭文奎[15]的方法,稍作修改。

GC條件:采用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為He氣,流速為1.0 mL/min,采用不分流模式;進(jìn)樣口溫度260 ℃;升溫程序:起始溫度40 ℃保持4 min,并以5 ℃/min升到140 ℃持續(xù)10 min,再以5 ℃/min升到210 ℃保持12 min,最后以10 ℃/min升到240 ℃。MS條件:EI電離源,70 eV;離子源溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍35～400 amu;發(fā)射電流100 μA,檢測(cè)電壓1.4 kV。

c.定性、定量方法:利用Xcalibur軟件系統(tǒng)自帶的NIST 08標(biāo)準(zhǔn)庫對(duì)MS結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)檢索,要求正反向匹配因子大于800,結(jié)合文獻(xiàn)描述對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性,通過面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)

從色澤、氣味、滋味和組織狀態(tài)4個(gè)方面對(duì)酸奶樣品進(jìn)行感官評(píng)定,評(píng)分結(jié)果見表2。當(dāng)乳酸克魯維酵母添加量為2.5%時(shí),酸奶的感官評(píng)分最高,有較強(qiáng)醇香味,凝乳均勻,無顆粒感。乳酸克魯維酵母添加量在2.0%～2.5%,與雙歧桿菌制備的共發(fā)酵酸奶的感官品質(zhì)較好。

表2 酸奶感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation result of yogurt

注:同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 酸度變化

共發(fā)酵酸奶滴定酸度變化見圖1。隨酵母添加量的增加,共發(fā)酵酸奶的滴定酸度先上升后下降,均顯著高于不添加酵母的酸奶(p<0.05),這說明乳酸克魯維酵母促進(jìn)了乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)乳酸克魯維酵母添加量為2.0%時(shí),酸奶的酸度最大,為86.39 °T。酵母添加量大于2.0%之后,酸奶的酸度有所下降,原因可能是酵母變成了優(yōu)勢(shì)菌株,在一定程度上抑制了乳酸菌的產(chǎn)酸能力。

圖1 乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶滴定酸度的影響Fig.1 Effect of addition of Kluyveromyces lactis on yogurt acidity注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2、圖3同。

2.3 pH變化

乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶pH的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知,添加乳酸克魯維酵母的酸奶pH普遍低于不添加酵母的酸奶(p<0.05)。當(dāng)乳酸克魯維酵母添加量為3.0%時(shí),酸奶的pH顯著上升(p<0.05),表明酵母在此添加量水平,抑制了乳酸菌的產(chǎn)酸能力。

圖2 乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶pH的影響Fig.2 Effect of addition of Kluyveromyces lactis on pH of yogurt

2.4 持水力變化

乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶持水力的影響見圖3。由圖3可知,隨著乳酸克魯維酵母添加量的增加,酸奶的持水力顯著上升(p<0.05)。這可能是因?yàn)樗崮痰谋Ｋεc蛋白質(zhì)含量和固形物濃度有關(guān)[16],乳酸克魯維酵母是一種分泌蛋白能力強(qiáng)的酵母菌[8],添加乳酸克魯維酵母的酸奶因蛋白質(zhì)含量增多,使其酸奶樣品的持水力增加。當(dāng)乳酸克魯維酵母添加量為3.0%時(shí),制備的酸奶樣品的持水力最高。

圖3 乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶持水力的影響Fig.3 Effect of addition of Kluyveromyces lactis on water holding capacity of yogurt

2.5 質(zhì)構(gòu)變化

乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶硬度、膠黏性、內(nèi)聚性及粘聚性的影響結(jié)果見表3。由表3可知,隨酵母添加量的增加,共發(fā)酵酸奶的硬度、膠黏性、內(nèi)聚性及粘聚性均顯著增大(p<0.05)。當(dāng)酵母添加量大于2.0%,酸奶的硬度、膠黏性、內(nèi)聚性和粘聚性均沒有顯著變化(p>0.05)。一些研究發(fā)現(xiàn),酸奶的硬度、膠黏性及粘聚性并不是越大越好[17-18]。綜合質(zhì)構(gòu)指標(biāo),乳酸克魯維酵母添加量大于2.0%時(shí)制備的共發(fā)酵酸奶質(zhì)地較好。

表3 乳酸克魯維酵母添加量對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的影響Table 3 Effect of addition of Kluyveromyces lactis on yogurt hardness

注:同行數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

表4 不同乳酸克魯維酵母添加量的酸奶中揮發(fā)性物質(zhì)的分類統(tǒng)計(jì)Table 4 Classification statistics of volatile substances in yogurt with different addition of Kluyveromyces lactis

綜上所述,在酵母實(shí)驗(yàn)添加量范圍內(nèi),乳酸克魯維酵母添加量為2.0%～3.0%制備的共發(fā)酵酸奶感官、理化及質(zhì)構(gòu)指標(biāo)較好。因此,選擇酵母添加量為2.0%、2.5%及3.0%的酸奶后熟24 h后,進(jìn)行風(fēng)味成分的檢測(cè)。

2.6 風(fēng)味成分的變化

各組酸奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分類統(tǒng)計(jì)見表4。

由表4可以看出,添加2.0%、2.5%和3.0%乳酸克魯維酵母的酸奶樣品中檢出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總數(shù)分別為25種、24種、24種,均大于不添加乳酸克魯維酵母的酸奶(21種)。添加乳酸克魯維酵母的酸奶中檢出的醇類、酯類及烴類物質(zhì)的個(gè)數(shù)高于不添加乳酸克魯維酵母的酸奶,且醇類和酯類的相對(duì)百分含量要高于不添加乳酸克魯維酵母的酸奶,這是一個(gè)很突出的特征。對(duì)于添加乳酸克魯維酵母的酸奶來說,添加量為2.0%的酸奶中檢出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)個(gè)數(shù)最多,且酯類、酮類、烴類物質(zhì)相對(duì)含量最高。

3 結(jié)論

隨乳酸克魯維酵母添加量的增加,酸奶的感官品質(zhì)先上升后下降(p<0.05),當(dāng)乳酸克魯維酵母添加量在2%～2.5%,與雙歧桿菌制備的共發(fā)酵酸奶的感官品質(zhì)較好;乳酸克魯維酵母添加量在2.0%～3.0%時(shí),可以促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸,提高酸奶的持水力,改善酸奶的硬度、膠黏性、內(nèi)聚性及粘聚性。添加乳酸克魯維酵母的酸奶中檢出的醇類、酯類及烴類物質(zhì)的個(gè)數(shù)高于不添加乳酸克魯維酵母的酸奶,且醇類和酯類的相對(duì)百分含量要高于不添加乳酸克魯維酵母的酸奶。乳酸克魯維酵母添加量為2.0%的酸奶品質(zhì)及風(fēng)味較好。綜合考慮,乳酸克魯維酵母添加量為2.0%,與雙歧桿菌制備共發(fā)酵酸奶的品質(zhì)及風(fēng)味較好。

[1]田洪濤,張?bào)?王占武,等. 影響雙歧桿菌微生態(tài)制劑菌體存活的因素[J]. 中國乳品工業(yè),2000,28(1):23-25,28.

[2]Flannigan B. The Mycota:A comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research. X. Industrial Applications[J]. Mycologist,2003,17(1):45-46.

[3]Cregg J M,Cereghino J L,Shi J,et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J]. Molecular Biotechnology,2000,16(1):23-52.

[4]張莉,李慶章,田雷.β-半乳糖苷酶研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(7):128-131.

[5]賈少婷,邢慧敏,桂仕林,等. 低聚半乳糖研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工,2010(5):71-73.

[6]Siso M I G,Ramil E,Cerdán M E,et al. Respirofermentative metabolism inKluyveromyceslactis:Ethanol production and the Crabtree effect[J]. Enzyme & Microbial Technology,1996,18(8):585-591.

[7]Marwaha S S,Kennedy J F. Ethanol production from whey permeate by immobilized yeast cells[J]. Enzyme and Microbial

Technology,1984,6(1):18-22.

[8]Oberman H,Libudzisz Z. Microbiology of Fermented Foods Vol. 1[M]//Microbiology of Fermented Foods,1998:308-350.

[9]Brady D,Marchant R,Mchale L,et al. Isolation and partial characterization ofβ-galactosidase activity produced by a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus during growth on lactose-containing media[J]. Enzyme and Microbial Technology,1995,17(8):696-699.

[10]梁龍,牟光慶,陳歷俊,等. 乳酸克魯維酵母與乳酸菌混菌發(fā)酵對(duì)乳糖降解條件的優(yōu)化[J]. 中國乳品工業(yè),2013(5):12-14.

[11]Jakobsen M,Narvhus J. Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the quality of dairy products[J]. International Dairy Journal,1996,6(8-9):755-768.

[12]GB 19302-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[13]Guzmán-González M,Morais F,Ramos M,et al. Influence of skimmed milk concentrate replacement by dry dairy products in a low fat set-type yoghurt model system. I:Use of whey protein concentrates,milk protein concentrates and skimmed milk powder[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,1999,79(8):1117-1122.

[14]李春紅,張明晶,潘家榮. 物性測(cè)試儀在粘稠類食品品質(zhì)評(píng)價(jià)上的應(yīng)用研究[J]. 現(xiàn)代科學(xué)儀器,2006(6):111-113.

[15]郭文奎. 優(yōu)質(zhì)酸奶風(fēng)味圖譜的建立[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[16]李榮華. 乳蛋白對(duì)凝固型酸奶流變學(xué)特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[17]蘇海龍. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在凝固型酸奶中的應(yīng)用研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2003:1-53.

[18]馬微,楊會(huì)琴,王海波,等. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的酸奶超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察[J]. 食品科學(xué),2006,27(2):104-107.