蠶蛹蛋白的酶法水解工藝及其口服液的制備

黃美佳,戴 燕,程劍鋒,徐玉娟,鄒宇曉,李 欣,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東廣州 510610)

我國蠶蛹產(chǎn)量居世界首位,資源豐富,同時(shí)蠶蛹也是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的資源,蘊(yùn)藏著一定的開發(fā)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。蠶蛹蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),含有人體所需的8種必需氨基酸以及多種生物活性物質(zhì),且配比均衡性較好[3-4],在中國、韓國、日本、泰國和印度等亞洲地區(qū)成為了一種較受歡迎的食物[5-6]。蠶蛹還富含核黃素、鋅、鐵、銅等營養(yǎng)素[7-8],含有腦激素、保幼激素等多種具有抑制衰老以及促進(jìn)生長的激素[9-10]。蛋白酶水解蛋白質(zhì)是將大分子蛋白水解成小分子肽段的過程,反應(yīng)條件溫和,且能得到更多的免疫活性肽[11-12]。蠶蛹蛋白酶解制備多肽國內(nèi)已有部分研究,但對本文同時(shí)以水解度和小鼠脾細(xì)胞的增殖為檢測指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)并未研究。免疫活性肽具有緩解疲勞[13],參與人體代謝降低血壓等功能[7]。因此蠶蛹具有比較高的營養(yǎng)價(jià)值,可以將它作為一種生產(chǎn)具備生物活性功能產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料[14]。本實(shí)驗(yàn)以蠶蛹為原料,采用酶解方法制備蠶蛹蛋白肽,并研制蠶蛹蛋白肽口服液,不僅為特需人群提供營養(yǎng),也為蠶蛹資源的開發(fā)和應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹(兩廣二號(hào)) 2015年4月購于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究院;BALB/C純系小白鼠 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科；菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司，蛋白酶酶活均為20萬U/g;低分子量Marker 美國Thermo公司;OPA Sigma公司;DTT 上海生工;胎牛血清 美國Gibco公司;RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基 北京索萊寶公司。

高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;HJ-A6恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州邁科諾儀器有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本三洋公司;Mode 1860酶標(biāo)儀、PowerPac 3000電泳儀、Quantity One凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹蛋白肽酶解工藝的研究

1.2.1.1 蛋白酶的篩選 本實(shí)驗(yàn)選用了菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶這五種蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解。將蠶蛹清洗除油制備脫脂蠶蛹蛋白粉[7],稱取一定量脫脂蠶蛹蛋白粉,用蒸餾水稀釋后攪拌均勻,用食用級(jí)的二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)體系酸度至各蛋白酶最適pH范圍,并于恒溫水浴鍋上攪拌加熱恒溫至設(shè)定溫度。迅速加入己準(zhǔn)備好的蛋白酶溶液進(jìn)行酶解,酶解過程中不斷滴加二水合磷酸二氫鈉或十二水合磷酸氫二鈉溶液以保持體系恒定的pH,在水浴中反應(yīng)15、30、60、90、120、150、180、240 min后取出,沸水浴滅酶10 min后得到蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物,冷卻后將酶解液的pH調(diào)至7.0,然后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液冷藏備用。采用最優(yōu)蛋白酶酶解制備蠶蛹蛋白肽,以水解度(DH)與淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為指標(biāo),從五種酶中篩選出最佳的蛋白酶。表1是說明書推薦的各蛋白酶酶解的最適條件以及酶活,作為實(shí)驗(yàn)條件。

表1 各蛋白酶酶解最適條件Table 1 The optimum conditions of protease hydrolysis

1.2.1.2 堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白條件優(yōu)化 通過堿性蛋白酶單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜條件:pH8,加酶量為6.0%,水/底物為20∶1,溫度為55 ℃。且酶解溫度在55 ℃左右以及加酶量在6%左右對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大,選用酶解時(shí)間、酶解pH和水/底物三個(gè)因素作為優(yōu)化的因素,并利用響應(yīng)面分析法確定最佳酶解條件，設(shè)計(jì)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn),在單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定pH、酶解時(shí)間和水與底物比這三個(gè)因素的取值范圍,如表2。

表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 2 The factors and levels of the Box-Behnken center combination experiment

1.2.2 水解液的精制 水解液經(jīng)醫(yī)用紗布(六層)粗濾,得到酶解液;采用活性炭吸附的方法[7]對酶解液進(jìn)行脫苦脫色,溫度為50 ℃,攪拌脫色處理時(shí)間1 h,離心(8000 r/min,20 min);然后脫臭:β-環(huán)糊精吸附,至沒有難聞的氣味為止,離心(8000 r/min,20 min)并用0.45 μm的膜抽濾,使水解液澄清。

1.2.3 蠶蛹口服液的研制

1.2.3.1 工藝流程 蠶蛹→清洗→烘干→磨粉→脫脂→烘干→酶解→紗布粗濾→脫苦脫色→脫臭→調(diào)配→灌裝→封口→滅菌→口服液→包裝。

1.2.3.2 操作要點(diǎn) 混合調(diào)配:將蔗糖、檸檬酸按照一定比例加入到精制后的肽液中,即得基本料液;灌裝:采用10 mL的口服液瓶子灌裝,排氣(70～80 ℃,10 min)減少口服液中的空氣量,封口機(jī)封口,水浴中100 ℃滅菌10～15 min,包裝[15]。

1.2.3.3 配方設(shè)計(jì) 由于蠶蛹蛋白肽具有緩解疲勞,增加免疫力等作用,因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了蠶蛹蛋白肽口服液的研制。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定的蠶蛹蛋白肽酶解最佳工藝條件制備蠶蛹蛋白肽,并按1.2.3.1中工藝流程進(jìn)行口服液的研制。采用活性炭吸附的方法對酶解液進(jìn)行脫苦脫色處理,分析0.5%、1.5%、3.0%、5.0%、7.0%的活性碳用量對脫苦結(jié)果的影響。用1%、2%、4%、6%、7%β-環(huán)糊精吸附對其進(jìn)行脫臭處理。通過色澤、氣味、狀態(tài)等感官評價(jià)為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果的評定。

通過蔗糖和檸檬酸的含量來調(diào)配口服液的口味。蔗糖含量選擇2%、4%、6%、8%、10%,檸檬酸含量選擇0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%。蔗糖的每種含量分別對應(yīng)于檸檬酸的五種含量,共25組實(shí)驗(yàn),以口服液的口感、色澤、氣味、狀態(tài)等感官評價(jià)為指標(biāo)。

1.2.4 指標(biāo)測定

1.2.4.1 水解度測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法[15-16]。以精氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取400 μL樣品溶液加入到盛有3 mL OPA的離心管中,混勻5 s,避光反應(yīng)2 min,同時(shí)做空白對照實(shí)驗(yàn),未水解樣品(未加酶的蠶蛹蛋白溶液)代替,340 nm下測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解度如下:

h=(ht-hc)×DF

DH(%)=h/htot×100

式中,ht-樣品的吸光度從標(biāo)曲上查得的濃度;hc-對照品(未水解樣品)的吸光度從標(biāo)曲上查得的濃度;htot-全部酶解液(蛋白酶解完全的溶液)的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度;DH-樣品的水解度;DF-樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.4.2 免疫活性檢測 小鼠淋巴細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)[17-18]。具體方法為:2只5周齡健康的18～20 g BAL B/C小白鼠,頸椎脫臼處死,置于消毒酒精中,10 min后在超靜臺(tái)中解剖分離出小鼠脾臟。然后碾碎并過100目尼龍細(xì)胞篩,加入10 mL不完全培養(yǎng)基RPMI-1640,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,1000 r/min離心5 min后棄上清,重復(fù)2次。加入3～4 mL紅細(xì)胞裂解液,5 min后加入不完全培養(yǎng)基RPMI-1640重懸脾細(xì)胞,1000 r/min離心5 min棄上清,重復(fù)1次,加入含0.1 mg/mL胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI-1640約2 mL。向0.15 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液中加入等體積的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。稀釋細(xì)胞濃度為1～2×106cell/mL后,加入到96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中。蠶蛹酶解液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,以400 μg/mL濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中刺激脾細(xì)胞。同時(shí)設(shè)置陰性對照組(滅活的酶溶液)和空白對照組(生理鹽水)。培養(yǎng)72 h后每孔加入0.01 mL MTT溶液(0.5%,w/v),繼續(xù)在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,1000 r/min離心10 min后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入0.1 mL DMSO后置于搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。由酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值。另設(shè)一組陰性對照組和調(diào)零孔(不加細(xì)胞)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)都以平均值的形式表示,每個(gè)測試都重復(fù)三次,結(jié)果采用SPSS statistical軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹蛋白肽酶解工藝

2.1.1 蛋白酶的篩選 圖1～圖5分別為風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性。從圖1～圖5中可以看出,風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度明顯高于菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶,其中以堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的水解度略高于風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶。而對于酶解脫脂蠶蛹蛋白肽的免疫活性,堿性蛋白酶和中性蛋白酶明顯高于其他三種蛋白酶,其中堿性蛋白酶最大值略高于中性蛋白酶,綜合考慮水解度和酶解肽的免疫活性,本實(shí)驗(yàn)選用堿性蛋白酶作為酶解脫脂蠶蛹蛋白的優(yōu)勢酶。并由圖3可知,當(dāng)酶解時(shí)間選用90 min時(shí),酶解脫脂蠶蛹蛋白肽的免疫活性最強(qiáng),因此,在后續(xù)的對酶解條件的初步優(yōu)化過程中,選用酶解時(shí)間90 min為中心值,進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 風(fēng)味蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的 水解度和免疫活性的影響Fig.1 Effects of flavourzyme on the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein

圖2 菠蘿蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的 水解度和免疫活性的影響Fig.2 Effects of bromelain on the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein

圖3 堿性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的 水解度和免疫活性的影響Fig.3 Effects of alkaline protease on the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein

圖4 木瓜蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的 水解度和免疫活性的影響Fig.4 Effects of papain on the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein

圖5 中性蛋白酶對脫脂蠶蛹蛋白的 水解度和免疫活性的影響Fig.5 Effects of neutral protease on the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein

2.1.2 堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白條件的優(yōu)化 通過以上對幾種蛋白酶的酶解分析,選用堿性蛋白酶對其進(jìn)行單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)。劉旭輝[19]也用堿性蛋白酶通過單因素實(shí)驗(yàn)得出蠶蛹蛋白肽酶解最優(yōu)工藝條件,但只以水解度作為優(yōu)化條件,且并沒有進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析。

以脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性(OD490)作為結(jié)果值。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,利用軟件Design-Expert 8.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合[20-21],得到水解度 R1和免疫活性R2對酶解時(shí)間(A)、酶解pH(B)和水/底物(C)三個(gè)因素的回歸方程:

R1=17.70+3.55A-0.71B-1.15C+0.42AB+0.16AC+0.59BC-0.061A2-1.12B2-2.03C2

R2=0.26+0.00714A+0.0000388B+0.000208C+0.00358AB+0.00463AC+0.00214BC-0.011A2-0.013B2-0.00798C2

表3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

表4 水解度回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of degree of hydrolysis

由回歸方程方差分析結(jié)果(表4,表5)可知,水解度和免疫活性兩個(gè)回歸模型的p值均小于0.01,說明該模型高度顯著(p<0.01),水解度的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9175,免疫活性的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9076,這說明該兩個(gè)回歸方程的可信度高,水解度的失擬項(xiàng)p=0.3257>0.05以及免疫活性的失擬項(xiàng)p=0.3218>0.05,均為不顯著,說明該回歸方程的擬合度高。由模型的顯著性檢驗(yàn)可知,對于水解度模型,酶解時(shí)間的一次項(xiàng)以及水與底物比的二次項(xiàng)為極顯著(p<0.01),水與底物比的一次項(xiàng)和pH的二次項(xiàng)為顯著(p<0.05);對于免疫活性模型,酶解時(shí)間的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)以及pH和水與底物比的二次項(xiàng)為極顯著(p<0.01)。由回歸方程R1和R2可知,三個(gè)因素A、B、C的一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小均為A>C>B,這說明酶解時(shí)間對堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度以及免疫活性的影響最大,其次為水與底物比,pH影響最小。

根據(jù)圖6和圖7可知,隨著酶解時(shí)間增加水解度逐漸增加,而酶解液的免疫活性則是先升高,而后下降,而對于pH和水與底物比例,不管是對于水解度還是免疫活性,都呈拋物線形式,先升高后回落。

表5 免疫活性回歸分析結(jié)果Table 5 Regression analysis results of immune activity

圖6 三因素對酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度三維響應(yīng)面圖Fig.6 Three-dimensional response surface of three factors to the degree of hydrolysis of the defatted silkworm pupa protein

圖7 三因素對酶解脫脂蠶蛹蛋白的免疫活性三維響應(yīng)面圖Fig.7 Three-dimensional response surface of three factors to the immune activity of the defatted silkworm pupa protein

由軟件Design-Expert 8.0對兩回歸曲線的精確計(jì)算,得到堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳工藝參數(shù)為:酶解時(shí)間1.96 h,pH8.03,水/底物20.16∶1,且在此最佳條件下,預(yù)測酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度為20.87%,免疫活性O(shè)D490為0.2598。為方便實(shí)驗(yàn)條件并驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性,選取酶解時(shí)間2 h,pH8,水/底物20∶1的條件下對脫脂蠶蛹蛋白進(jìn)行了三次酶解實(shí)驗(yàn),測得的平均水解度為19.96%±1.02%;平均免疫活性O(shè)D490為0.2512±0.0125,與模型預(yù)測值的較為接近,因此,該響應(yīng)面對酶解條件的優(yōu)化準(zhǔn)確可靠。

2.2 蠶蛹蛋白肽的精制

采用活性炭吸附的方法對酶解液進(jìn)行脫苦脫色處理,結(jié)果表明3%的活性炭用量效果最好。脫臭結(jié)果發(fā)現(xiàn)4%β-環(huán)糊精吸附效果最佳。

2.3 蠶蛹口服液的研制

蔗糖含量與檸檬酸含量進(jìn)行感官分析和品嘗,得到最佳工藝為:蔗糖量8%,檸檬酸量1%,此時(shí)口服液口感良好,具有蠶蛹獨(dú)特風(fēng)味。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

感官指標(biāo):淡黃色,澄清,有光澤。

3 結(jié)論

通過五種酶的篩選,采用堿性蛋白酶水解制備蠶蛹蛋白肽,通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定蠶蛹蛋白肽酶解的最佳工藝條件為:酶解溫度55 ℃,加酶量6%,酶解時(shí)間2 h,pH8,水和底物比20∶1,此條件下水解度為19.96%±1.02%,免疫活性O(shè)D490為0.2512±0.0125。酶解可將蠶蛹蛋白分解成小肽段,可能大量破壞其結(jié)合表位,既能降低過敏的風(fēng)險(xiǎn),又能獲得活性肽。因此,實(shí)驗(yàn)對蠶蛹蛋白的酶解條件對潛在致敏性的研究有重要意義,同時(shí)給低致敏蠶蛹口服液提供一定的理論依據(jù)。本文以得到的酶解結(jié)果進(jìn)行了蠶蛹免疫活性蛋白肽口服液的研制,得到最佳工藝為:蔗糖量8%,檸檬酸量1%,在此條件制得的口服液口味最佳。這也為特需人群提供了一定的營養(yǎng)價(jià)值。

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