核桃仁皮不同極性提取物的 體外抗氧化活性分析

蒲成偉,闞 歡,劉 云

(西南林業(yè)大學(xué),云南昆明 650224)

核桃(JuglanssigillataL)又名胡桃、羌桃,為核桃科(Jugladaceac)核桃屬(Juglans)植物。核桃不僅含有大量的油脂與優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),還富含多種礦物質(zhì)、多糖、黃酮和多酚類物質(zhì),是一種重要的營(yíng)養(yǎng)保健佳品。核桃仁皮是核桃仁表面的一層薄膜,約占整個(gè)核桃仁質(zhì)量的10%[1],鮮核桃成乳白色,干核桃為褐色。核桃仁皮中存在大量苦味物質(zhì),極易影響產(chǎn)品的口感[2],因此常被當(dāng)做廢棄物處理,不僅造成了極大的資源浪費(fèi),也給環(huán)境帶來很大壓力。國(guó)外許多研究已經(jīng)證明,核桃仁中對(duì)人體有益的多酚類物質(zhì)主要集中在種皮部分[3-6],且核桃的功效與多酚類物質(zhì)有直接關(guān)系[7-9],例如抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抗病毒[12]、抑菌、降血糖、降血脂、保護(hù)心血管[13]、抗衰老、提高免疫力、保護(hù)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)等[14-17],因此對(duì)核桃仁皮中多酚的研究具有重大意義。

本文采用云南大理泡核桃仁皮為原料,以有機(jī)溶劑萃取法得到核桃仁皮不同極性提取物,分別采用清除DPPH自由基、OH自由基、ABTS自由基體系與鐵離子還原能力對(duì)核桃仁皮不同極性提取物進(jìn)行體外抗氧化活性分析,旨在為核桃天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃仁皮 云南大理泡核桃；Folin-Ciocalteu試劑 上海源葉生物科技有限公司;l,l-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度≥98%) Sigma公司;2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(純度≥98%)上海源葉生物科技有限公司;硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、十二水和磷酸氫二鈉等 均為分析純,廣東光華化學(xué)廠有限公司;沒食子酸、水楊酸、過氧化氫、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸、抗壞血酸VC、無水乙醇等 均為分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

101-2AB型電熱風(fēng)鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;YB-2型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速峰工貿(mào)有限公司;電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電氣有限公司;德國(guó)Sigma 3k15高速(冷凍)離心機(jī) 上海思高勒生物科技有限公司;UV2600紫外分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;FD5-series凍干機(jī) 美國(guó)金西盟國(guó)際集團(tuán)中國(guó)分公司;RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SB25-12DTDS型超聲波清洗機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核桃仁皮粗提取的制備 核桃仁皮粗提物的提取參照文獻(xiàn)[18-19]并略作修改。將核桃仁皮于50 ℃烘干至恒重,粉碎后過60目篩。準(zhǔn)確稱取250 g核桃仁皮粉末,在60 ℃條件下加入60%乙醇(料液的質(zhì)量體積比為1∶6),于200 W下超聲波輔助提取50 min,過濾,收集濾液;濾渣按上述步驟反復(fù)提取2次,合并濾液。將濾液在50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去溶劑,定容至100 mL,即為核桃仁皮多酚粗提取物。

1.2.2 核桃仁皮不同極性相提取物的制備 將100 mL核桃仁皮粗提物,完全轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,按體積比(1∶1)加入石油醚,搖勻,靜置至完全分層,放出下層水溶液,倒出上層石油醚層溶液,將水溶液用同樣方法連續(xù)萃取2次;將三次石油醚溶液合并,在50 ℃條件下減壓濃縮,得到核桃仁皮的石油醚相提取物。采取同樣方法將剩余水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,即可分別得到核桃仁皮氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相的粗提物。將不同極性粗提物存放于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 核桃仁皮不同極性相溶液的配制 準(zhǔn)確稱取不同極性相的粗提物樣品0.1 g,溶解定容至100 mL容量瓶中,作為母液備用。乙酸乙酯、正丁醇、水相以蒸餾水為溶劑,氯仿、石油醚相以95%乙醇為溶劑,于4 ℃下避光保存。

1.2.4 多酚含量的測(cè)定

1.2.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[20]并稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.1 g沒食子酸,以蒸餾水為溶劑配制濃度為1 mg/mL的母液,將母液分別稀釋成濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液備用。準(zhǔn)確移取10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液1 mL,Folin-Ciocalteau試劑5 mL,充分混勻,反應(yīng)5～8 min后加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,避光反應(yīng)1 h,以蒸餾水調(diào)零,于765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液吸光度,重復(fù)3次。以吸光值為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),得沒食子酸濃度(μg/mL)與吸光度(A)的回歸方程。

1.2.4.2 核桃仁皮不同極性提取物中多酚含量的測(cè)定 移取“1.2.3”方法所配制的不同極性溶劑提取物母液1 mL,用蒸餾水稀釋至50 mL,其余按照“1.2.4.1”方法操作,測(cè)定體系在765 nm處吸光度,并根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算不同極性提取物中多酚含量。

1.2.5 核桃仁皮不同極性相提取物抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]并稍作修改。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液,以95%乙醇稀釋為2、4、6、8、10、20 μg/mL的樣品液。移取2 mL DPPH-乙醇溶液,2 mL不同濃度樣品液于試管中,混合均勻后,在37 ℃條件下避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)X,并以蒸餾水或95%乙醇替代樣品測(cè)吸光度A0,平行3次取平均值。以VC作對(duì)照。

DPPH自由基清除率公式如下:

式中:A0-空白吸光度,AX-樣品吸光度。

1.2.5.2 OH自由基清除能力的測(cè)定 OH自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22-23]并稍作修改。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液,以95%乙醇稀釋為200、400、600、800、1000 μg/mL的樣品液,依次往試管中加入9 mmol/L乙醇-水楊酸2 mL、9 mmol/L FeSO42 mL、樣品液2 mL、8.8 mmol/L H2O22 mL,每加一種溶液立即搖勻,以蒸餾水調(diào)零,測(cè)定AX,以蒸餾水代替樣品測(cè)定AO,以無水乙醇代替乙醇-水楊酸測(cè)定AX0。平行3次取平均值,以VC做對(duì)照。

羥自由基清除率公式如下:

式中:A0-空白吸光度,AX-樣品吸光度,AX0-無水乙醇代替乙醇-水楊酸吸光度。

1.2.5.3 鐵離子還原能力的測(cè)定 鐵離子還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[24]并稍作修改。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液以95%乙醇稀釋為20、40、60、80、100 μg/mL的樣品液。先后移取pH6.6磷酸緩沖液2.5 mL、1%鐵氰化鉀2.5 mL、不同濃度的樣品液2.5 mL于離心管中混合均勻,于50 ℃水浴20 min后,再加入10% 三氯乙酸(TCA)溶液2.5 mL,混合后于4000 r/min離心5 min,取上清液2.5 mL,加入蒸餾水2.5 mL、0.1%三氯化鐵2.5 mL,靜置10 min,700 nm處測(cè)定吸光值,以95%乙醇代替樣品做參比溶液,平行3次取平均值,以VC作對(duì)照。

1.2.5.4 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 ABTS自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[24]并稍作修改。ABTS自由基反應(yīng)貯備液的配制:取50 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與50 mL濃度為5.0 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,在室溫下置于暗處反應(yīng)12～16 h,作為反應(yīng)貯備液,在波長(zhǎng)734 nm處,用70%乙醇將ABTS自由基反應(yīng)貯備液稀釋至吸光值為0.70±0.02備用。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液用70%乙醇稀釋為20、40、60、80、100 μg/mL的樣品液,分別向試管中加入0.1 mL不同濃度樣品溶液,3.9 mL ABTS自由基反應(yīng)貯備液,室溫下避光準(zhǔn)確反應(yīng)6 min,以70%乙醇調(diào)零,于波長(zhǎng)734 nm處迅速測(cè)定吸光值A(chǔ)s。同時(shí)以70%乙醇替代樣品液作空白,于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)b,平行3次取平均值,以VC作對(duì)照。

ABTS自由基清除率公式如下:

式中:A0-空白吸光,AX-樣品吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0與Microsoft Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃仁皮多酚含量的測(cè)定

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1.2 核桃仁皮不同極性相提取物中多酚含量 由圖2可知,各極性相多酚含量由高到低依次是乙酸乙酯相(805.6 mg/g)、水相(229.19 mg/g)、正丁醇相(164.66 mg/g)、氯仿相(103.12 mg/g)、石油醚相(37.75 mg/g)。在四種不同極性的溶劑中,乙酸乙酯提取相中的多酚含量分別是正丁醇提取相的4.89倍,氯仿提取相的7.81倍,石油醚提取相的23.41倍,因此核桃仁皮多酚的提取效果與溶劑極性有密切關(guān)系,且根據(jù)相似相溶原理,核桃仁皮中多酚的極性與乙酸乙酯溶劑的極性相近,與石油醚溶劑極性相差較大。

圖2 不同極性溶劑提取物多酚含量Fig.2 Polyphenol content in extracts of different polar solvents

2.2 核桃仁皮不同極性相提取物抗氧化活性的分析

2.2.1 核桃仁皮不同極性提取物的DPPH自由基清除能力 DPPH自由基中由于存在多個(gè)吸電子的-NO2和苯環(huán)的大π鍵,所以氮自由基能穩(wěn)定存在。DPPH自由基的無水乙醇溶液呈紫色,在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,吸光度與濃度呈線性關(guān)系。向反應(yīng)體系中加入具有自由基清除效果的樣品時(shí),就可以結(jié)合或替代DPPH自由基,從而使DPPH自由基數(shù)量減少,吸光度變小,溶液顏色變淺,借此可評(píng)價(jià)樣品清除DPPH自由基的能力。

如圖3所示,核桃仁皮不同極性多酚提取物均具有清除DPPH自由基能力,且在一定濃度范圍內(nèi)DPPH自由基清除率隨各極性提取物質(zhì)量濃度上升而增加,但當(dāng)各極性提取物達(dá)到一定濃度后,對(duì)DPPH自由基的清除效果趨于平緩。以IC50為衡量指標(biāo),比較幾種不同極性提取物對(duì)DPPH自由基的清除率,半數(shù)清除率越低,表明該種物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力越強(qiáng),反之越弱,則DPPH自由基清除能力大小分別為乙酸乙酯(IC50=5.004 μg/mL)>VC(IC50=5.99 μg/mL)>水(IC50=6.745 μg/mL)>正丁醇(IC50=9.596 μg/mL)>氯仿(IC50=23.681 μg/mL)>石油醚(IC50=48.316 μg/mL)。各極性相多酚提取物清除DPPH自由基的整體效果由強(qiáng)到弱分別是 乙酸乙酯相>正丁醇相>氯仿相>石油醚相。當(dāng)VC濃度分別低于5.5與8.0 μg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除效果弱于水相與乙酸乙酯相提取物,但高于其他相提取物,當(dāng)濃度超過8 μg/mL時(shí),清除效果最好。當(dāng)濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí),各極性相提取物以及VC的清除率分別是乙酸乙酯相72.79%、水相65.32%、正丁醇相60.75%、氯仿相43.19%、石油醚相36.47%、VC83.84%。

圖3 核桃仁皮不同極性提取物對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.3 DPPH radical-scavenging activities of different polar extracts from walnut kernel pellicle

2.2.2 核桃仁皮不同極性提取物的OH自由基清除能力 利用Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生OH自由基,OH自由基極易攻擊芳環(huán)化合物產(chǎn)生羥基化合物,當(dāng)向反應(yīng)體系加入水楊酸時(shí),OH自由基與水楊酸會(huì)產(chǎn)生在510 nm處有特殊吸收的2,3-二羥基苯甲酸。如果向反應(yīng)體系中加入具有清除OH自由基能力的樣品液時(shí),就會(huì)減少反應(yīng)體系中的OH自由基,從而使有色化合物的產(chǎn)量減少,因此采用固定時(shí)間反應(yīng)法,以反應(yīng)體系在510 nm處的吸光度來反映樣品液對(duì)OH自由基的清除效果。

由圖4可知,核桃仁皮不同極性多酚提取物均具有清除OH自由基能力,在200～1000 μg/mL的濃度范圍內(nèi),OH自由基清除率隨質(zhì)量濃度增加而升高。四種極性相多酚提取物清除OH自由基的整體效果順序?yàn)檎〈枷?乙酸乙酯相>氯仿相>石油醚相。以IC50為衡量指標(biāo),各極性提取物清除OH自由基的能力分別是VC(IC50=190.02 μg/mL)>正丁醇相(IC50=393.578 μg/mL)>乙酸乙酯相(IC50=510.186 μg/mL)>水相(IC50=603.429 μg/mL)>氯仿相(IC50=627.003 μg/mL)>石油醚(IC50=840.315 μg/mL),其中氯仿相與水相的IC50相近。在200～1000 μg/mL范圍內(nèi)氯仿相與水相內(nèi)的抗氧化物質(zhì)對(duì)OH自由基的清除能力相當(dāng),同等濃度下的石油醚相提取物的抗氧化物質(zhì)對(duì)OH自由基的清除效果低于其他溶劑提取物,正丁醇相提取物在濃度超過400 μg/mL時(shí),對(duì)OH自由基的清除效果明顯增加。當(dāng)濃度達(dá)到1000 μg/mL時(shí),VC、正丁醇相、乙酸乙酯相、水相、氯仿相、石油醚相提取物對(duì)OH自由基的清除率分別為99.49%、74.2%、72.31%、65.55%、56.75%、53.96%。

圖4 核桃仁皮不同極性提取物對(duì)OH自由基清除效果Fig.4 OH radical-scavenging activities of different polar extracts from walnut kernel pellicle

2.2.3 核桃仁皮不同極性提取物的鐵離子還原能力 樣品本身是一種抗氧化劑,能使鐵氰化鉀的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵(亞鐵氰化鉀),二價(jià)鐵(亞鐵氰化鉀)進(jìn)一步再和三氯化鐵反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(lán)(Fe4[Fe(CN)6]3),因此測(cè)定700 nm處吸光度的高低可以間接反映樣品還原能力的大小,吸光度越大,還原能力越強(qiáng)。

由圖5可知,不同極性提取物均具有一定的還原鐵離子的能力,且隨著濃度的增加,體系吸光值越大,基本成線性關(guān)系,各極性相提取物濃度越高,鐵離子還原力越強(qiáng)。在同等濃度下乙酸乙酯相提取物的鐵離子還原能力最高,其次為正丁醇相與氯仿相提取物,石油醚相提取物最低,且在整個(gè)濃度范圍VC對(duì)鐵離子的還原能力與乙酸乙酯相提取物的還原能力相近,正丁醇相、水相、氯仿相對(duì)鐵離子還原能力相近。當(dāng)濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),各抗氧化劑的吸光度分別為VC=0.913、乙酸乙酯相=0.821、正丁醇相=0.509、水相=0.443、氯仿相=0.406、石油醚相=0.142?？傮w鐵離子還原能力的大小順序依次為VC、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相、氯仿相、石油醚相,這與清除DPPH自由基能力的順序一致。

圖5 核桃仁皮不同極性提取物的鐵離子還原能力Fig.5 The iron ion reduction ability of different polar extracts from walnut kernel pellicle

2.2.4 核桃仁皮不同極性提取物的ABTS自由基清除能力 ABTS自由基與過硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+·,向反應(yīng)體系中加入樣品液,則樣品液中的抗氧化物質(zhì)會(huì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng),而使反應(yīng)體系褪色,通過測(cè)定反應(yīng)體系在734 nm處吸光度來反映樣品液清除ABTS自由基的能力。

由圖6可知,不同極性溶劑提取物清除ABTS自由基的能力具有差異性,且隨各極性提取物質(zhì)量濃度升高而升高,清除力由強(qiáng)到弱依次是乙酸乙酯相、VC、正丁醇相、水相、氯仿相、石油醚相,這與不同極性溶劑對(duì)核桃仁皮多酚提取效果有很大關(guān)系,乙酸乙酯相提取物清除ABTS自由基的能力稍高于VC,遠(yuǎn)高于其他溶劑提取物,氯仿相與石油醚相提取物對(duì)ABTS自由基清除率相當(dāng)。當(dāng)對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)到50%時(shí),各極性提取物的IC50分別為VC=50.166 μg/mL、乙酸乙酯相=29.654 μg/mL、正丁醇相=62.719 μg/mL、水相=79.575 μg/mL、氯仿相=144.475 μg/mL、石油醚相=146.424 μg/mL。

圖6 核桃仁皮不同極性提取物對(duì)ABTS自由基清除效果Fig.6 ABTS radical-scavenging activities of different polar extracts from walnut kernel pellicle

3 結(jié)論

采用溶劑萃取法得到不同極性提取相中的多酚含量有較大差異,其提取多酚的能力依次為乙酸乙酯>正丁醇>氯仿>石油醚,表明核桃仁皮中強(qiáng)極性多酚含量高于弱極性多酚含量。

通過對(duì)不同極性提取物的體外抗氧化活性分析表明:不同極性提取物在不同反應(yīng)體系中對(duì)自由基的清除能力有差別,這可能與不同極性溶劑提取物中起到抗氧化作用的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有一定關(guān)系。其總體抗氧化能力乙酸乙酯提取物最強(qiáng),其次為正丁醇、氯仿提取物,石油醚提取物最低。為了更加深入的研究核桃仁皮多酚的抗氧化活性,可將核桃仁皮多酚類物質(zhì)的分離、純化與結(jié)構(gòu)鑒定作為當(dāng)前研究的重點(diǎn),以便確定抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理。

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