富硒青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶 及HepG2細胞葡萄糖消耗的影響

張 浩,李東山,譚開祥,向極釬,劉 衛(wèi),*

(1.華中科技大學生命科學與技術學院,湖北武漢 430074;2.湖北思慧生物科技有限公司,湖北恩施 445099;3.恩施州農業(yè)科學院,湖北恩施 445099)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal)Ijinskaja)又名青錢李、甜茶樹,為我國特有珍稀樹種,系雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬落葉喬木,分布于湖南、湖北、江西、貴州等地區(qū)[1]。2014年,青錢柳被批準為食品新資源,研究表明,青錢柳葉富含多糖、黃酮等代謝產物,其中,青錢柳多糖(Cyclocaryapaliurus(Batal)Ijinskaja polysaccharide,CPP)具有降血糖、降血脂等生物活性[2-4]。硒為人體必需的一種微量元素,具有降血糖、免疫調節(jié)、抗腫瘤等生物活性[5-6]。國內外有學者對灰樹花、茶樹等進行富硒處理,得到具有較好生物活性的富硒多糖[7-8]?；诖?本文在前期工作中,采用人工噴霧施加有機硒肥的方式對青錢柳進行富硒處理,得到富硒青錢柳葉[9],并提取分離得到富硒青錢柳多糖(Se-CPP)和CPP[10]。對CPP降血糖活性及作用機制的研究現(xiàn)已較多,關于Se-CPP生物活性研究目前國內外尚無文獻報道。本文主要探討了Se-CPP對α-葡萄糖苷酶活性及HepG2細胞葡萄糖消耗的影響,并與CPP、CPP添加微量硒復配物進行比較,研究結果為富硒青錢柳多糖的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒青錢柳多糖(Se-CPP)、青錢柳多糖(CPP)參考文獻[10]方法制備,檢測硒含量分別為3.30和0.11 mg/kg[11];HepG2細胞株 國家納米藥物工程技術研究中心;α-葡萄糖苷酶(19.3 U/mg)、4-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷(pNPG)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、胰島素 美國Sigma公司;阿卡波糖片 拜耳醫(yī)藥保健有限公司;亞硒酸鈉 上海天賜福生物工程有限公司;西維爾硒酵母片 牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司;胎牛血清(FBS)、青鏈霉素、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶 美國Gibco公司;DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青鏈霉素) 美國HyClone公司;鹽酸二甲雙胍腸溶片 貴州天安藥業(yè)股份有限公司;葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;其它試劑 均為國產分析純。

TU-1901型雙光束紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;BPN-150CRH型二氧化碳培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;DSZ2000X型倒置顯微鏡 重慶澳浦光電技術有限公司;318C型酶標儀 成都華衡儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1α-葡萄糖苷酶活力抑制實驗 參考文獻[12]方法,以磷酸鹽緩沖液(PBS,0.1 mol/L,pH6.8)為溶劑配制酶液(α-葡萄糖苷酶溶液,濃度為1.0 U/mL)、底物(pNPG溶液,濃度為10 mmol/L)及抑制劑(各受試樣品溶液,具體濃度見圖1)。根據(jù)Se-CPP與CPP硒含量,向CPP溶液中分別加入微量的硒酵母或亞硒酸鈉溶液(采用PBS溶液溶解配制,硒濃度為10 μg/mL),使溶液硒含量與等濃度Se-CPP相等,配制得到復配物溶液。根據(jù)文獻方法[12-13]設計抑制實驗流程如下:

取0.4 mL 酶液和0.8 mL PBS緩沖液于空白管,37 ℃預熱10 min,加入0.4 mL 37 ℃預熱(10 min)好的底物溶液,將反應體系迅速置于37 ℃水浴鍋水浴,20 min后加入1.0 mL Na2CO3溶液(濃度為0.05 mol/L)終止反應,反應體系PBS稀釋10倍后于405 nm處測定吸光度。根據(jù)上述反應程序及表1,分別向空白對照管、抑制管和背景對照管加入相應試劑進行反應。每個樣品設置3個重復,計算抑制率和半抑制濃度IC50[12]。

式中:空白管、空白對照管、抑制管、背景對照管吸光度值分別為A1、A2、A3、A4。

表1 α-葡萄糖苷酶活力抑制實驗反應體系Table 1 The reaction system of the inhibition effect on α-glucosidase

1.2.2 HepG2細胞存活率及葡萄糖消耗實驗 Se-CPP、CPP及鹽酸二甲雙胍用DMEM低糖培養(yǎng)基溶解配制成所需濃度。另向CPP溶液中加入微量硒酵母或亞硒酸鈉,使溶液硒含量與等濃度Se-CPP相等,采用孔徑為0.22 μm的水溶性濾膜,針筒過濾除菌備用。

1.2.2.1 HepG2細胞的培養(yǎng) HepG2細胞采用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱,每隔3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代。傳代3次后取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2.2 MTT實驗 取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板,調整細胞密度為5000個/孔。細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液,設置正常組、給藥組(Se-CPP、CPP、CPP+硒酵母、CPP+亞硒酸鈉)和鹽酸二甲雙胍對照組。其中,正常組每孔加入200 μL DMEM低糖培養(yǎng)基,給藥組和鹽酸二甲雙胍對照組每孔加入200 μL含藥DMEM低糖培養(yǎng)基(各組給藥濃度均分別為400、200、100 μg/mL)。培養(yǎng)24 h棄上清液,加入100 μL MTT溶液(1.0 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清液,加入150 μL二甲基亞砜振蕩混勻,15 min后測定570 nm處OD值,計算細胞存活率。

1.2.2.3 葡萄糖消耗實驗 取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板(5000個/孔)。細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液,分組及給藥同MTT實驗過程。培養(yǎng)24 h后測定上清液葡萄糖濃度(測定過程依照試劑盒說明書),計算葡萄糖消耗量(DMEM低糖培養(yǎng)基葡萄糖濃度減去上清液葡萄糖濃度)。

方法[14-15],建立胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)HepG2細胞模型。取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板(5000個/孔)。細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液,設置正常組、IR模型組、給藥組(Se-CPP、CPP、CPP+硒酵母、CPP+亞硒酸鈉)和鹽酸二甲雙胍對照組。正常組每孔加入200 μL DMEM低糖培養(yǎng)基,IR模型組、給藥組和鹽酸二甲雙胍對照組每孔加入200 μL含胰島素和葡萄糖濃度分別為2×10-6mol/L和40 mmol/L的DMEM低糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束棄去培養(yǎng)基,正常組和IR模型組每孔加入200 μL DMEM低糖培養(yǎng)基,給藥組和鹽酸二甲雙胍組每孔加入200 μL含藥DMEM低糖培養(yǎng)基(各組給藥濃度均分別為400、200、100 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束棄去培養(yǎng)基,每孔加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)18 h后采用葡萄糖氧化酶法測定上清液葡萄糖濃度,計算葡萄糖消耗量。

2 結果與分析

2.1 Se-CPP對α-葡萄糖苷酶活力的影響

α-葡萄糖苷酶分布于小腸上皮細胞刷狀邊緣處,通過催化α-1,4糖苷鍵水解來促進對蔗糖、麥芽糖等糖類的消化吸收。抑制α-葡萄糖苷酶活性可減緩葡萄糖的生成與吸收,降低糖尿病患者餐后血糖[16]。

表2 各樣品對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度Table 2 50% Inhibitory concentration of samples to α-glucosidase

表3 HepG2細胞存活率測定結果比較(n=6)Table 3 Comparing of cell viability of HepG2 cells(n=6)

注:與正常組(細胞存活率為100%)比較,*p<0.05,**p<0.01。由圖1可知,各抑制劑對α-葡萄糖苷酶活力均有較好的抑制效果且呈明顯的劑量依賴性。其中,在0.2 ～ 2.0 mg/mL濃度范圍內,Se-CPP對α-葡萄糖苷酶活力抑制效果明顯優(yōu)于CPP、CPP+硒酵母、CPP+亞硒酸鈉復配物。在0.2 ～ 4.0 mg/mL濃度范圍內,CPP添加與Se-CPP同樣硒劑量的硒酵母、亞硒酸鈉后,對α-葡萄糖苷酶抑制活性沒有明顯影響,因此,向CPP人工添加微量硒,并不能增強其對α-葡萄糖苷酶活力的抑制活性。根據(jù)各抑制劑對α-葡萄糖苷酶的IC50(如表2),確定各抑制劑抑制活性強弱順序為:Se-CPP>CPP+亞硒酸鈉>CPP>CPP+硒酵母>阿卡波糖。

圖1 樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of samples on α-glucosidase

有研究表明,α-葡萄糖苷酶抑制劑主要通過競爭性地與酶催化位點結合來抑制底物的分解,從而降低機體餐后血糖[17]。Se-CPP對α-葡萄糖苷酶抑制作用類型尚未明確,還有待研究。Se-CPP對α-葡萄糖苷酶的抑制活性明顯強于CPP,可能是因為青錢柳多糖與硒元素結合后化學結構發(fā)生變化,生物活性有所提高,其中詳細作用機制還有待后期深入研究。同時,我們前期研究發(fā)現(xiàn),Se-CPP可明顯降低糖尿病小鼠餐后血糖,效果優(yōu)于CPP,原因可能與Se-CPP具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性有關。向CPP添加與Se-CPP同樣劑量硒元素對α-葡萄糖苷酶抑制活性未見明顯變化。

2.2 Se-CPP對HepG2細胞存活率及葡萄糖消耗的影響

2.2.1 MTT實驗 由表3可知，Se-CPP各劑量組細胞存活率均低于正常組,且當Se-CPP濃度為100 μg/mL時,差異具有顯著性(p<0.05),表明Se-CPP對HepG2細胞生長具有微弱的抑制作用,HepG2細胞存活率隨Se-CPP濃度的升高有所降低,原因可能與硒的U型劑量曲線有關,當劑量過高或過低時,生物活性反而降低[18-19]。CPP、CPP+硒酵母、CPP+亞硒酸鈉各劑量組HepG2細胞存活率與正常組比較,差異無顯著性。鹽酸二甲雙胍各劑量組細胞存活率均低于正常組(p<0.01),且具有明顯的濃度依賴性,提示鹽酸二甲雙胍對HepG2細胞生長具有較強的抑制作用,此結果與相關文獻報道相符[20-21]。

2.2.2 Se-CPP對HepG2葡萄糖消耗的影響 HepG2細胞葡萄糖消耗實驗結果如表4所示,Se-CPP各劑量組均能顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗(p<0.01或p<0.05),但不具備明顯的濃度依賴性,具體原因還有待深入研究。當CPP濃度為400 μg/mL時,可顯著提高HepG2細胞葡萄糖消耗量。CPP添加微量硒酵母或亞硒酸鈉后,HepG2細胞葡萄糖消耗量有所提高,但與正常組比較差異無顯著性。陽性對照鹽酸二甲雙胍各劑量組均能顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗(p<0.01)且具有明顯的濃度依賴性。

表4 HepG2細胞及IR-HepG2 細胞葡萄糖消耗量比較(n=6)Table 4 Comparison of glucose consumption of HepG2 cells and IR-HepG2 cells(n=6)

注:與正常組比較,*p<0.05,**p<0.01;與IR模型組比較,#p<0.05,##p<0.01。 胰島素抵抗指胰島素作用的靶組織或細胞對胰島素敏感性降低,胰島素促進靶組織細胞攝取利用葡萄糖、抑制糖原水解的能力降低[22]。IR的發(fā)生機制及藥物改善IR的研究工作對于降血糖藥物篩選與作用機制研究具有重要意義。肝臟是機體攝取利用葡萄糖的重要器官,肝細胞可將葡萄糖轉化成肝糖原進行儲存,從而維持機體血糖處于正常水平[23]。HepG2細胞源于人肝胚胎瘤細胞,是一種表型與肝細胞極為相似的細胞株,保留了肝細胞的許多生物學特性,是目前應用較廣的研究IR的細胞模型。在高濃度胰島素或葡萄糖作用下,HepG2細胞表面胰島素受體數(shù)量降低,產生IR[24-25]。

采用高濃度葡萄糖和胰島素處理后,HepG2細胞葡萄糖消耗量顯著降低(p<0.05),表明IR模型建立成功。與IR模型組比較,Se-CPP各劑量組均能提高IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量,且濃度為400和200 μg/mL時差異具有顯著性(p<0.05)。CPP濃度為400和200 μg/mL時,可提高IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量,但與模型組比較,差異無顯著性(p>0.05)。CPP添加微量硒酵母或亞硒酸鈉后,對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量沒有明顯影響。鹽酸二甲雙胍濃度為400和200 μg/mL時,可顯著提高IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量(p<0.05或p<0.01)。

3 結論

本文結果表明,適宜濃度的Se-CPP可以顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性,可促進HepG2細胞對葡萄糖的攝取利用,改善HepG2細胞胰島素抵抗,效果優(yōu)于CPP。CPP添加微量硒后,對HepG2細胞和IR-HepG2細胞葡萄糖的消耗未見明顯影響。Se-CPP抑制α-葡萄糖苷酶活性及改善HepG2細胞胰島素抵抗的詳細作用機制還有待深入研究。

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