香菇多糖積累規(guī)律與特性比較

胡 靜,雷遠(yuǎn)征,譚曉妍,秦子芳,但冬梅,寧慧娟,葉彥雄,孫君社,張秀清,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.湖北裕國菇業(yè)股份有限公司,湖北隨州 441300;3.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院,北京 100125)

香菇(Lentinusedodes),屬真菌界,擔(dān)子菌綱,傘菌目,側(cè)耳科,香菇屬[1],又名香覃、花菇、香菌[2],是一種藥食兩用真菌[3],具有重要的醫(yī)學(xué)價值和經(jīng)濟(jì)價值。香菇多糖是香菇中主要的活性成分,具有抗腫瘤[4-5]、抗癌[6-7]、抗氧化[8-9]、提高人體免疫力[10]等多重功效,常作為香菇品質(zhì)評價的重要指標(biāo)。

目前香菇多采用袋料或段木進(jìn)行大規(guī)模栽培種植[11]。在適宜的管理條件下,香菇一般會出現(xiàn)4～5茬菇,但是由于基質(zhì)中營養(yǎng)成分流失、生長環(huán)境的變化等原因,常常導(dǎo)致不同茬期香菇品質(zhì)之間出現(xiàn)較大差異,限制了香菇的規(guī)范生產(chǎn)及市場發(fā)展。張小爽[12]等人分析同一產(chǎn)地不同茬期香菇的營養(yǎng)成分差異,包括水分、灰分、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸組成等,得到第三茬香菇總糖含量最高,為不同茬期香菇營養(yǎng)成分評價提供了一定的理論基礎(chǔ)。李雪丹[13]等人分析了不同茬期滑子菇中多糖、氨基酸及礦物質(zhì)等含量的差異,得到第一、二茬滑子菇的營養(yǎng)價值較好。但是在目前的研究中僅分析了不同茬期香菇多糖含量的差異,而對多糖性質(zhì)方面的分析較少。

本文以不同茬期香菇多糖為考察對象,采用熱水浸提法提取香菇多糖,通過苯酚硫酸法及凝膠滲透色譜法[14]對香菇多糖的含量和分子量進(jìn)行了測定分析,并研究了香菇多糖的抗氧化活性,以期為不同茬期香菇品質(zhì)研究及后續(xù)加工利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-3茬香菇樣品 湖北裕國菇業(yè)有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;2,2-二苯基-1-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) Sigma公司;總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院;濃硫酸、苯酚、三氯化鐵、氯仿、鄰苯三酚、抗壞血酸、水楊酸等 均為分析純試劑。

TG16-WS高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;TM-1901型雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞絨生化儀器廠;TYS-100高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司;BS200S電子天平 北京賽多利斯天平公司;DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司;KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀 安捷倫公司;DZKW-C型恒溫水浴鍋 北京中科星宇商貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 香菇多糖的制備及測定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取10.0 mg烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,用蒸餾水定容至100 mL,配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于玻璃管中,加蒸餾水補(bǔ)至體積為1.0 mL,繼續(xù)加入5%的苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL,靜置10 min后渦旋混勻,待反應(yīng)液冷卻至室溫后,于波長490 nm條件下測定其吸光度值,同時做空白對照。以葡萄糖含量(μg)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 香菇多糖的制備及含量測定 稱取0.5 g粉碎過20目篩的香菇樣品,置于50 mL離心管中,加5 mL去離子水及20 mL無水乙醇,渦旋混合均勻,100 W超聲提取30 min。提取結(jié)束后,4000 r/min離心10 min,棄去上清液,不溶物用10 mL 80%乙醇洗滌、4000 r/min離心10 min。用50 mL去離子水將不溶物轉(zhuǎn)移入圓底燒瓶,100 ℃水浴回流提取2 h,提取結(jié)束后冷卻、抽濾定容至100 mL,加入4倍體積無水乙醇,4 ℃保存過夜,于4000 r/min離心10 min,取沉淀60 ℃烘干即為香菇多糖樣品。取一定量香菇多糖樣品加水復(fù)溶,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定多糖含量[15]。

式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的樣品溶液中多糖濃度(mg/mL),V為樣品溶液體積(mL),W為樣品質(zhì)量(mg)。

1.2.2 多糖分子量的測定 采用凝膠滲透色譜法(Gel Permeation Chromatography,GPC)測定香菇多糖分子量。色譜條件為:Agilent PL aquageL-OH MIXED-M色譜柱,示差折光檢測器,流動相為0.1 mol/L的硝酸鈉溶液,流速1.0 mL/min。將不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Mw分別為180 Da、9、30、300、2000 kDa)及香菇多糖樣品分別進(jìn)行測定,以保留時間(x)為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量對數(shù)(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖樣品的分子量。

1.2.3 抗氧化能力分析 配制多糖溶液濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL,分別測定其Fe3+還原力、DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力、總抗氧化能力(T-AOC)。

1.2.3.1 Fe3+還原力的測定 分別取各濃度多糖溶液200 μL,加入0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖液500 μL、1%鐵氰化鉀溶液500 μL,混合均勻,50 ℃放置20 min,冷卻至室溫,加入10%三氯乙酸溶液500 μL,4000 r/min離心10 min,取上清液600 μL,依次加入蒸餾水600 μL和0.1%三氯化鐵120 μL,混勻,靜置10 min,以蒸餾水作為對照,在700 nm處測定吸光度值[16]。

還原力ΔA=A1-A0

式中:A1為樣品組的吸光值;A0為蒸餾水組的吸光值。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力測定 分別取各濃度多糖溶液600 μL與等體積的0. 2 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液均勻混合,暗處理30 min后,以蒸餾水為對照,測定其517 nm處吸光值[17]。

式中:A0為600 μL蒸餾水與等體積DPPH反應(yīng)后的吸光值;A1為600 μL DPPH與等體積蒸餾水反應(yīng)后的吸光值;A2為600 μL多糖提取液與等體積無水乙醇反應(yīng)后的吸光值。

1.2.3.3 羥基自由基清除率測定 在離心管中依次加入2 mg/mL硫酸亞鐵溶液105 μL,1.5 mg/mL水楊酸-乙醇溶液350 μL,各濃度多糖溶液350 μL、1%的過氧化氫350 μL,混和均勻,37 ℃保溫1 h,于526 nm處測定其吸光度值[18]。

式中:B1為樣品組吸光值;B2為無水乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液的吸光值;B0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.2.3.4 總抗氧化能力(T-AOC)測定 使用T-AOC試劑盒,向離心管中依次加入試劑一溶液0.5 mL、各濃度多糖溶液0.5 mL、試劑二溶液1.0 mL、試劑三溶液0.25 mL,渦旋混勻,37 ℃水浴30 min,隨后加入試劑四溶液0.05 mL,放置10 min,于波長520 nm處測定各管吸光度值,同時用蒸餾水做空白實(shí)驗。

式中:C0為對照組的吸光度;C1為樣品組的吸光度;C2為反應(yīng)液總量,mL;C3為取樣量,mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件對結(jié)果進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析。每組實(shí)驗至少重復(fù)3次(n≥3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茬期香菇多糖含量分析

根據(jù)得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0075x-0.0017(R2=0.9995),計算不同茬期香菇樣品中多糖含量。由圖1可知,不同茬期香菇多糖含量均在3.0% 以上,其中第一茬香菇多糖含量最高,為5.46%。多糖含量由高到低依次為:第一茬>第二茬>第三茬,且通過統(tǒng)計分析可得,第一茬香菇多糖含量與第二茬、第三茬樣品之間存在顯著差異(p<0.05)。路芳[19]等人測定了6種不同地區(qū)香菇多糖的含量,結(jié)果表明吉林黃松甸所產(chǎn)香菇的多糖含量最高,為2.01%,較低于本文香菇樣品中多糖含量。

圖1 不同茬期香菇多糖含量分析Fig.1 The content of lentinan for different batches 注:不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

2.2 不同茬期香菇多糖分子量分析

根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-1.114x+12.79(R2=0.9990),計算不同茬期香菇多糖的分子量。由表1可知,不同茬期香菇多糖為非均一成分,多糖分子量之間存在明顯差異。在組分1中,多糖分子量大小依次為第一茬>第二茬>第三茬,其中第一茬香菇多糖分子量為1018 kDa;在組分2中,多糖分子量隨著茬期呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢,第三茬香菇多糖分子量最大,為22.7 kDa。耿安靜[20]等人以香菇子實(shí)體為原料,測得不同濃度乙醇提取得到的香菇多糖分子量分別為22.67、18.69、6.01 kDa,與本文所得到的香菇多糖組分2中分子量相近。王麗芹[21]采用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)香菇菌絲體,并測定了發(fā)酵液中胞外多糖的分子量,為35.8 kDa。徐曉飛[22]等人測定了6種不同產(chǎn)地香菇多糖的分子量,得到多糖主要組分分子量均在1000 kDa左右,其中東北吉林產(chǎn)地香菇多糖分子量最高,為1653 kDa,與本文所得到的組分1分子量結(jié)果基本一致。

表1 不同茬期香菇多糖分子量Table 1 Molecular weight of lentinanfor for different batchs

2.3 不同茬期香菇多糖體外抗氧化活性分析

2.3.1 Fe3+還原力分析 Fe3+還原力是表征天然產(chǎn)物存在抗氧化活性的重要指標(biāo)。樣品的抗氧化能力與其把Fe3+還原為Fe2+的能力呈正相關(guān),還原能力越強(qiáng)則樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[23]。圖2表示不同茬期香菇多糖Fe3+還原力。由圖可知,第三茬香菇多糖Fe3+還原力高于第一茬和第二茬香菇多糖。同時隨著香菇多糖濃度的增加,其對Fe3+還原力都逐漸增強(qiáng),說明不同茬期香菇多糖對Fe3+還原力與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。但總體來說,不同茬期香菇多糖對Fe3+的還原力差別不大,3.0 mg/mL時還原力均在0.3左右。

圖2 不同茬期香菇多糖Fe3+還原力分析Fig.2 Fe3+ reduction of lentinan for different batches

2.3.2 DPPH自由基清除能力分析 DPPH自由基是少數(shù)相對穩(wěn)定的自由基之一,已被廣泛用于評價多糖等抗氧化劑的自由基清除能力[24]。不同茬期香菇多糖對DPPH自由基的清除能力如圖3所示。由圖可知,香菇多糖對DPPH自由基具有良好的清除能力,并與濃度呈正相關(guān)。但不同茬期香菇多糖的清除能力存在差異,由高到低依次為第一茬>第二茬>第三茬。多糖濃度為3.0 mg/mL時,第一茬香菇多糖的清除率顯著高于二、三茬,表明第一茬香菇多糖具有更好的轉(zhuǎn)移電子或氫原子的能力。

圖3 不同茬期香菇多糖DPPH自由基清除率分析Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of lentinan for different batches

2.3.3 OH自由基清除能力分析 OH自由基是公認(rèn)的自然界中最活潑的自由基，它可以輕易地穿過細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的生物大分子(碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA)反應(yīng),造成細(xì)胞損傷從而導(dǎo)致衰老、癌癥或其他疾病[25]。由圖4可知,濃度為3.0 mg/mL時,第二、三茬香菇多糖具有極高的OH自由基清除能力,達(dá)到95.8%和90.2%。而第一茬香菇多糖清除率最低,3.0 mg/mL時僅為49.7%。因此,從清除羥基自由基能力方面講,第二茬香菇更具有食用價值。另外,鄒林武[26]等人發(fā)現(xiàn)香菇多糖在2.5 mg/mL時可以清除80%以上的羥基自由基,表明香菇多糖在清除羥基自由基方面的應(yīng)用價值。

圖4 不同茬期香菇多糖羥基自由基清除率分析Fig.4 Hydroxyl radical scavenging capacity of lentinan for different batches

2.3.4 總抗氧化能力分析 總抗氧化能力表征了一個體系中活性大分子的總體抗氧化水平。由圖5可知,隨著多糖濃度的增加,三個茬期香菇多糖總抗氧化能力都逐漸增強(qiáng),但不同茬期間總抗氧化能力存在明顯差異,其中第三茬香菇多糖總抗氧化能力最高,濃度為3.0 mg/mL時,為1.15 U/mL。但總體來講,三個茬期香菇多糖在3.0 mg/mL時總抗氧化能力差別不大。

圖5 不同茬期香菇多糖總抗氧化活性分析Fig.5 Total antioxidant capacity of lentinan for different batches

3 結(jié)論

不同茬期香菇多糖的含量、分子量以及抗氧化能力方面均存在明顯差異。多糖含量方面,由高到低依次為第一茬>第二茬>第三茬,最高達(dá)5.46%;分子量方面,三個茬期香菇多糖均含有兩種多糖組分,且組分一呈現(xiàn)隨茬期增加分子量遞減的趨勢,組分二呈現(xiàn)分子量遞增趨勢。多糖分子量的變化對其抗氧化活性有一定影響。分析Fe3+還原力、DPPH清除率、羥基自由基清除率和總抗氧化能力四個體外抗氧化指標(biāo)發(fā)現(xiàn),第一茬香菇多糖具有較高的DPPH清除能力,第二茬香菇多糖具有極高的羥基自由基清除能力。雖然第三茬香菇多糖在Fe3+還原力和總抗氧化能力方面存在一定優(yōu)勢,但與其他兩組差別不大。因此,認(rèn)為第一茬和第二茬香菇具有更高的抗氧化作用。本研究為不同茬期香菇、香菇多糖品質(zhì)評價及應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1]Chen L F,Gong Y,Cai Y,et al. Genome sequence of the edible cultivated mushroom Lentinula edodes(Shiitake)reveals insights into lignocellulose degradation[J]. Plos One,2016,11(8):eo160336.

[2]陳文強(qiáng),喬艷明. 響應(yīng)面法在香菇液體種生產(chǎn)工藝優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(18):290-294.

[3]Zhuang H,Chen Z,Tao F,et al. Characterization of Lentinus edodes,β-glucan influencing theinvitro,starch digestibility of wheat starch gel[J]. Food Chemistry,2017,224:294-301.

[4]王彥碩,黃葉梅,劉紅梅,等. 香菇多糖抗腫瘤作用機(jī)理分析及臨床應(yīng)用探討[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生:文摘版,2016(5):221.

[5]Zhang Y,Gu M,Wang K P,et al. Structure,chain conformation and antitumor activity of a novel polysaccharide from Lentinus edodes[J]. Fitoterapia,2010,81(8):1163-1170.

[6]戴爾珣,汪步海,戴金梁,等. 香菇多糖誘導(dǎo)CIK細(xì)胞對肺癌A549細(xì)胞殺傷作用的研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥,2016,48(6):71-74.

[7]馮燕,全吉鐘,王冬旭,等. 香菇多糖抗胃癌機(jī)制研究[J]. 中國實(shí)驗診斷學(xué),2011,15(11):1829-1831.

[8]楊溢爍,曾德永,劉艷,等. 香菇多糖體內(nèi)抗氧化活性研究[J]. 中國食物與營養(yǎng),2016,22(8):72-74.

[9]You R,Wang K,Liu J,et al. A comparison study between different molecular weight polysaccharides derived from Lentinus edodes and their antioxidant activitiesinvivo[J]. Pharmaceutical Biology,2011,49(12):1298-1305.

[10]黃益麗,廖鑫凱,李清彪,等. 香菇多糖的生物活性[J]. 生命的化學(xué),2001,21(5):371-373

[11]吳學(xué)謙,汪奎宏,朱光權(quán),等. 香菇節(jié)木栽培基質(zhì)生物降解規(guī)律的研究[J]. 中國食用菌,2002,21(4):13-16.

[12]張小爽,徐曉飛,張丙青,等. 不同潮期香菇營養(yǎng)成分的比較研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2012,28(6):691-694.

[13]李雪丹. 滑子菇不同茬期營養(yǎng)成分的測定及其多糖的提取純化研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[14]耿安靜,陳健,徐曉飛. GPC法測定香菇多糖的含量及相對分子質(zhì)量[J]. 現(xiàn)代食品科技,2009,25(4):458-460.

[15]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. NY/T 1676-2008 食用菌中粗多糖含量的測定[S]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008.

[16]宋思圓,蘇平,王麗娟,等. 響應(yīng)面實(shí)驗優(yōu)化超聲提取黃秋葵花果膠多糖工藝及其體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué),2017,38(2):283-289.

[17]Nagarajan K,Singh S,Taleuzzaman,et al. Assessment of anti-oxidant potency of small chain glycopeptides using DPPH free

radical scavenging assay[J]. Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences,2012,2(2):178-190.

[18]盧化,張義生,郭勝男,等. 銀木總黃酮體外抗氧化活性研究[J]. 中國藥師,2015(4):555-557.

[19]路芳,王秋香,王月珍. 不同產(chǎn)地香菇中多糖及嘌呤含量情況比較研究[J]. 黑龍江科技信息,2013(7):79.

[20]耿安靜. 香菇多糖的制備、結(jié)構(gòu)特性和生物活性的研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2010.

[21]王麗芹. 香菇SD-08菌株多糖及其降解產(chǎn)物的提取、結(jié)構(gòu)及抗氧化抗衰老活性研究[D]. 泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[22]徐曉飛,張丙青,羅珍,等. 不同產(chǎn)地香菇營養(yǎng)成分的比較研究[J]. 食用菌,2012(2):57-59.

[23]Gao J,Zhang T,Jin Z Y,et al. Structural characterisation,physicochemical properties and antioxidant activity of polysaccharide from Lilium lancifolium Thunb[J]. Food Chemistry,2015,169:430-438.

[24]Song H F,Zhang Q B,Zhang Z S,et al.Invitroantioxidant activity of polysaccharides extracted from Bryopsis plumosa[J]. Carbohydrate Polymers,2010,80(4):1057-1061.

[25]Cheng Z,Zhang Y,Song H,et al. Extraction optimization,characterization and antioxidant activity of polysaccharide from Gentiana scabra bge[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016,93:369.

[26]鄒林武,趙謀明,游麗君. 香菇多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(19):177-182.